Mapowanie mikromacierzowe kompleksów DsrA RNA/Hfq

Celem niniejszej pracy było przetestowanie oraz wykazanie możliwości zastosowania izoenergetycznych mikromacierzy do badania struktury drugorzędowej cząsteczek RNA. Interesujące było sprawdzenie czy metoda ta mogłaby być użyteczna do badania struktury cząsteczki RNA będącej w kompleksie z białkiem i czy daje możliwość uzyskania informacji o miejscu wiązania białka do RNA. Jeżeli przyjmie się założenie, że związanie białka powoduje zmianę strukturalną w cząsteczce RNA, których konsekwencją jest zmiana w dostępności do hybrydyzacji, wówczas byłoby to obserwowalne podczas hybrydyzacji na mikromacierzy. W drugim przypadku, w którym związanie białka nie powoduje zmian w strukturze badanego RNA, jednakże białko wiąże się w rejonie jednoniciowym, który wcześniej był dostępny do hybrydyzacji, również można byłoby to zaobserwować podczas hybrydyzacji do mikromacierzy.

Kompleks DsrA RNA/Hfq nadaje się do testowania nowej metody badania oddziaływania RNA i białka, gdyż istnieją wcześniejsze prace eksperymentalne, w których zajmowano się badaniem natury właśnie tego kompleksu (89, 90, 116, 128).

Bakteryjne białka Hfq, ze względu na duże podobieństwo strukturalne i sekwencyjne, zaliczane są do rodziny białek Sm i Sm-podobnych. Białka Sm charakteryzują się budową pierścieniową złożoną z sześciu lub siedmiu podjednostek oraz dwoma konserwatywnymi motywami Sm1 i Sm2, w obrębie, których znajdują się reszty aminokwasowe biorące udział w oddziaływaniach z RNA. Porównując różne bakteryjne homologi białka Hfq z eukariotycznymi białkami Sm obserwuje się wysokie podobieństwo w obrębie motywu Sm1. Jakkolwiek wśród białek Hfq nie obserwuje się motywu Sm2, posiadają one inny region zawierający konserwatywne hydrofobowe reszt aminokwasowe, który może być odpowiednikiem tego motywu (101, 111, 114). Dla białek Sm istnieje konserwatywna sekwencja w obrębie, której wiążą się one z RNA (PuAU4-6GPu) jest ona otoczona z obu stron strukturami typu spinki (126). Dla Hfq wykazano, że poli(U) jest w stanie konkurować o miejsce wiązania z takimi sRNA jak DsrA RNA czy OxyS RNA (101, 116), przy czym dotychczasowe badania nie pozwalają na wyznaczenie konsensusowej sekwencji. Wskazują natomiast, że w przypadku sRNA jest to sekwencja bogata w reszty A i U, natomiast w przypadku tRNA nie zaobserwowano takiej zależności (138). Uważa się, że Hfq nie wiąże się z RNA wysoką specyficznością sekwencyjną i że najprawdopodobniej istotną rolę odgrywają

tutaj uwarunkowania strukturalne. Cześć doniesień literaturowych dla OxyS RNA i DsrA RNA wskazuje, że Hfq wiąże się w rejonach jednoniciowych otoczonych strukturami spinkowymi, czyli w sposób przypominający oddziaływania białek Sm z ich docelowymi RNA. Jednakże rejon jednoniciowy nie jest jedynym miejscem oddziaływania (101, 116). Rolle i współpracownicy sugerują natomiast, że w przypadku DsrA RNA oddziaływanie ma miejsce głównie w rejonie proponowanym przez nich, jako dwuniciowy (166).

