Analiza wzrostu biofilmów

W pierwszym etapie przeprowadzonych badań dokonano oceny zdolności szczepów wzorcowych drobnoustrojów Staphylococcus aureus, Escherichia coli oraz Candida albicans do tworzenia biofilmu w warunkach laboratoryjnych. W tym celu wykonano posiewy ilościowe i określono zmianę liczby drobnoustrojów (CFU/ml), w czasie 24 godzin hodowli bakterii oraz 96 godzin hodowli drożdżaka C. albicans (zgodnie z metodyką opisaną w rozdziale 3.2.1). Na rysunku 9 przedstawiono krzywą wzrostu biofilmu utworzonego przez gronkowca złocistego Staphylococcus aureus.

Rys. 9 Krzywa wzrostu biofilmu S. aureus w czasie 24 h hodowli.

Na podstawie analizy krzywej wzrostu gronkowca złocistego S. aureus stwierdzono, że od 2 do 8 godziny hodowli następował wykładniczy wzrost liczby komórek. Faza stacjonarna rozpoczynała się ok. 8 h hodowli, przy gęstości komórek 4,28 × 10⁷ CFU/ml.

Osiągnięte plateau utrzymywało się do 24 h hodowli (Rys. 9).

Na rysunku 10 przedstawiono krzywą wzrostu biofilmu, utworzonego przez Escherichia coli w czasie 24 h.

76

Rys. 10 Krzywa wzrostu biofilmu dla E. coli w czasie 24 h hodowli.

Na podstawie analizy rysunku 10 stwierdzono, że wzrost liczby bakterii od momentu rozpoczęcia hodowli do 16 h był wykładniczy. Maksymalna liczba komórek – 4,69 × 10⁹ CFU/ml została osiągnięta w 16 godzinie hodowli. Liczba bakterii do 24 godziny prowadzenia kultury utrzymywała się na stałym poziomie. (Rys. 10).

Na rysunku 11 przedstawioną krzywą wzrostu biofilmu Candida albicans w czasie 96 h hodowli.

77 Rys. 11 Krzywa wzrostu C. albicans w czasie 96 h hodowli.

Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że faza wykładniczego wzrostu C. albicans trwała od momentu rozpoczęcia hodowli do 24 godziny jej trwania. Plateau na poziomie 5,7 × 10⁵ CFU/ml zostało osiągnięte na początku fazy stacjonarnej tj. ok. 48 godziny hodowli (Rys. 11).

W następnym kroku dokonano analizy ilości tworzonej biomasy biofilmów z wykorzystaniem barwienia z użyciem fioletu krystalicznego CV (rozdział 3.2.2). Badanie przeprowadzono w standardowych pożywkach – stosowanej do hodowli drobnoustrojów (BHI) oraz pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 10% surowicy płodowej, stosowanej FBS do hodowli fibroblastów. Wszystkie analizowane szczepy były producentami biofilmu. Na rysunkach 12 – 14 przedstawiono dynamikę wzrostu biofilmów testowanych mikroorganizmów: S. aureus (Rys. 12), E. coli (Rys. 13) i C. albicans (Rys. 14).

78

Rys. 12 Dynamika wzrostu biomasy biofilmu S. aureus badana z wykorzystaniem metody barwienia fioletem krystalicznym (absorbancja przy długości fali λ = 580 nm) w czasie 24 h hodowli, w dwóch różnych pożywkach BHI i RPMI 1640 z dodatkiem 10% surowicy (na rysunku RPMI).

Rys. 13 Dynamika wzrostu biomasy biofilmu E. coli badana z wykorzystaniem metody barwienia fioletem krystalicznym (absorbancja przy długości fali λ = 580 nm) w czasie 24 h hodowli, w dwóch różnych pożywkach BHI i RPMI 1640 z dodatkiem 10% surowicy (na rysunku RPMI).

79

Rys. 14 Dynamika wzrostu biomasy biofilmu C. albicans badana z wykorzystaniem metody barwienia fioletem krystalicznym (absorbancja przy długości fali λ = 580 nm) w czasie 24 h hodowli w dwóch różnych pożywkach BHI i RPMI 1640 z dodatkiem 10% surowicy (na rysunku RPMI).

