Struktura i funkcje biologiczne pełnione przez białko Hfq

Białko Hfq z E. coli (ang. host factor required for phage Q

β

RNA replication) zwane też HF-1 (ang. host factor 1) zostało zidentyfikowane pod koniec lat 60-tych, jako endogenne bakteryjne białko, które wraz z rybosomalnym białkiem S1 bierze udział w replikacji RNA bakteriofaga Qβ. U E. coli białko to zawiera 102 reszty aminokwasowe, a jego masa wynosi 11,2 kDa (108-110). Analizy filogenetyczne pokazały, że ortologi Hfq występują w połowie sekwencjonowanych gram-dodatnich oraz gram-ujemnych bakterii, przy czym część z nich koduje więcej niż jeden gen hfq (111, 112). Białka należące do rodziny Hfq są termostabilne, ich aktywną formą jest homoheksamer, a wielkość monomeru waha się pomiędzy 70 a 110 resztami aminokwasowymi. U E. coli białko występuje w liczbie około 10 tysięcy heksamerów na komórkę. Z tego 80-90% zidentyfikowano we frakcji cytoplazmatycznej zasocjowane z rybosomami (113). Badania wskazują, że białko to wiąże RNA wykazując preferencje do sekwencji poli(A) oraz fragmentów jednoniciowych bogatych w reszty adenozyny i urydyny zwykle otoczonych z końca 5’ lub 3’ fragmentem heliakalnym, jednakże nie wykazując specyficzności sekwencyjnej (101, 114-116). Pozostała część Hfq występuje w formie zasocjowanej z nukleoidem (117, 118). Badania komórek pozbawionych genu kodującego hfq pokazały plejotropowy wpływ tego białka na funkcjonowanie komórki. Hfq jest regulatorem pełniącym bardzo zróżnicowane funkcje w komórce, zdolnym do oddziaływania z różnymi cząsteczkami, a konsekwencją jego niedoboru jest zmiana profilu ekspresji wielu białek (119).

Jak dotąd nie udało się rozwiązać struktury krystalicznej białka Hfq o wysokiej rozdzielczości. Opublikowano struktury pochodzące z trzech organizmów bakteryjnych: z Staphylococcus aureus (120), z E. coli (forma skrócona zawierająca reszty aminokwasowie od 1 do 72) (121) oraz Pseudomonas aeruginosa (122), a także jedyną strukturę kompleksu Hfq/RNA. Jest to struktura Hfq S. aureus ze związanym heptaoligonukleotydem AU₅G (120). A także jedną strukturę kompleksu Hfq (forma skrócona)/poliA15 z E. coli (123). Hfq zaliczono do rodziny białek Sm i Sm-podobnych (ang. Sm-like). Białka te zidentyfikowano u eukariotów oraz archeonów. Biorą one udział w dojrzewania oraz degradacji mRNA. Charakteryzują się dwoma wysoce konserwatywnymi rejonami zwanymi Sm1 i Sm2 oddzielonymi od siebie regionem o zmiennej długości i sekwencji (124-127). Chociaż białka Hfq nie wykazują homologii sekwencyjnej w obrębie motywu Sm2 (mają jednak inny rejon bogaty w reszty hydrofobowe, który może być jego odpowiednikiem) zostały zaliczone do tej rodziny ze względu na homologię w rejonie Sm1, preferencje w wiązaniu sekwencji bogatych w A i U oraz podobieństwo strukturalne. Podobieństwo to polega na tworzeniu homoheksamerycznego pierścienia o wymiarach podobnych do heksametrycznych i heptametrycznych pierścieni tworzonych przez białka Sm i Sm-podobne (101, 111, 114).

Homoheksameryczny pierścień Hfq E. coli ma średnicę ok. 70Å i grubość 28Å (101, 121). Zbadane struktury monomerów Hfq, podobnie jak białka Sm, zbudowane są z N-końcowej helisy α, po której następuje pięć harmonijek β. W skład motywu Sm1 wchodzą trzy pierwsze harmonijki β, podczas gdy motyw Sm2 tworzą czwarta i piąta. Tworzenie heksameru inicjowane jest przez oddziaływania pomiędzy resztami aminokwasowymi wchodzącymi w skład harmonijki β4 jednej podjednostki a resztami aminokwasowymi wchodzącymi w skład harmonijki β5 sąsiedniej podjednostki. Helisa α ułożona jest od strony zwanej dystalną (121). Strukturę heksameru przedstawiono na rysunku 9.

