Mechanizmy tworzenia i rozprzestrzeniania biofilmów

30

urządzeniach medycznych, protezach, cewnikach, implantach kardiologicznych i innych.

Infekcje najczęściej występują u osób z osłabionymi naturalnymi barierami ochronnymi (np. z uszkodzonym naskórkiem lub osłabionym układem immunologicznym) [85].

Szczególnie groźne są dla pacjentów z AIDS lub poddawanych chemioterapii nowotworów lub terapii immunosupresyjnej oraz dla u osób z wszczepionymi urządzeniami medycznymi [85]. Zakażenia C. albicans stanowią 15% wszystkich przypadków sepsy i około 40% zakażeń krwi w warunkach szpitalnych [84]. Według Gil i in. w ostatnich latach obserwuje się zwiększoną częstość infekcji ran pooparzeniowych spowodowanych przez gatunek Candida albicans. Gatunek ten można również znaleźć w izolatach z około 22% ran przewlekłych [86].

31

immunomodulatorowych, osłabiających funkcjonowanie układu immunologicznego gospodarza, komórki w strukturze biofilmu są chronione przed wykryciem przez specyficzne białka [87]. Ponadto, komórki znajdujące się w biofilmach cechują się niską aktywnością metaboliczną, co zwiększa ich tolerancję na antybiotyki, których celem są przede wszystkim komórki aktywne metabolicznie [88], [89].

Rozwój biofilmu gronkowcowego jest złożonym procesem, który można podzielić na cztery główne fazy: (a) początkowe osiadanie na powierzchni (adhezja), (b) wytwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej i namnażanie komórek, (c) dojrzewanie biofilmu oraz (d) dyspersja biofilmu. Pierwsza faza tworzenia biofilmu gronkowców zależna jest od białek z rodziny CWA (ang. cell wall-anchored protein), które są zakotwiczone w ścianie komórkowej [88]. Biorą w niej również udział bakteryjne, powierzchniowe substancje rozpoznające tzw. adhezyjne molekuły macierzy – MSCRAMMs (ang. microbial surface components recognizing adhesive matrix), które odpowiadają za kowalencyjne i niekowalencyjne połączenia z powierzchnią biotyczną lub abiotyczną [89]. Wśród nich wyróżnić można m.in. białka ClfA/B, SdrC oraz FnbpA/B umożliwiające wiązanie fibronektyny i fibrynogenu. Adhezję wspomagają również oddziaływania van der Waalsa oraz elektrostatyczne [90]–[93]. W kolejnej fazie tworzenia biofilmu następuje wytworzenie zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych EPS (ang. extracellular polymeric substance), tworzących macierz zewnątrzkomórkową (ECM). Badania wykazały, że EPS gronkowcowy ma bardzo zmienny skład, w zależności od dostępności składników odżywczych, środowiska gospodarza i mechanicznych sił ścinających [87], [88], [89]. W fazie wytwarzania macierzy zewnątrzkomórkowej następuje wzmożone namnażanie komórek drobnoustrojów i ich agregacja. Zgodnie z zaproponowanym mechanizmem określanym jako zależny od operonu icaABCD w tworzeniu macierzy biofilmowej bakterii z rodzaju Staphylococcus sp. główną rolę pełni grupa białek składających się z polisacharydowej adhezyny międzykomórkowej (PIA) i poli-N-acetylo-b-(1-6)glukozaminy (PGNA) [94]. Jest ona głównym składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej i oprócz wspierania agregacji komórek, pełni również rolę strukturalną oraz ochronną [94]. Ekspresja operonu icaABCD kontrolowana jest przez czynniki SarA oraz σB [95]. Staphylococcus aureus może również tworzyć biofilm niezależnie od operonu icaABCD. Wówczas głównym składnikiem macierzy biofilmowej jest eDNA (ang. extracelluar DNA), pochodzący z autolizy części komórek biofilmowych.

Oprócz niego w macierzy biofilmu występują białka i kwasy tejchojowe [96], [97].

32

Tworzenie tego rodzaju biofilmu regulowane jest przez aktywność hydrolazy (autolizyny) mureinowej (AtlA), której nadekspresja prowadzi do autolizy komórek. [98], [99].