Na podstawie porównania wzrostu biofilmów S. aureus i E. coli w obu testowanych podłożach (BHI i RPMI 1640 z dodatkiem 10% surowicy) nie odnotowano istotnych zmian w dynamice wzrostu biomasy (rys. 12 i 14). Największy wzrost absorbcji przy długości fali λ = 580 nm nastąpił między 6 a 12 h hodowli.

Analizę dynamiki wzrostu biomasy biofilmowej C. albicans prowadzono przez 96 h, ze względu na specyfikę wzrostu tego drożdżaka Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że badany szczep C. albicans w pożywce RPMI 1640 tworzył większą ilość biofilmu niż w pożywce Sabourauda w 6 i 48 h hodowli. (Rys. 14). Maksimum formowania biofilmu w pożywce Sabourauda przypadało na 24 h, a w pożywce RPMI 1640 – na 16 h hodowli.

80

W kolejnym etapie badań określono aktywność metaboliczną biofilmów tworzonych przez drobnoustroje w oparciu o metodę redukcji bezbarwnego chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego TTC (rozdział 3.2.3) w pożywkach BHI i RPMI 1640, suplementowanej 10% bydlęcą surowicą płodową (FBS) w czasie 24 h hodowli. Na rysunkach 15 i 16 przedstawiono wyniki uzyskane odpowiednio dla gronkowca S. aureus i pałeczki okrężnicy E. coli.

Rys. 15 Aktywność metaboliczna biofilmu S. aureus określona metodą TTC (absorbancja przy długości fali λ = 495 nm) w czasie 24 h hodowli w pożywkach BHI i RPMI 1640 z dodatkiem 10%

FBS (na rysunku RPMI).

Na podstawie analizy rysunku 15 stwierdzono, że aktywność metaboliczna biofilmu S. aureus w pożywkach BHI i RPMI 1640) była wysoka w czasie pierwszych 20 h jego tworzenia (Rys. 15.). Było to związane z intensywnym namnażaniem się gronkowca i wzrostem liczby komórek oraz biomasy określanej metodą barwienia fioletem krystalicznym (Rys. 9 i 10). Jednak po 20 godzinach hodowli aktywność ta spadała, zwłaszcza w pożywce RPMI 1640 –pomimo utrzymującej się wysokiej gęstości komórek gronkowca (Rys. 9).

81

Rys. 16 Aktywność metaboliczna biofilmu E. coli określona metodą TTC (absorbancja przy długości fali λ = 495 nm) w czasie 24 h w pożywkach BHI i RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS (na rysunku RPMI).

Na podstawie analizy rysunku 16 stwierdzono, że aktywność metaboliczna biofilmu E. coli, w czasie 24 godzinnej hodowli, była niższa na pożywce RPMI z dodatkiem 10%

FBS (Rys. 16). Ponadto na tym podłożu obserwowano większe fluktuacje zdolności komórek do redukcji TTC. Największą aktywność metaboliczną biofilmu E. coli stwierdzono w 20 h hodowli na pożywce BHI i w 6 h hodowli na pożywce RPMI (Rys.

16).

Różnice pomiędzy wysoką biomasą biofilmów gronkowca i pałeczki okrężnicy na pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS (Rys. 10 i 11) i niską aktywnością metaboliczną biofilmów po 24 h hodowli (Rys. 15 i 16), można wytłumaczyć zmianami aktywności enzymatycznej, zachodzącymi w komórkach bakterii w dojrzałych biofilmach.

Komórki w pełni ukształtowanym biofilmie mając ograniczony dostęp do tlenu i składników odżywczych, co skutkuje obniżeniem tempa wzrostu i przejściem w stan zbliżony do anabiozy – odwracalnego, przejściowego stanu skrajnego obniżenia aktywności życiowej (tzw. „pozornej śmierci”).

