4. OMÓWIENIE WYNIKÓW
4.4 Analiza genetyczna
4.4.2 Ocena ekspresji wybranych genów związanych z procesem apoptozy
W pierwszym etapie analiz genetycznych przeprowadzono reakcje PCR w celu potwierdzenia ekspresji wybranych genów w genomowym DNA komórek linii fibroblastów L929.
Na podstawie rozdziałów elektroforetycznych przeprowadzonych zgodnie z opisem w rozdziale (Sposób prowadzenia rozdziałów elektroforetycznych DNA i RNA) potwierdzono ekspresję następujących genów związanych z procesem apoptozy.
casp-9 (ang. Caspase 9) – gen kodujący enzym kaspazę 9, enzym o aktywności proteaz cysteinowych, pełniący funkcję inicjatorową wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału rozpoczynającego apoptozę [173];
casp-3 (ang. Caspase 3) – gen kodujący enzym kaspazę 3 – enzym zaangażowany w proces apoptozy, stanowi substrat dla kaspazy 9 [174];
bax – gen kodujący białko proapoptotyczne BAX z rodziny białek bcl-2 (ang. Bcl-2 associated X-protein lub bcl-2-like protein), uczestniczy w tworzeniu kanałów w błonie zewnętrznej mitochondrium, co prowadzi do utraty potencjału błonowego i uwalniania cytochromu c [175];
bcl-2 – gen kodujący białko BCL-2, hamujące działanie białka BAX[176];
il-6 (ang. interleukine 6) – gen kodujący interleukinę 6, charakterystyczną dla stanu zapalnego [177];
gadph – gen referencyjny [178];
Rys. 59 Przykładowy elektroforegram przedstawiający produkty reakcji PCR wykonanej dla komórek fibroblastów linii L929,w kolumnach produkty genu: 1 –casp-3; 2 – gadph; 3 – il-6; 4 – bcl-2; 5 – bax;M – marker wielkości fragmentów DNA w zakresie 100 –1000 par zasad.
M 1 2 3 4 5
100 pz
128
Kolejnym etapem badań była ocena poziomu ekspresji wybranych genów komórek fibroblastów przy zastosowaniu metody RT-PCR. Poziom ekspresji wszystkich wybranych genów oceniano względem genu referencyjnego gadph w 12, 16, 24 i 48 h w hodowli komórek fibroblastów oraz w komórkach pochodzących z kokultur komórek z biofilmem drobnoustrojów.
Analiza ekspresji genów casp-3, casp-9, bcl-2, bax oraz il-6 została przeprowadzona dla kohodowli fibroblastów z gronkowcem złocistym, przedstawiona na rysunkach 60–63.
Rys. 60 Zmiany w relatywnej ekspresji genów casp-9 i casp-3 względem genu gadph w komórkach fibroblastów w 12 i 24 h kohodowli z biofilmem S. aureus.
Wykazano obniżony poziom ekspresji genu casp-3 w punkcie krytycznej kolonizacji (12 h). Podwyższony poziom ekspresji genów casp-3 i casp-9 obserwowano w 24 h kohodowli komórek fibroblastów z gronkowcem.
Analizę ekspresji genów bax i bcl-2 w czasie kohodowli z gronkowcem S. aureus przedstawiono na rysunku 61.
129
Rys. 61 Zmiany w relatywnej ekspresji genów bcl- i bax względem genu gadph w komórkach fibroblastów w 12 i 24 h kohodowli z biofilmem S. aureus.
Analiza wykazała nadekspresję genu bcl-2 w 12 h, a genu bax w 24 h kohodowli.
Gen bcl-2 nie był ekspresjonowany w kohodowli fibroblastów z dojrzałym biofilmem (24 h hodowli), natomiast gen bax w punkcie krytycznej kolonizacji (12 h) (Rys. 61).
Przeanalizowano również zmiany ekspresji genu il-6, w odpowiedzi na kohodowlę fibroblastów z S. aureus prowadzoną przez 12 i 24 godziny. Wyniki zestawiono na rysunku 62.
130
Rys. 62 Zmiany w relatywnej ekspresji genu il-6 względem genu gadph w komórkach fibroblastów w 12 i 24 h kohodowli z biofilmem S. aureus.
Dla genu kodującego interleukinę 6 (il-6) wykazano nadekspresję w 12 h kohodowli z gronkowcem złocistym. Natomiast w dojrzałym biofilmie (24 h hodowli) poziom ekspresji genu był bliski zera (Rys 62).