Kolejnym etapem rozwoju biofilmu Staphylococcus aureus jest utworzenie jego przestrzennej struktury trójwymiarowej i akumulacja komórek. Głównym białkiem zaangażowanym w ten proces i odpowiadającym za oddziaływania między komórkami bakteryjnymi jest białko z grupy CWA, określane jako Bap (ang. biofilm-associated protein) [100]. Inne białko, określane jako SasG (ang. S. aureus surface protein G) odpowiada za tworzenie fibryli pozwala na uformowanie struktury 3D biofilmu [101]. Za dojrzewanie i stabilizację biofilmu odpowiedzialne są moduliny – amyloidy bakteryjne, rozpuszczalne w fenolu PSMs (ang. Phenol Soluble Modulins). Dzięki ich obecności w trójwymiarowej strukturze biofilmu powstają kanały niezbędne do przepływu substancji odżywczych. Wysoka trwałość i oporność amyloidów na proteolizę oraz rozpad pod wpływem czynników mechanicznych, umożliwiają wzrost biofilmu, pomimo niekorzystnych warunków panujących poza jego strukturą. Bakterie wytwarzające PSM, produkują biofilmy, które są wyraźnie grubsze i bardziej rozległe w porównaniu do biofilmów syntezowanych przez drobnoustroje pozbawione tych zdolności. Ponadto, amyloidy hamują odpowiedź immunologiczną gospodarza poprzez lizę ludzkich neutrofili, jednocześnie wspomagając rozpad (dyspersję) biofilmu. W ostatniej fazie, przy ich udziale następuje oderwanie się bakterii od dojrzałego biofilmu oraz ich rozproszenie, czyli przeniesienie bakterii w stan planktoniczny. W tej formie mogą się one osadzić w odległym miejscu i utworzyć nowy biofilm [102], [103]. Dyspersja biofilmu może być spowodowana oddziaływaniem zewnętrznych sił mechanicznych lub uwolnieniem się agregatów komórek z macierzy biofilmowej, w wyniku lizy wywołanej przez enzymy lityczne. Ten drugi mechanizm dyspersji jest zazwyczaj indukowany w sytuacji niekorzystnych zmian środowiskowych (np. niedoboru tlenu lub składników odżywczych) [80].

W niedawno opublikowanej pracy przeglądowej Moormeier i in., zaproponowano rozszerzenie tradycyjnego modelu tworzenia biofilmu gronkowców o nową fazę, zwaną exodusem, która ma miejsce przed fazą dojrzewania. Faza exodusu jest wyzwalana przez aktywność nukleazy Nuc1. Odpowiada ona za degradację eDNA zawartego w macierzy, umożliwiając uwolnienie subpopulacji komórek z biofilmu. Komórki pozostające w biofilmie przechodzą następnie szybki wzrost, co prowadzi do powstania charakterystycznej „wieży” [104]. Na rysunku 4 przedstawiono schemat tworzenia biofilmu przez gronkowca S. aureus .

33 Rys. 4 Model rozwoju biofilmu Staphylococcus aureus [105].

Ponieważ biofilmy są dynamicznymi i złożonymi systemami biologicznymi, gronkowce wykształciły rozległą sieć mechanizmów regulacyjnych do modyfikowania i „dostrajania” rozwoju biofilmu do zmian warunków środowiskowych [103], [104], [106], [107]. Tworzenie biofilmu przez S. aureus regulowane jest poprzez system komunikacji komórek drobnoustrojów, określany jako sygnalizator zagęszczenia QS (ang. Quorum Sensing). Ten system komunikacji między komórkami mikroorganizmów, uczestniczący w regulacji ekspresji genów w odpowiedzi na gęstość populacji, wykryto zarówno u bakterii Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych. Ma on szczególne znaczenie w opanowywaniu przez bakterie nowych terytoriów i precyzuje do jakich warunków mogą zaadaptować się poszczególne drobnoustroje [106]. System Quorum Sensing umożliwia gronkowcom zmianę ekspresji czynników wirulencji, zwiększenie oporności na antybiotyki oraz tolerancji na stres środowiskowy [104]. Głównym jego elementem są cząsteczki sygnalizacyjne – autoinduktory. Osiągnięcie stężenia progowego danego induktora jest informacją dla całej populacji komórek o przekroczeniu określonej gęstości progowej i konieczności inicjacji zmiany np. w ekspresji genów. Autoinduktorem QS u S. aureus jest peptyd zewnątrzkomórkowy – AIP (ang. auto inducing peptide)