Cząsteczkę DsrA RNA wyznakowaną radioizotopowo inkubowano w buforze hybrydyzacyjnym VII z białkiem Hfq o odpowiednim stężeniu (ustalonym na podstawie elektroforezy w warunkach natywnych) w celu uzyskania całkowitego związania DsrA RNA z Hfq, według procedury opisanej w rozdziale Materiały i Metody. Następnie

przeprowadzano hybrydyzację na mikromacierzy. Każdorazowo przeprowadzano

hybrydyzację kontrolną, w której próbkę traktowano identycznie jak próbę badaną z wyjątkiem dodawania Hfq. Taka próba kontrolna była zawsze odnośnikiem, do którego porównywano wynik otrzymany dla kompleksu DsrA RNA/Hfq.

W wyniku przeprowadzonych eksperymentów dla kompleksów DsrA RNA/Hfq otrzymano profil hybrydyzacji, w którym obserwowano 3- do 7-krotne obniżenie intensywności niektórych sygnałów w stosunku do reakcji kontrolnej (Tabela 10, Rysunek 24). Nie zaobserwowano całkowitego zaniku sygnałów ani dodatkowych miejsc hybrydyzacji. Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami wskakującymi, że związanie Hfq nie powoduje zmian w strukturze drugorzędowej DsrA RNA (116). Zaobserwowano obniżenie intensywności w pozycji 14 i 15 czyli w obrębie pętli spinki I. Jest to zgodne z wynikami Lease i Woodson, którzy w obecności Hfq obserwowali obniżenie intensywności cięcia RNazą T2 w obrębie tej pętli (89). Kolejne obniżenie intensywności sygnału wystąpiło w pozycji 31, czyli w rejonie uznanym przez dwa niezależne zespoły za główne miejsce oddziaływania DsrA RNA z Hfq (89, 116). Słabszą intensywność obserwowano również w pozycjach 42 i 43 oraz 40 lub 47. Brescia i współpracownicy obserwowali w obecności Hfq zwiększoną intensywności cięcia RNazą V1 w pozycjach 42-45, co tłumaczą tym, że związanie białka powoduje sterycznie wzmocnienie dwuniciowego charakteru tego rejonu (116). Jest to zgodne z obserwacjami na mikromacierzach, które wskazywały, że bez Hfq rejon ten miał mało stabilną strukturę i był dostępny dla sond oligonukleotydowych, natomiast związanie białka Hfq na tyle wzmocniło jego strukturę, że stał się on niedostępny. Rolle i współpracownicy w rejonie 43-52 w obecności Hfq obserwowali ochronę przed hydrolizą indukowaną jonami ołowiu (166).

Tabela 10. Uśrednione wyniki hybrydyzacji dla kompleksu DsrA RNA/Hfq. pozycja w DsrA nazwa sondy sekwencja penta- lub heptameru sekwencja modyfikowanej sondy nukleotyd parujący się z dodatkowym 3'G przewidziane dG (kcal/mol) dla komplementarnego wiązania RNA-RNA przewidziane dG (kcal/mol) dla wiązania modyfikowana sonda-RNA, 100 mM NaCl wyniki hybrydyzacji dla DsrA wyniki hybrydyzacji dla DsrA/Hfq alternatywne miejsce wiązania przewidziane dG (kcal/mol) dla alternatywnego miejsca wiązania RNA-RNA przewidziane dG (kcal/mol) dla alternatywnego miejsca wiązania modyfikowana sonda-RNA, 100 mM NaCl 14 641 GGAAA GGDDDG A -2,9 -9,6 s w (7x) 42/43 -1,4 -4,0 15 161 AGGAA DGGDDG U -3,6 -10,2 s w (7x) ^{42/43 -4,4 -9,8} 31 31-7 AAAAAAU DDDDDDU -0,5 -9,7 s m (4x) 36 36-7 CACUUAA CDCUUDA -4,9 -10,1 s s 40 37 AAGCA DDGCDG G -3,4 -10,3 m m (3x) 42 131 AGAAG DGDDGG G -2,9 -9,6 s m (3x) ^{13/14 -1,1 -3,3} 43 33 AAGAA DDGDDG C -1,2 -11,4 s m (4x) ^{13/14 -0,6 -3,9} 47 37 AAGCA DDGCDG U -3,4 -10,3 m m (3x) 60 225 AUGAA DUGDDG U -1,4 -9,1 w w 74 483 CUGAG CUGDGG C -4,6 -12,2 m m ^{41/42 -2,4 -4,8}