Na rysunkach 63 i 64 przedstawiono wyniki zmiany ekspresji genu odpowiednio casp-9 i casp- 3 w 16 i 24 h kohodowli z biofilmem E. coli.
Rys. 63 Zmiany w relatywnej ekspresji genów casp-9 względem genu gadph w komórkach fibroblastów linii L929 w 16 i 24 h kohodowli z biofilmem E. coli.
131
Rys. 64 Zmiany w relatywnej ekspresji genu casp-3 względem genu gadph w komórkach fibroblastów linii L929 w 16 i 24 h kohodowli z biofilmem E. coli
Gen casp-9 charakteryzowała bardzo wysoka (ok. 500 razy wyższa w stosunku do genu referencyjnego gadph) ekspresja w punkcie krytycznej kolonizacji (16 h). W 24 h kohodowli fibroblastów linii L929 z biofilmem E. coli obserwowano znaczące (ok. 5 razy) obniżenie ekspresji tego genu (Rys. 63). Ponadto odnotowano ponad dwa razy mniejszą ekspresję genu casp-3 (Rys. 64).
Kolejnymi analizowanymi genami były gen bax i bcl-2. Wyniki ekspresji tych genów w komórkach fibroblastów linii L929, rosnących w obecności biofilmu E. coli w 16 i 24 h ich kohodowli przedstawiono na rysunku 65.
132
Rys. 65 Zmiany w relatywnej ekspresji genów bcl-2 i bax względem genu gadph w komórkach fibroblastów linii L929 w 16 i 24 h kohodowli z biofilmem E. coli.
Przeanalizowano poziom ekspresji genu bcl-2 kodującego jedno z białek antyapoptotycznych i stwierdzono jego silną ekspresję w 16 h kohodowli z biofilmem bakterii E. coli (punkt krytycznej kolonizacji). W 24 h hodowli ekspresja tego genu zmniejszyła się ponad 40 razy. Natomiast zmiany ekspresji genu bax, kodującego białko BAX, nie były tak gwałtowne w czasie. W 24 h kohodowli jego ekspresja była niższa ok.
3,7 razy w stosunku do ekspresji w punkcie krytycznej kolonizacji (Rys. 65).
Na rysunku 66 przedstawiono analizę ekspresji genów podczas kohodowli fibroblastów z C. albicans.
133
Rys. 66 Zmiany w relatywnej ekspresji genów casp-9 i casp-3 względem genu gadph w komórkach fibroblastów linii L929 w 24 i 48 h kohodowli z biofilmem C. albicans.
Na podstawie analizy rysunku 66 stwierdzono podwyższony poziom ekspresji genu casp-9 w 48 h kohodowli fibroblastów z biofilmem C. albicans. Ponadto stwierdzono znaczący wzrost poziomu ekspresji (względem punktu krytycznej kolonizacji) genu kodującego kaspazę casp-3 w dojrzałym biofilmie C. albicans (48 h od inokulacji) (Rys.
66).
Na rysunku 67 przedstawiono zmiany w relatywnej ekspresji genów bcl-2 i bax w 24 i 48 h kohodowli komórek fibroblastów z biofilmem C. albicans.
134
Rys. 67 Zmiany w relatywnej ekspresji genów bcl-2 i bax względem genu gadph w komórkach fibroblastów w 24 i 48 h kohodowli z biofilmem C. albicans.
Przeprowadzona analiza ekspresji genów bcl-2 i bax wykazała ich nadekspresję w 48 h kohodowli fibroblastów z biofilmem C. albicans. Natomiast w 24 h (punkt krytycznej kolonizacji) geny te nie były ekspresjonowane (Rys. 67).
Kolejnym badanym genem był gen kodujący interleukinę 6 (il-6), która odpowiada za wywołanie stanu zapalnego. Wyniki przedstawiono na rysunku 68.
Rys. 68 Zmiany w relatywnej ekspresji genu il-6 względem genu gadph w komórkach fibroblastów po 24 i 48 h kohodowli z biofilmem C. albicans.
135
Badanie wykazało brak ekspresji genu il-6 w punkcie krytycznej kolonizacji i jego podwyższoną ekspresję w 48 h kohodowli z biofilmem C. albicans (Rys. 68).