34

regulowany przez operon agr. Wraz ze wzrostem populacji AIP gromadzi się w środowisku lokalnym, a po osiągnięciu wystarczającego stężenia, wywołuje zsynchronizowane zmiany ekspresji genów, które są odpowiedzialne za wywołanie infekcji przez patogen oraz przetrwanie odpowiedzi immunologicznej ze strony gospodarza. Zwiększenia syntezy AIP, przyczynia się do wzrost ekspresji toksyn, proteaz serynowych, DNAz, fibrynolizyny i enterotoksyn przez co znacząco zwiększa zjadliwość gronkowca S. aureus [104].

Podobnie jak w przypadku S. aureus rozwój biofilmu pałeczki okrężnicy Escherichia coli przebiega zgodnie z zaproponowanym modelem czterofazowym. Warunkowany jest czynnikami środowiskowymi takimi jak dostępność środków odżywczych, temperatura, pH i siły jonowe pożywki [80], [108], [109]. We wczesnej fazie rozwoju biofilmu, adhezja do powierzchni indukuje zahamowanie syntezy wici i unieruchomienie komórek E. coli.

Za proces przejścia od stanu planktonicznego do stanu nieruchomego odpowiedzialny jest cykliczny kwas diguanylowy (c-di-GMP). Stężenie c-di-GMP jest niskie w stanie planktonicznym i wzrasta podczas tworzenia biofilmu [110]. Ponadto bakterie E. coli w naturalnie tworzonych biofilmach posiadają charakterystyczne fimbrie typu „curli”, kodowane przez gen csg, oraz fimbrie typu I kodowane przez geny fim. Oba rodzaje fimbrii zaangażowane są nie tylko w sam proces tworzenia struktury biofilmu, ale również w agregację (poprzez ułatwienie komunikacji komórka-komórka), adhezję (poprzez wzmocnienie interakcji komórka-powierzchnia) czy wczesne etapy inwazji [80].

Stymulację tego etapu powoduje również ekspresja genu pgaC, który odpowiada za produkcję syntazy poly-beta-1,6-N-acetyl-D-glukozaminy. Enzym ten katalizuje polimeryzację pojedynczych jednostek monomerowych UDP-N-acetyloglukozaminy (UDP-GlcNAc) w celu wytworzenia linowego homopolimeru poli-beta-1,6-N-acetylo-D-glukozaminy (PGNA)). W czasie etapu dojrzewania, komórki E. coli silnie proliferują i agregują. Następuje również wzmocnienie odziaływań międzykomórkowych.

W agregacji biorą udział liczne białka, pełniące rolę autotransporterów. Wśród nich należy wyróżnić antygen 43 kodowany przez gen flu. Jest to białko wspierające adhezję i agregację komórek oraz tworzenie trójwymiarowej struktury biofilmu E. coli. Bakterie produkują macierz zewnątrzkomórkową ECM utworzoną z syntetyzowanych na zewnątrz polimerów EPS, która pomaga utworzyć strukturę biofilmu i pełni funkcję ochronną.

Wydzielane EPS składa się głownie z cukrów takich jak poli-β-1,6-N-acetylo-D-glukozamina (PGA), celuloza, kwas hialuronowy oraz lipopolisacharydy (LPS). Rolę kontrolną nad wydzielaniem macierzy zewnątrzkomórkowej pełni operon pgaABCDE.

