Celem pracy doktorskiej była optymalizacja oraz wykazanie możliwości, jakie daje opracowana w Pracowni Chemii RNA Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN nowa metoda mapowania mikromacierzowego do badania struktury drugorzędowej RNA.
Jako modelowe do badań wybrano dwa regulatorowe RNA z E. coli DsrA RNA oraz OxyS RNA. Zdecydowano się na wybór właśnie tych cząsteczek ze względu na optymalną do planowanych badań długość (około 100 nukleotydów) oraz ich zdolność do oddziaływania z innymi RNA oraz białkiem Hfq. W toku badań opisanych w pracy doktorskiej wykorzystywano mikromacierze izoenergetyczne do określenia struktury drugorzędowej OxyS RNA i DsrA RNA. Analizowano również użyteczność nowej metody do badania struktury obu RNA w kompleksie z białkiem opiekuńczym Hfq oraz w kompleksie z fragmentami docelowych mRNA rpoS oraz fhlA, a także w kompleksie zawierającym zarówno fragment mRNA, jak i białko Hfq.
Prace rozpoczęto od przygotowania liczącej 855 sond biblioteki izoenergetycznych pentanukleotydów. W kolejnym etapie dobrano odpowiednie warunki drukowania sond. Po dopracowaniu szczegółów technicznych przygotowywania mikromacierzy rozpoczęto badania struktury obu regulatorowych RNA, jak również będących w kompleksach, z
wykorzystaniem do tego celu w pierwszej kolejności metody mapowania
mikromacierzowego.
Uzyskane wyniki można podsumować w następujących punktach:
1. Przeprowadzone badania z wykorzystaniem mapowania mikromacierzowego doprowadziły do zaproponowania nowej struktury drugorzędowej DsrA RNA. Struktura ta wsparta jest także wynikami mapowania chemicznego. Rozważano także alternatywne sposoby pofałdowania się tego RNA. Są one w zgodne z wynikami mapowania mikromacierzowego i chemicznego, a ich trwałość termodynamiczna wynikałaby ze stabilizujących warstwowych oddziaływań współosiowych budujących je fragmentów helikalnych oraz oddziaływań występujących w pętlach wieloramiennych. W przypadku struktury OxyS RNA mapowania mikromacierzowe oraz chemiczne potwierdziły istnienie wcześniej zaproponowanej struktury drugorzędowej, w obrębie której występuje 27 nukleotydowy rejon jednoniciowy.
2. Wykazano, że proponowana struktura drugorzędowa DsrA RNA oraz jej alternatywne formy, jak również struktura OxyS RNA są zgodne z wynikami mapowania mikromacierzowego oddzielnych motywów strukturalnych zawartych w badanej cząsteczce. Jakkolwiek w każdym z badanych przypadków wiązanie się sond oligonukleotydowych do izolowanych motywów strukturalnych wykazywało ich większą dostępność do hybrydyzacji, niż wówczas, gdy występowały w całej cząsteczce. Szczególnie wyraźnie zależność tą obserwowano dla stabilnych struktur spinkowych, w przypadku których, gdy występowały w całej cząsteczce, nie odnotowano wiązania sond do dwuniciowych trzonów, natomiast obserwowano je w obrębie pętli. Otrzymane wyniki sugerują istnienie oddziaływań stabilizujących strukturę drugorzędową, być może nawet oddziaływań trzeciorzędowych, które nie występują w izolowanych motywach strukturalnych.
3. Wykazano, że hybrydyzowanie określonych oligonukleotydów to wybranych rejonów badanego RNA jest użyteczne w określeniu jego struktury drugorzędowej. Ponadto, jest to prosty sposób identyfikacji alternatywnych miejsc wiązania się sond, jak również dostarcza informacji o możliwych oddziaływania wyższego rzędu w obrębie badanego RNA.
4. Przeprowadzając mapowanie chemiczne DsrA RNA oraz OxyS RNA, które miało za zadanie potwierdzenie wyników nowatorskiej metody mapowania mikromacierzowego, wykorzystano chimeryczne startery DNA-LNA. Ten nowy typ starterów wykazuje ogromną przewagę nad tradycyjnymi starterami DNA. Są one szczególnie użyteczne, gdy konieczne jest zhybrydyzowanie startera w rejonie RNA zawierającym stabilny termodynamicznie element struktury drugorzędowej. Użycie chimerycznych LNA-DNA oligonukleotydów zamiast starterów DNA sprawia, że termodynamicznie stabilniejsze, niż istniejąca struktura drugorzędowa RNA, stają się dupleksy tworzone przez starter i komplementarny fragment badanego RNA. Dzięki zastosowaniu modyfikowanych starterów możliwe było przeprowadzanie odwrotnej transkrypcji, co pozwoliło na wizualizację eksperymentu mapowania chemicznego obu badanych regulatorowych RNA.