4.4.3 Ocena ekspresji wybranych genów związanych z procesem tworzenia biofilmu drobnoustrojów
Na podstawie przeprowadzonych reakcji RT-PCR zgodnie z opisem w rozdziale (3.5.4) przeanalizowano ekspresję następujących genów związanych z tworzeniem biofilmu przez Staphylococcus aureus :
clfA – gen kodujący czynnik skupiania A (ang. clumping factor A) [179];
clfB – gen kodujący czynnik skupiania B (ang. clumping factor B) [90];
fib – gen kodujący białko wiążące fibrynogen (ang. fibrinogen binding protein) [180]
ebpS – gen kodujący białko wiążące elastynę (ang. elastin-binding protein) [181];
eno – gen kodujący białko wiążące laminę (ang. encoding laminin binding protein) [182];
fnbA i fnbB– – gen kodujący białko wiążące fibronektynę A i B (ang. fibrinogen binding protein A and B) [93];
gyrA – gen referencyjny [183];
136
W pierwszym etapie przeanalizowano ekspresję genów związanych z adhezją biofilmów. Wyniki zestawiono na rysunkach 69 – 73.
Rys. 69 Zmiany w relatywnej ekspresji genów eno, fib, epbS względem genu gyrA w komórkach biofilmu S. aureus po 12 i 24 h kohodowli z fibroblastami linii L929.
Analiza poziomu ekspresji genów gronkowca złocistego w 12 h kohodowli z fibroblastami (punkt krytycznej kolonizacji) wykazała niewielkie zwiększenie ekspresji genów kodujących białka z rodziny MSCRAMMS, w tym genów fib i ebpS, kodujących odpowiednio białko wiążące fibrynogen i elastynę. Natomiast w 24 h kohodowli odnotowano małe zmiany w ekspresji genów eno i epbS oraz około połowę mniejszą ekspresję genu fib (Rys. 69).
137
Rys. 70 Zmiany w relatywnej ekspresji genów fnbA i fnbB względem genu gyrA w komórkach biofilmu S. aureus w 12 i 24 h kohodowli z fibroblastami linii L929.
Analiza poziomu ekspresji genów fnbA i fnbB kodujących białka wiążące fibronektynę wykazała blisko trzykrotne zwiększenie ekspresji genu fnbA w 24 h hodowli.
Natomiast ekspresja genu fnbB uległa w tym samym czasie obniżeniu (Rys 70).
Kolejnymi analizowanymi genami były geny kodujące czynniki skupiania A i B.
Wyniki przedstawiono na rysunku 71.
Rys. 71 Zmiany w relatywnej ekspresji genów clfA i clfB względem genu gyrA w komórkach biofilmu S. aureus w 12 i 24 h kohodowli z fibroblastami linii L929.
138
Analiza ekspresji czynników skupiania A i B wykazała nadekspresję czynnika B (clfB) w 24 h kohodowli. Poziom ekspresji genu clfA była bardzo mały w 12 h kohodowli.
Natomiast w 24 h nie był on w ogóle wytwarzany.
W kolejnym kroku przeprowadzono ocenę ekspresji wybranych genów związanych z procesem tworzenia biofilmu E. coli przeprowadzając szereg reakcji RT-PCR zgodnie z opisem w rozdziale 3.5.4.
Przeanalizowano ekspresję następujących genów związanych z tworzeniem biofilmu przez Escherichia coli:
csrA – gen kodujący białko regulatorowe (regulator transkrypcji, który wiąże mRNA w celu regulacji inicjacji translacji i/lub stabilności mRNA) CsrA, koordynujące wiele procesów fizjologicznych m.in. metabolizm węgla, zmiany w ekspresji genów związanych z namnażaniem, stresem środowiskowym i ruchliwość (ang. Carbon storage regulator A) [184];
fimA – gen kodujący białko stanowiące główny komponent włókna fimbrii typu 1 (ang.
type-1 fimbrial protein, A chain) [185];
fimB, – gen kodujący białko regulatorowe fimbrii typu 1(ang. Type 1 fimbriae regulatory protein) [191][186];
pgaC – gen kodujący podjednostkę C syntazy Poli-N-acetylo-D-glukozamina (PGA), która odpowiada za pośredniczenie w translokacji i/lub zakotwiczeniu PGA do powierzchnia komórki (ang. poly-beta-1,6-N-acetyl-D-glucosamine synthase) [109]
uidA – gen referencyjny
Wyniki analiz ekspresji genów dla pałeczki okrężnicy E. coli przedstawiono na rysunkach 72-75. W pierwszym kroku przeanalizowano gen pgaC, a otrzymane wyniki przedstawiono na rysunku 72.