Na rysunku 17 przedstawiono aktywność metaboliczną biofilmów tworzonych przez drożdżaka Candida albicans, określoną w oparciu o metodę TTC w pożywkach Sabouraud i RPMI 1640 z dodatkiem 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS) w czasie 48 godzin hodowli.

82

Rys. 17 Aktywność metaboliczna biofilmu C. albicans określona metodą TTC (absorbancja przy długości fali λ = 495 nm) w czasie 48 h hodowli w pożywkach BHI i RPMI 1640 z dodatkiem 10%

FBS (na rysunku RPMI).

Na podstawie analizy rysunku 17 stwierdzono, że aktywność metaboliczna biofilmów C. albicans była znacznie niższa w porównaniu z biofilmami bakteryjnymi.

Najwyższą aktywność metaboliczną stwierdzono w 12 h hodowli na pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS. Biofilmy C. albicans w pożywce BHI posiadały największą aktywność metaboliczną w 24 h hodowli (Rys. 17). Podobnie jak w przypadku bakterii potwierdzono, że niska aktywność metaboliczna biofilmu C. albicans nie jest związana z mniejszą ilością tworzonej biomasy (korelacja ujemna). Najprawdopodobniej przyczyną jest przejście części komórek C. albicans w stan anabiozy.

W celu potwierdzenia charakteru wzrostu biofilmów, określonego na podstawie analiz ilościowych, przeprowadzono obrazowanie przy wykorzystaniu skaningowej mikroskopii elektronowej, zgodnie z opisem w rozdziale 3.2.4.

Na postawie analizy obrazów mikroskopowych możliwa była identyfikacja faz rozwoju biofilmów badanych gatunków mikroorganizmów. Na rysunkach 18 – 21 przedstawiono proces tworzenia biofilmu przez gronkowca złocistego S. aureus.

83

Rys. 18 Biofilm gronkowca złocistego S. aureus – faza adhezji (6 h hodowli), powiększenie: A – 5 00, B– 20 000, C – 50 000, D – 100 000 razy.

A P

D C

C

B C

84

Rys. 19 Biofilm gronkowca złocistego S. aureus – faza agregacji komórek i akumulacji biomasy (8 h hodowli), powiększenie: A – 5 000; B–5 000; C – 20 000; D – 50 000 razy.

D C

A A

B

C D

C

85

A B

C D

Rys. 20 Biofilm gronkowca złocistego S. aureus – faza dojrzewania (12 h hodowli), powiększenie:

A –5 000, B – 20 000, C – 30 000 i D – 30 000 razy.

86

Rys. 21 Biofilm gronkowca złocistego – dojrzały biofilm (24 h hodowli), powiększenie A – 2 500, B – 5 000, C – 20 000, D – 30 000 razy.

Dla gronkowca złocistego pierwsze obrazowanie techniką SEM przeprowadzono w 6 h hodowli i na podstawie wyglądu komórek stwierdzono, że tworzony biofilm znajduje się w fazie adhezji. Najprawdopodobniej faza ta zaczyna się już od pierwszych minut kontaktu bakterii z powierzchnią płytki ale ze względów metodologicznych nie ma możliwości uchwycenia tego momentu za pomocą obrazowania mikroskopowego.

W przedstawionym na rysunku 18 polu widzenia, zaobserwować można pojedyncze skupiska komórek gronkowca, które przywierają do podłoża. Wszystkie komórki charakteryzują się prawidłową, kulistą morfologią (Rys. 18. A-D). W kolejnej fazie tworzenia biofilmu następowało namnażanie się komórek oraz akumulacja biomasy. Jak wynika z analizy rysunku 19 liczba komórek gronkowca wyraźnie wzrastała (Rys. 19. A).

W fazie dojrzewania biofilmu, trwającej do 12 h hodowli obserwowano wielowarstwową strukturę biofilmu (zajmującą ok. 90% powierzchni pola widzenia) w postaci stosów komórek oraz płatów macierzy zewnątrzkomórkowej (Rys. 20). Na rysunku 21 zobrazowano dojrzały biofilm S. aureus, który ukształtował się w 24 h hodowli. W jego

A B

C D

87

strukturze wyróżnić można kanały, którymi do wnętrza biofilmu transportowane są substancje odżywcze (Rys. 21 A-D).