Jako s, m i w zaznaczono sygnały hybrydyzacji odpowiednio o wysokiej, średniej i słabej intensywności. W nawiasach podano ilokrotnie następowała zmiana intensywności sygnału, w porównaniu do intensywności tego samego sygnału w reakcji kontrolnej (bez Hfq)

A B a. b. 0,0 20000,0 40000,0 60000,0 80000,0 100000,0 120000,0 140000,0 160000,0 14 15 31 36 40/47 42 43 60 74

pozycja w DsrA RNA

In te n s y w n o s ć s y g n a łu DsrA DsrA/Hfq C.

Rysunek 24. (A) Przykładowy wynik hybrydyzacji (a) DsrA RNA, (b) kompleks DsrA/Hfq. Macierz

drukowana w układzie: 4 kolumny, 4 sondy w rzędzie, każda sonda po 8 powtórzeń. (B) Wykres prezentujący uśrednione intensywności sygnałów dla poszczególnych sond (C) Proponowane struktury DsrA RNA z zaznaczonymi wynikami mapowania w kompleksie z Hfq. Kolorem czerwonym zaznaczono miejsca hybrydyzacji, dla których intensywność sygnału nie zmieniła się w porównaniu z reakcją kontrolną (sam DsrA RNA). Kolorem żółtym zaznaczono miejsca o obniżonej intensywności sygnału w obecności Hfq.

Przeprowadzone eksperymenty potwierdziły wcześniejsze doniesienia, iż w wiązaniu Hfq bierze udział nie tylko proponowana jako jednoniciowa sekwencja bogata w reszty urydyny, zlokalizowana w okolicy 30-tego nukleotydu, ale również inne rejony cząsteczki tworzące drugo- i trzeciorzędowe elementy strukturalne (89, 116).

40 15 43 42 14 31 36 74

Analizując miejsca o osłabionej intensywności sygnału wiązania się sond w obecności białka Hfq, w świetle rozpatrywanych struktur DsrA RNA (struktury 24B-4, 24B-5 i 24B-6) wydaje się, że najlepiej do dokowania białka przygotowana jest struktura 24B-4. W tym przypadku rejon środkowy DsrA RNA nie wymaga żadnych rearanżacji struktury drugorzędowej. Natomiast związanie się Hfq do struktur alternatywnych, tzn. 24B-5 i 24B-6, mogłoby wiązać się z dość rozległymi zmianami strukturalnymi rejonu środkowego. Jakkolwiek jest to rejon o niskiej stabilności termodynamicznej budujących go motywów, zatem wspomniane zmiany strukturalne nie wymagałyby dużego nakładu energetycznego.