35

Koduje on między innymi gen pgaC, odpowiadający za ekspresję glikozylotransferazy pgaC, zaangażowanej w syntezę PGA [108], [109]. Podczas tworzenia biofilmu E. coli indukowane są zróżnicowane geny odporności na stres, które chronią biofilm przed nieprzyjaznym środowiskiem. Dla przykładu białko YcfR (BhsA) zwiększa zdolność bakterii do produkcji indolu i tworzenia biofilmu odpornego (do określonego stopnia) na kwasy, ciepło, nadtlenek wodoru i kadm [80]. Regulacja ekspresji genów wewnątrz biofilmu E. coli zachodzi dzięki systemowi Quorum Sensing. Komórki posiadają zdolność do wydzielania autoinduktorów, które gdy osiągnięte jest ich stężenie graniczne (korelujące z określoną liczbą komórek w biofilmie), indukują zmiany ekspresji genów [111]. U Escherichia coli opisano autoinduktory będące, pod względem budowy chemicznej, acylowanymi laktonami homoseryny (AHL) [112]. Ostatnim etapem rozwoju biofilmu jest jego rozprzestrzenianie, które rozpoczyna się od oderwania fragmentu dojrzałego biofilmu (na przykład na skutek oddziaływania zewnętrznych sił mechanicznych) lub uwolnienia się agregatów komórek z macierzy biofilmowej (na skutek aktywności enzymów litycznych), a następnie migracji i kolonizacji nowych nisz środowiskowych. Dyspersja biofilmu zachodząca pod wpływem aktywności enzymów litycznych jest zazwyczaj indukowana w sytuacji niekorzystnych zmian środowiskowych (np. niedoboru tlenu lub składników odżywczych).

Tworzenie biofilmu przez Candida albicans to proces złożony, który przebiega w podobny sposób jak u wymienionych wcześniej gatunków bakterii [84], [113].

Podzielony jest na trzy główne fazy, które przedstawiono na rysunku 5.

Rys. 5 Cykl rozwoju biofilmu C. albicans [84].

36

Biofilmy C. albicans różni od biofilmów bakteryjnych wysoce zróżnicowaną struktura. Można w niej wyróżnić wiele typów komórek np. okrągłe pączkujące komórki drożdżowe, owalne komórki pseudostrzępkowe i wydłużone komórki strzępkowe.

Z zewnątrz otoczone są macierzą zewnątrzkomórkową ECM, [84], [113].

W procesie adhezji kulistych komórek drożdży do podłoża biorą udział głównie białka ściany komórkowej tzw. adhezyny, które ułatwiają przywieranie do powierzchni komórek poprzez wiązania z aminokwasami lub cukrami. Adhezyny C. albicans należą do rodziny białek ściany komórkowej GPI-CWPs (ang. glycosyl-phosphatidylinositol – cell wall proteins) [114]. Częścią tej rodziny białek są białka Als (ang. agglutinin- like sequence), które posiadają zdolność do wiązania białek poprzez domenę C-końcową [115].

Kolejną grupą adhezyn są Hwp (ang. hyphal wall protein). Spośród nich jedną z ważniejszych jest mannoproteina Hwp1, która występuje w ścianie komórkowej zarówno w tzw. rurce zarodkowej, jak i w strzępkach [116]. W rodzinie Hwp możemy wyróżnić jeszcze inne białka wymagane do rozwoju biofilmu takie jak Hwp2, Rbt1, Eap1 i Ywp1.

Adhezja jest wzmacniana przez oddziaływania elektrostatyczne i siły van der Waalsa.

Po fazie adhezji, następuje rozwój biofilmu obejmujący wzmożoną proliferację komórek C. albicans, produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej oraz organizację struktury biofilmu. Zachodzą również zmiany morfologiczne, przejawiające się tworzeniem owalnych pąków, ciągłych strzępek oraz pseudostrzępek [117]. Macierz zewnątrzkomórkowa drożdżaków z rodzaju Candida sp. składa się w 40%

z polisacharydów, głównie z α-mannanu i β-1,6-glukanu, glukozy i heksozaminy.

Pozostałe składniki to głównie białka, lipidy (glicerolipidy, sfingolipidy) i eDNA [118]. Na podstawie badań in vitro stwierdzono, że na proces tworzenia i morfologię biofilmu C. albicans wpływ mają takie czynniki jak: podłoże wzrostowe, dostępność środków odżywczych czy szybkość ich przepływu [113], [114]. Dojrzały biofilm zwykle tworzy się, w ciągu 72 godzin i można go zobaczyć gołym okiem jako mętną strukturę na powierzchni stałej [84]. W badaniach in vitro wykazano, że komórki Candida sp. są prawdopodobnie rozpraszane w sposób ciągły (od momentu powstania biofilmu). Pomimo, że rozproszone komórki morfologicznie przypominają okrągłe komórki drożdży, charakterystyczne dla planktonicznego trybu wzrostu, mają one jednak odrębne cechy. Wyróżnia je zwiększona zdolność do przylegania i mają wyższą zdolność do tworzenia biofilmów. Dwa białka wydają się być kluczowe dla procesu dyspersji biofilmów Candida sp. Są to cząsteczkowy chaperon Hsp90, którego ubytek indukuje włóknienie struktury i białko ściany

37

komórkowej Ywp1, którego usunięcie prowadzi do zmniejszenia stopnia dyspersji biofilmu i zwiększenia jego adhezji [113], [119].