Rysunek 9. (A) Struktura białka Hfq z E. coli. Kolorem niebieskim zaznaczono harmonijki β wchodzące w skład monomeru, a różowym N-końcową helisę α. (B) Schemat oddziaływań wodorowych pomiędzy aminokwasami wchodzącymi w skład sąsiednich podjednostek (121).

Badania krystalograficzne kompleksu Hfq z heptarybonukleotydem z S. aureus pokazały, że wiąże się on do białka od strony proksymalnej, układając się koliście wokół szczeliny pierścienia (120). Badania mutantów punktowych Hfq z E. coli wykazały, że białko to posiada zdolność wiązania RNA na obydwu powierzchniach: dystalnej oraz proksymalnej, nazywanej też powierzchnią L4, jednakże specyfika wiązania na tych powierzchniach jest różna. Jedno z regulatorowych RNA, a mianowicie DsrA RNA, zgodnie z wcześniejszymi badaniami dla S. aureus, wiązane jest najprawdopodobniej do wewnętrznej krawędzi pierścienia, w której znajduje się sześć potencjalnych miejsc wiązania nukleotydów oraz do reszt aminokwasowych R16 i F39 zlokalizowanych na powierzchni proksymalnej. Poli(A) oddziałuje z powierzchnią dystalną, a w oddziaływania te zaangażowane są m. in. reszty Y25, I30 oraz K31 (90, 123, 128). Powierzchnia dystalna może być także zaangażowana w wiązania sekwencji poli(A) w DNA, jak również odgrywać rolę w replikacji RNA bakteriofaga Qβ (129). Analizy mutacyjne sugerują, że mRNA mogą oddziaływać z obydwoma powierzchniami jednocześnie (90). Badania z wykorzystaniem mutanta

pozbawionego 37 C-końcowych reszt aminokwasowych wskazują jednak na rolę końca C Hfq w oddziaływaniu z mRNA. Sugerują ten konformacyjnie labilny rejon jako trzecią powierzchnię oddziaływania, specyficzną dla mRNA (130). Charakter oddziaływania Hfq z różnymi RNA wydaje się być dużo bardziej skomplikowany, gdyż na przykład dla RprA RNA odkryto, że w oddziaływaniu z tym sRNA bierze udział zarówno powierzchnia proksymalna jak i dystalna. W związku z tym, w przeciwieństwie do eksperymentów z DsrA RNA, dodanie do kompleksu RprA/Hfq oligonukleotydu poli(A) nie skutkuje powstaniem trójskładnikowego kompleksu tylko wyparciem RprA RNA z kompleksu (96). Hfq poprzez oddziaływanie z RNA bierze udział w regulacji ekspresji wielu genów. Jednak, jaka jest dokładna rola Hfq w oddziaływaniach pomiędzy sRNA i mRNA nie jest do końca zrozumiałe. Jeden z modeli zakłada, że Hfq pełni rolę stymulatora zwiększającego lokalne stężenie obu RNA ułatwiającego zbliżenie i umożliwiającego oddziaływania sRNA z docelowym mRNA. Zjawisko to zaobserwowano dla kompleksu OxyS/fhlA mRNA czy Spot42/galK mRNA (101, 114). Inne badania pokazują, że Hfq wiążąc się z mRNA powoduje zmianę jego struktury i wyeksponowanie nukleotydów niezbędnych do oddziaływania z sRNA. Tak jest w przypadku sodB mRNA, który jest celem działania RyhB sRNA (115). Istnieją także badania, które sugerują, że związanie Hfq może nieznacznie wpływać na zmianę struktury sRNA (101). Inne obserwacje pokazują też, że związanie Hfq do wielu sRNA takich, jak DsrA czy RyhB zapewnia im ochronę przed trawieniem RNazą E. Ochrona ta wynika z faktu wiązania się Hfq w miejscach rozpoznawanych przez RNazę E, tak więc związanie Hfq uniemożliwia nukleazie dostęp do miejsca cięcia (131).