Opisane powyżej hybrydyzacje na mikromacierzach izoenergetycznych kompleksów RNA/białko są pierwszymi tego typu eksperymentami. Nie osiągnięto wyniku, w którym obserwuje się całkowity zanik hybrydyzacji. Należało się zastanowić czy przyczyna tego tkwi w charakterze oddziaływań DsrA RNA/Hfq. Podobną zależność obserwowali także Brescia (116) oraz Lease i Woodson (89), którzy podczas trawienia nukleazami również nie obserwowali całkowitej ochrony pewnych rejonów DsrA RNA prze białko. Innym wytłumaczeniem może być możliwość oddysocjowania podczas hybrydyzacji pewnej puli białka od DsrA RNA i wówczas uwolnione DsrA RNA wiązałoby się z komplementarnymi sondami. Możliwe jest też, że Hfq związane w kompleksie z DsrA RNA ma zdolność do tworzenia trójskładnikowego kompleksu z sondą (tworząc kompleks DsrA RNA/Hfq/sonda) poprzez oddziaływanie z nią inną powierzchnią niż powierzchnia zaangażowana w oddziaływanie z DsrA. Tworzenie się trójskładnikowych kompleksów obserwowano wcześniej, w przypadku dodania poli(A) do kompleksu DsrA/Hfq (116). Należałoby również rozważyć zagrożenie błędnego odczytania wyniku hybrydyzacji wynikające z faktu, że Hfq będące w mieszaninie hybrydyzacyjnej w pewnej części w stanie wolnym mogłoby oddziaływać z sondami oligonukleotydowymi, a tym samym uniemożliwić im hybrydyzację kompleksu DsrA RNA/Hfq. W efekcie obniżenie intensywności sygnału dla danej pozycji, odczytane jako miejsce wiązania Hfq do DsrA RNA, w rzeczywistości wynikałaby z zasłonięcia tej sondy przez wolne Hfq lub DsrA RNA lub też przez kompleks trójskładnikowy za pośrednictwem Hfq, a nie z zasłonięcia w DsrA RNA przez Hfq miejsca komplementarnego do tej sondy. Choć sytuacja taka wydaje się teoretycznie możliwa, nie istnieją dane eksperymentalne mówiące o tym, aby tak krótkie i w dodatku modyfikowane oligonukleotydy mogły być wiązane przez Hfq.

Podjęto próbę częściowej odpowiedzi na te przedstawione powyżej wątpliwości. Postanowiono sprawdzić czy Hfq w ogóle jest zdolne do wiązania modyfikowanych heksa- i heptamerów. Zsyntetyzowano kilka oligonukleotydów odpowiadających wybranym sondom,

ale nie posiadających C6-aminoheksylowego łącznika na końcu 5’ (Tabela 11). W grupie tej znalazły się oligonukleotydy, dla których obserwowano obniżenie intensywności sygnału w czasie hybrydyzacji kompleksu DsrA RNA/Hfq do mikromacierzy. Ponadto, wybrano do badań oligonukleotyd 35-7, dla którego nie obserwowano wiązania się z DsrA RNA. Jest to oligonukleotyd bogaty w reszty 2,6-diaminopurynorybozydowe (analog adenozyny) i U, czyli reszty nukleotydowe, które uważa się za preferencyjnie wiązane przez Hfq. Do badań wybrano także oligonukleotyd 483 komplementarny do miejsca 74 w DsrA RNA, w przypadku, którego w czasie hybrydyzacji DsrA RNA oraz DsrA RNA/Hfq nie obserwowano różnic w intensywności sygnału hybrydyzacyjnego. Zsyntetyzowane odpowiedniki sond wyznakowano radioizotopowo na końcu 5’. Następnie przeprowadzono inkubację z Hfq w buforze hybrydyzacyjnym I, po czym przeprowadzono rozdział elektroforetyczny w warunkach niedenaturujących.

Dla sondy 35-7 nie zaobserwowano wiązania z Hfq, dla pozostałych sond zaobserwowano bardzo słabe oddziaływania widoczne w postaci „smużących się” prążków i to w przypadku zastosowania 100-krotnego molowego nadmiaru heksameru białka w stosunku do oligonukleotydu (Rysunek 25).

Tabela 11. Zestawienie modyfikowanych oligonukleotydów, które wybrano do sprawdzenia zdolność do

oddziaływania z Hfq.

pozycja w DsrA

nazwa sondy

sekwencja penta- lub heptameru sekwencja modyfikowanej sondy bez aminołącznika Oddziaływanie z Hfq 15 161 AGGAA DGGDDG słabe 31 31-7 AAAAAAU DDDDDDU słabe 35 35-7 ACUUAAA DCUUDDD brak 40 37 AAGCA DDGCDG słabe 42 131 AGAAG DGDDGG słabe 43 33 AAGAA DDGDDG słabe