139
Rys. 72 Zmiany w relatywnej ekspresji genu pgaC względem genu uidA w komórkach biofilmu E. coli w 16 i 24 h kohodowli z fibroblastami linii L929.
Przeprowadzona analiza ekspresji genu pgaC (wymaganego do procesu syntezy PGA) wykazała jego nadekspresję w 16 h od wprowadzenia inokulum E. coli do hodowli fibroblastów. Po 24 godzinach trwania kohodowli zaobserwowano ponad trzykrotne obniżenie ekspresji tego genu (Rys. 72).
W kolejnym kroku przeanalizowano ekspresję genów fim A i B (Rys. 73 – 74)
Rys. 73 Zmiany w relatywnej ekspresji genu fimB względem genu uidA w komórkach biofilmu E. coli w 16 i 24 h kohodowli z fibroblastami linii L929.
140
Rys. 74 Zmiany w relatywnej ekspresji genu fimA względem genu uidA w komórkach biofilmu E. coli w 16 i 24 h kohodowli z fibroblastami linii L929.
Najwyższy poziom ekspresji wykazano dla genu fimB (ekspresja względem genu referencyjnego równa 532,51) w 16 h od wprowadzenia inokulum bakterii E. coli. Poziom ten gwałtownie się obniżył (wartość 0,89 względem genu referencyjnego) po 24 godzinach kohodowli (Rys. 73). Natomiast ekspresja genu fimA kodującego białko fimA była dużo niższa, zarówno w punkcie krytycznej kolonizacji, jak i w dojrzałym biofilmie.
Maksymalnie podwyższony poziom ekspresji (2,46 × aktywność genu referencyjnego) obserwowano w 16 h kohodowli E. coli z fibroblastami. Natomiast po 24 h kohodowli ekspresja ta była pięciokrotnie mniejsza (Rys. 74).
Ostatnim badanym genem był gen csrA. Wyniki zmiany w relatywnej ekspresji tego genu względem genu referencyjnego uidA przedstawiono na rysunku 75.
141
Rys. 75 Zmiany w relatywnej ekspresji genu csrA względem genu uidA w komórkach biofilmu E. coli w 16 i 24 h kohodowli z fibroblastami linii L929.
Zaobserwowano silną ekspresję genu csrA w 16 h kohodowli E. coli z komórkami fibroblastów (52,95 razy wyższa względem genu referencyjnego) oraz znaczące obniżenie jego ekspresji (0,69 razy wyższa względem genu referencyjnego) w 24 h prowadzenia kohodowli.
Następnie przeprowadzono ocenę ekspresji wybranych genów związanych z procesem tworzenia biofilmu przez C. albicans Na podstawie reakcji RT-PCR przeprowadzonych zgodnie z opisem w rozdziale 3.5.4 dokonano analizy ekspresji następujących genów związanych z tworzeniem biofilmu przez Candida albicans:
hwp-1 – gen kodujący białko ściany komórkowej w strzępkach C. albicans, odpowiedzialne za adhezję biofilmu do komórek gospodarza (ang. hyphal wall protein 1) [116];
bcr-1 –gen kodujący czynnik transkrypcyjny, wymagany do tworzenia biofilmu, nie występuje w strzępkach C. albicans (ang. biofilm and cell wall regulator 1) [187];
ywp-1 – gen kodujący białko ściany komórkowej u C. albicans w formie planktonicznej (ang. yeast wall protein 1) [119];
als-1– gen kodujący adhezynę powierzchniową 1, grupa białek Als, (ang.
Agglutinin-like sequence 1) [115];
als-3 – gen kodujący adhezynę powierzchniową 3, grupa białek z rodziny Als, (ang. agglutinin-like sequence 3) [114];
142
act1 (ang. β-actin) – gen referencyjny [183].
Przeanalizowano ekspresję genów z rodziny als (als-1 i als-3). Wyniki przedstawiono na rysunku 76.
Rys. 76 Zmiany w relatywnej ekspresji genów als-1 i als-3 względem genu act1 w komórkach drożdży C. albicans w 12 i 24 h kohodowli z fibroblastami linii L929.
Gen als-1 odznaczał się niskim poziomem ekspresji (0,65 krotnie niższy względem genu referencyjnego) w 24 h hodowli, która nieznacznie wzrosła (1,52 razy wyższy względem genu referencyjnego) w 48 h od wprowadzenia inokulum C. albicans. Z kolei gen als-3 był wytwarzany w małych ilościach w kohodowli, znajdującej się w punkcie krytycznej kolonizacji. Względny poziom ekspresji genu als-3 wzrósł blisko osiemnaście razy w 48 h kohodowli (Rys. 76).