Poza rolą w regulacji translacji z udziałem sRNA Hfq pełni też inne role w komórce. Jedną z nich jest modulacja degradacji niektórych mRNA. Wykazano, że Hfq wiąże się do ogona poli(A) oraz rejonu bogatego w U w obrębie rpsO mRNA, które koduje białko rybosomalne S15. Hfq stymuluje poliadenylację rpsO mRNA przez PAP I, a zarazem paradoksalnie chroni je przed enzymami zaangażowanymi w degradacją mRNA, takimi jak: PNPaza, RNaza II czy RNaza E (132-135).

Hfq posiada również zdolność autoregulacji na poziomie translacyjnym poprzez wiązanie się do hfq mRNA. Skutkuje to inhibicją tworzenia się kompleksu inicjatorowego i uniemożliwia rozpoczęcie translacji (136).

Wykazano również oddziaływanie Hfq z różnymi tRNA i jego udział w biogenezie tej cząsteczki. Badania wskazują, że Hfq wiążąc się z tRNA stymuluje aktywność nukleotydylotransferazy dodającej sekwencję CCA do końca 3’ tego RNA (137). Inne badania pokazują wiązanie Hfq w dwóch niezależnych rejonach tRNA - trzonie pętli TΨC

oraz trzonie pętli D sugerując, że Hfq jest niezbędne dla poprawnej modyfikacji tRNA (138). Interesujące, że rejony te wykazują niską konserwatywność sekwencyjną pomiędzy różnymi tRNA i nie są jednoniciowymi fragmentami bogatymi w A i U. Ponadto w oddziaływaniach z nimi bierze udział powierzchnia proksymalna, czyli ta sama co w przypadku oddziaływań z sRNA. Sugeruje to, że w oddziaływaniach pomiędzy Hfq a różnymi RNA najistotniejszą rolę odgrywa struktura przestrzenna obu biomolekuł.

Ponadto poza oddziaływaniem z kwasami nukleinowymi Hfq może wiązać się różnymi białkami. W niektórych przypadkach są to bezpośrednie oddziaływania, natomiast w innych Hfq występuje, jako składnik dużego rybonukleoproteinowego kompleksu. W związku z rolą Hfq w dodawaniu ogona poli(A) do mRNA sugeruje się, że w tym procesie Hfq nie tylko oddziałuje z mRNA, ale również z PAP I (139). Wykazano również bezpośrednie oddziaływanie Hfq z C-końcowym fragmentem RNazy E i jego rolę w inicjowanej przez SgrS oraz RyhB sRNA, degradacji docelowych mRNA z udziałem tego enzymu (140).

Interesującą jest obserwacja in vitro, pokazująca, że Hfq może tworzyć helikalne włókna. Każde włókno zbudowane jest z 36 podjednostek Hfq tworząc heksamer zbudowany z homoheksamerów Hfq (141). Tworzenie się włókien, aczkolwiek inaczej zbudowanych, zaobserwowano wcześniej dla pochodzących z archeonów białek Sm-podobnych (142). W przypadku Hfq tworzenie się włókien zaobserwowano w wyższym niż fizjologiczne pH oraz niższych warunkach jonowych. Funkcja tych struktur nie została jeszcze poznana (141).

Inną niewyjaśnioną funkcją białko Hfq jest jego aktywność ATPazowa. Jak dotąd dowiedziono, że związanie ATP do kompleksu Hfq/RNA skutkuje jego destabilizacją. Mogłoby to sugerować rolę ATP w zmianach strukturalnych RNA zachodzącym w obecności Hfq. Analizy mutacyjne wskazują Y25 zlokalizowaną na powierzchni proksymalnej białka jako resztę aminokwasową istotną w oddziaływaniu z ATP oraz hydrolizie tej cząsteczki (143).

W dokumencie Frątczak Agata rozprawa doktorska (Stron 35-39)