5. Testowano użyteczność metody mapowania mikromacierzowego do badania kompleksów RNA/białko. Badania przeprowadzono dla kompleksów DsrA RNA/Hfq oraz OxyS RNA/Hfq. Pokazano, że metodą mikromacierzową można badać strukturę RNA w kompleksie z białkiem oraz określić rejony w RNA uczestniczące w oddziaływaniu z białkiem. Dla DsrA RNA potwierdzono rejony wcześniej uznane za miejsce wiązania Hfq. Natomiast, dla OxyS RNA pokazano, że oddziaływanie z Hfq nie odbywa się w jednym zdefiniowanym jednoniciowym rejonie cząsteczki, ale ma charakter bardziej złożony.
6. Wykazano, że mapowanie mikromacierzowe jest dobrą metodą badania oddziaływań RNA/RNA. Na przykładzie kompleksu DsrA RNA/rpoS25 oraz DsrA RNA/rpoS140 z powodzeniem zastosowano mapowanie mikromacierzowe do badania RNA zaangażowanego w oddziaływania z innym RNA. Pokazano, że rejon sparowania obu cząsteczek może być nieco dłuższy od tego proponowanego w literaturze.
7. Stwierdzono, że metoda mapowania mikromacierzowego może dostarczyć również wiele informacji o strukturze komponentów i oddziaływaniach w kompleksach trójskładnikowych typu RNA/RNA/białko. Pokazano to na przykładzie kompleksu DsrA RNA/rpoS140/Hfq. Wyniki tych eksperymentów potwierdziły, że Hfq wzmacnia oddziaływanie pomiędzy obydwoma RNA a w powstałym kompleksie białko pozostaje związane z DsrA powyżej miejsca oddziaływania z rpoS.
8. Pokazano, że wydłużony w stronę 5’UTR fragment fhlA mRNA (fhlA282) oddziałuje bardziej efektywnie z OxyS RNA niż opisany wcześniej w literaturze fhlA115. Ponadto pokazano, że OxyS RNA posiada zdolność oddziaływania z rpoS mRNA, co sugeruje, że regulacja transkrypcji tego mRNA najprawdopodobniej odbywa się poprzez bezpośrednie parowanie się z nim.
Reasumując, badania opisane w przedstawionej pracy doktorskiej należy stwierdzić,
że doprowadziły one do wyraźnego poszerzenia wiedzy na temat wykorzystania
mikromacierzy izoenergetycznych do badania struktury drugorzędowej RNA oraz ich
oddziaływań trzeciorzędowych i czwartorzędowych w kompleksach dwu- i
trójskładnikowych z innymi RNA i białkami. Wykazano, że metoda mapowania mikromacierzowego cechuje się szybkością wykonania pojedynczego eksperymentu, powtarzalnością uzyskiwanych wyników oraz dużą dowolnością warunków prowadzenia badań. Możliwość szybkiego powtarzania eksperymentów ogranicza też błędy podczas ich prowadzenia. Mapowanie mikromacierzowe dostarcza też informacji o strukturze RNA, których inne metody badania nie pozwalają uzyskać. Dzięki mapowaniu mikromacierzowemu uzyskuje się dane o dostępności pewnych rejonów RNA do oddziaływań z oligonukleotydami. Jest to szczególnie ważne dla prowadzenia badań z wykorzystaniem oligonukleotydów, jako inhibitorów czy ogólniej modulatorów aktywności biologicznej badanych RNA. Ma to bezpośrednie przełożenie ma wykorzystanie oligonukleotydów jako potencjalnych terapeutyków. Metody mapowania chemicznego i enzymatycznego wykazują pod tym względem duże ograniczenia (wymogi dotyczące obecności określonych soli i wartości pH).
Pokazano też pewne ograniczenia metody mikromacierzowej takie, jak występowanie alternatywnych miejsc wiązania, możliwość występowania oddziaływań z cząsteczką, której badaniu nie jest dedykowany eksperyment, a także brak możliwości badania słabych kompleksów, jak na przykład kompleks powstały poprzez oddziaływania typu kissing loops.