Regulacja tworzenia biofilmu przez C. albicans we wszystkich jego fazach odbywa się poprzez regulatory transkrypcji. Wśród głównych białek wymaganych do rozwoju biofilmu wymienić należy białka Bcr1, Ndt80, Efg1, Tec1, Cph1 i Rob1. Wpływają one na tworzenie strzępek (Efg1, Tec1, Ndt80, Rob1), ich wzrost (Cph1) i wzajemne przyleganie (Bcr1). Poprzez bezpośrednie połączenie z promotorami, wymienione białka regulują ekspresję około 1000 genów docelowych, z których niektóre są dodatkowymi regulatorami transkrypcji, tworząc szkielet rozległej, złożonej i powiązanej sieci genów zaangażowanych w tworzenie biofilmu [120]. Wielu zidentyfikowanym genom nie przypisano jeszcze funkcji. Pewną trudność stanowi fakt, że ogromna większość z nich nie wykazuje podobieństwa do sekwencji scharakteryzowanych wcześniej u innych mikroorganizmów, co może wskazywać, że są genami unikalnymi dla C. albicans [113].

Biofilm C. albicans charakteryzuje się znacznie wyższą opornością na działanie środków przeciwdrobnoustrojowych np. amfoterycyny B i flukonazolu, niż komórki planktoniczne tego samego szczepu [84], [121]. Cechą szczególną biofilmów drożdżowych, wpływającą na ich lekooporne właściwości, jest obecność komórek przetrwalnych, które stanowią niewielki podzbiór uśpionych metabolicznie komórek [121].

Wiadomo również, że tworzenie biofilmu przez Candida sp. może zapewniać ochronę przed mechanizmami obronnymi gospodarza. W badaniach in vivo wskazano, że dojrzałe biofilmy C. albicans są rozpoznawane i otaczane przez neutrofile, które jednak pozostają zwykle nieaktywne. Przyczyną tej swoistej odporność biofilmu jest najprawdopodobniej duża zawartość glukanów w macierzy zewnątrzkomórkowej ECM lub wpływająca na osłabienie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej obecność komórek strzępkowych.

Wykazano, że strzępki charakterystyczne dla biofilmów drożdżakowych mogą nie tylko łatwo penetrować warstwy komórek nabłonkowych podczas fazy wzrostu, ale są również w stanie ułatwić uwolnienie komórek C. albicans z wnętrza komórek fagocytarnych poprzez ich fizyczne przebicie [122].

Opisane powyżej organizmy mogą wchodzić ze sobą w interakcje, co może wpływać na ich przeżywalność i zjadliwość. Typowe sposoby interakcji obejmują: a) wydzielanie cząsteczek sygnałowych, które wpływają na zachowanie jednego gatunku w stosunku do drugiego, b) bezpośredni kontakt fizyczny między komórkami drobnoustrojów (np.

strzępki stanowią miejsce przyłączenia komórek bakteryjnych w biofilmach polidrobnoustrojowych) c) zmiany chemiczne lokalnego środowiska, które wpływają na

38

inne gatunki (np. zmiany pH i zawartości tlenu). W badaniach wykazano, że biofilmy tworzone przez C. albicans mogą działać jako „płaszcz ochronny” dla patogenów beztlenowych w środowiskach bogatych w tlen [123]. Biofilmy mieszanych gatunków mogą zarówno wytwarzać, jak i wykorzystywać większą różnorodność składników odżywczych poprzez tworzenie konsorcjów metabolicznych, w których metabolity jednego gatunku mogą być wykorzystane przez inny [123]. Z tego powodu badanie interakcji zachodzących między różnymi gatunkami w biofilmach polidrobnoustrojowych oraz wyjaśnienie ich znaczenia dla zdrowia ludzkiego jest istotnym kierunkiem badań, który może się przyczynić do opracowania nowych strategii zwalczania złożonych infekcji [84], [113], [122].