Przebieg procesu tworzenia biofilmu przez pałeczkę okrężnicy Escherichia coli, zobrazowany z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej przedstawiono na rysunkach 22 – 25.

A B

Rys. 22 Biofilm Escherichia coli – faza adhezji (6 h hodowli), powiększenie A – 1 000,

B – 5 000 razy. B

88

Rys. 23 Biofilm Escherichia coli – faza agregacji komórek i akumulacji biomasy (12 h hodowli), powiększenie: A – 2 500, B – 5 000, C – 10 000, D – 20 00 razy.

A B

R

C D

89

Rys. 24 Biofilm Escherichia coli – faza dojrzewania (16 h hodowli), powiększenie: A – 500, B – 2 500, C – 5 000, D – 10 000 razy.

A

C D

B

90

Na podstawie analizy rysunków 22 – 25 wyróżniono cztery fazy rozwoju biofilmu E. coli. W pierwszej z nich obserwowano adhezję pojedynczych komórek bakterii do powierzchni i tworzenie niewielkich skupisk (Rys. 22 A, B). W kolejnej fazie stwierdzono intensywne namnażanie komórek czego wynikiem był wzrost ich zagęszczenia (ok. 80% powierzchni pola widzenia) w 12 h hodowli (Rys. 23 A-D).

Następnie zaobserwowano fazę dojrzewania biofilmu, która trwa do ok. 16 h hodowli.

W tej fazie komórki utworzyły wielowarstwową strukturę przestrzenną (Rys. 24 A-D).

W kolejnych godzinach (do 24 h hodowli) obserwowano dojrzałą, wielowarstwową strukturę biofilmu wraz z kanałami umożliwiającymi dopływ tlenu oraz substancji odżywczych (Rys. 25 A-D).

Przebieg formowania biofilmu przez Candida albicans, przedstawiono na rysunkach 26 – 28.

C DD

C

A B

Rys. 25 Biofilm Escherichia coli – dojrzały biofilm (24 h hodowli), powiększenie: A – 2 500, B – 5 000, C – 10 000, D – 10 000 razy.

91

Rys. 26 Rozwój biofilmu C. albicans – faza adhezji (12 h hodowli), powiększenie: A – 5 000, B – 20 000 razy.

B B

A B

A B

Rys. 27 Rozwój biofilmu C. albicans – faza przejściowa (24 h hodowli),powiększenie: A – 5 000, B – 10 000 razy.

Rys. 28 Rozwój biofilmu C. albicans – faza dojrzewania i dyspersji (48 h hodowli), powiększenie:

A – 2 000, B – 5 000 razy.

A B

92

Na podstawie analizy obrazów, uzyskanych techniką skaningowej mikroskopii elektronowej, stwierdzono, że w rozwoju biofilmu C. albicans można wyróżnić trzy fazy (Rys. 26 – 28). W fazie pierwszej, trwającej od momentu inokulacji hodowli do ok. 8 h, obserwowano adhezję komórek do podłoża. Analiza morfologii komórek C. albicans wykazała, że miały one kuliste kształty o regularnych krawędziach, typowe dla tego gatunku (Rys. 26 A, B). W fazie przejściowej, która rozpoczynała się od ok. 24 h hodowli obserwowano przyrost liczby komórek drożdży oraz ich większe zróżnicowanie morfologiczne. Pojawiły się komórki wydłużone, które tworzyły pseudostrzępki (Rys. 27 A, B). W kolejnej fazie rozpoczynającej się od 48 h hodowli, obserwowano dalszy przyrost ilości komórek drożdży oraz postępujące różnicowanie. Oprócz pseudostrzępek pojawiły się w pełni wykształcone strzępki, które tworzyły mocno zagęszczoną strukturę maty (Rys.

28 A, B).

4.2 Kokultury komórek fibroblastów z drobnoustrojami tworzącymi