74 483 CUGAG CUGDGG bardzo słabe

Można stwierdzić, że Hfq wykazuje bardzo słabe powinowactwo do modyfikowanych heksa- i heptamerów. Ponadto, należy pamiętać, że na mikromacierzy istnieje zdecydowanie mniej korzystna sytuacja, to znaczy, że stężenie białka jest nawet do 100-krotnie niższe od stężenia poszczególnych sond, a zatem jeżeli wiąże się ono z sondami to nie jest w stanie zablokować ich w takim stopniu, aby mogło to w sposób istotny uniemożliwić związanie się DsrA RNA czy kompleksu DsrA RNA/Hfq. Również sygnał pochodzący od ewentualnego trójskładnikowego kompleksu związanego z sondą poprzez białko musiałby być na poziomie niewykrywalnym lub bardzo słabym.

Rysunek 25. Analiza zdolności tworzenia się kompleksu modyfikowany oligonukleotyd/Hfq. Rozdział

prowadzono w 16% żelu poliakrylamidowym w warunkach niedenaturujących, w 4^oC.

Na podstawie badań siedmiu różnych oligonukleotydów trudno jest stwierdzić dla czego do niektórych modyfikowanych oligonukleotydów Hfq wiąże się słabo a z niektórymi nie oddziałuje w ogóle. Trudno na podstawie przetestowanej grupy wnioskować o jakiś preferencjach sekwencyjnych Hfq, szczególnie że uważa się iż Hfq raczej nie wykazuje takich preferencji. Oligonukleotydy do których wykazywało ono słabe powinowactwo bogate były w reszty 2,6-diaminopurynorybozydu (D), z wyjątkiem 483, który jednocześnie oddziaływał najsłabiej. Jednakże oligonukleotyd 35-7, do którego Hfq nie wiązało się również posiada 3 reszty D. Oligonukkeotyd 35-7 posiada w pozycji drugiej LNA-C, a oligonukleotyd 483 ma metylowane C w pierwszej pozycji. Natomiast oligonukleotyd 37 posiada 2’-O-metylowane C w środku sekwencji. Na tym etapie przeprowadzonych eksperymentów, można jedynie przypuszczać, że być może dla oddziaływań znaczące jest, aby w pierwszej lub drugiej pozycji nie występowało C.

Reasumując wykazano, że metodę mikromacierzy izoenergetycznych można stosować również do badania kompleksów RNA z białkami, nie zapominając przy tym o pewnych ograniczeniach tego podejścia. Największa niedogodność może polegać na tym, że sondy, które stanowią krótkie modyfikowane oligonukleotydy, poza zamierzonymi i w miarę przewidywalnymi oddziaływaniami z badanym RNA mogą również oddziaływać z białkiem. Oczywiście oddziaływanie to zależy od właściwości badanego białka. Wiele białek, aby mogło się związać z kwasem nukleinowym potrzebuje znacznie dłuższych fragmentów niż

pięć reszt nukleotydowych oraz zdefiniowanego otoczenia strukturalnego, a także ściśle określonych warunków buforowych. Można sobie wyobrazić, że jeżeli będzie się badać kompleksy z białkami wykazującymi dużą specyficzność sekwencyjną wówczas problem niespecyficznego oddziaływania z sondami zostaje wyeliminowany. Należy również pamiętać, że choć hybrydyzacje można przeprowadzać w szerokim spektrum warunków buforowych, to jednak należy zachować jego wysoką siłę jonową, co niekiedy może mieć znaczący wpływ na trwałość i tworzenie się kompleksów RNA/białko. Niewątpliwym plusem

metody mapowania mikromacierzowego jest szybkość wykonania pojedynczego

eksperymentu i wspomniana dowolność buforowa, na którą nie można sobie pozwolić stosując, dla przykładu, trawienie niektórymi nukleazami. Żadna z metod nie jest pozbawiona wad, dlatego też im więcej metod zastosujemy, tym otrzymany wynik będzie bardziej zbliżał nas do zrozumienia rzeczywistych złożonych relacji międzycząsteczkowych.

1.8. Mapowanie mikromacierzowe dwóch oddziałujących ze sobą RNA