Kolejnymi analizowanymi genami były ywp1, hwp1 oraz bcr1. Wyniki wykonanych obliczeń przedstawiono na rysunku 77.
143
Rys. 77 Zmiany w relatywnej ekspresji genów ywp1 hwp1 bcr1 względem genu act1 w komórkach drożdży C. albicans w 12 i 24 h kohodowli z fibroblastami linii L929.
Po 24 h od wprowadzenia inokulum C. albicans do komórek fibroblastów zaobserwowano zwiększoną ekspresję genu bcr1. Ponadto w 48 h kohodowli odnotowano blisko niemal ośmiokrotny wzrost ekspresji genu hwp1 (7,42), kodującego adhezynę występującą w strzępkach, która odpowiada za przywieranie komórek grzyba do komórek gospodarza. Poziom ekspresji genu ywp1, którego produkt (białko ywp1) związany jest z dyspersją biofilmu, był nieznacznie podwyższony (1,41 razy wyższy względem genu referencyjnego) w 48 h kohodowli, natomiast w punkcie krytycznej kolonizacji (12 h), poziom jego ekspresji był obniżony (Rys. 77).
144
5 Dyskusja
Rany przewlekłe stanowią istotny problem dla systemów opieki medycznej na całym świecie. Ich leczenie niesie ze sobą ogromne koszty, które ze względu na złożoność wywoływanych przez to schorzenie skutków społecznych, są trudne do oszacowania.
Jednym z głównych czynników prowadzących do opóźnienia procesu gojenia rany jest rozwój biofilmu drobnoustrojów, które kolonizują ranę, ale mogą również wywołać infekcję ogólnoustrojową. Proces rozwoju biofilmu w ranie definiowany i opisywany zgodnie z koncepcją dynamicznego kontinuum zagraża zdrowiu, a w przypadku infekcji ogólnoustrojowej, także życiu pacjenta [192]. Pomimo, iż częstość występowania ran przewlekłych wzrasta, nie ustalono ujednoliconej praktyki diagnostycznej i klinicznej ich rozpoznania. Obecnie klinicyści diagności i lekarze nie mają dostępu do metod umożliwiających szybką, niezawodną i tanią identyfikację, zarówno mikroorganizmów, jak i formy w jakiej one występują w ranie. Jest to szczególnie istotne w stadium określonym jako krytyczna kolonizacja gdyż prawidłowe rozpoznanie czynników infekcji mogłoby by się przyczynić do zatrzymania rozwoju zakażenia, bez poważnych konsekwencji dla zdrowia i życia pacjenta.
Przeciwdziałanie krytycznej kolonizacji rany przez drobnoustroje jest jednym z głównych wyzwań stojących przed środowiskiem medycznym. Wynika to przede wszystkim z rosnącej lekooporności szczepów mikroorganizmów obecnych w środowisku człowieka (w tym szpitalach) oraz horyzontalnego transferu genów oporności, który jest szczególnie ułatwiony w mikrośrodowisku biofilmów, o wysokim zagęszczeniu przestrzennym komórek [108], [121], [157], [192]. Biorąc pod uwagę powyższe przesłanki niezwykle ważne jest poznanie mechanizmów stojących za tworzeniem biofilmów oraz scharakteryzowanie procesów zachodzących w ranach przewlekłych. Wiedza ta może pomóc w rozwoju nowoczesnej diagnostyki medycznej.
Głównym celem niniejszej rozprawy było określenie potencjalnej przydatności techniki spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) do identyfikacji metabolitów, które mogłyby zostać implementowane jako markery, związanej z obecnością biofilmu infekcji ran.
W pierwszym etapie wykonanych badań przeanalizowano proces tworzenia biofilmu w warunkach in vitro przez trzy szczepy drobnoustrojów – Gram-dodatniego ziarniaka gronkowca złocistego Staphylococcus aureus ATCC 6538, Gram-ujemną pałeczkę Escherichia coli ATCC 25922 oraz grzyb drożdżopodobny Candida albicans ATCC
145
10231. W określonych, optymalnych warunkach hodowli, krzywe wzrostu mikroorganizmów były charakterystyczne dla danego gatunku. Z literatury wiadomo, że w fazie zastoju (lag) rozpoczyna się adaptacja mikroorganizmów do nowego środowiska.
W kolejnej fazie, ekspotencjalnego wzrostu następuje wzmożenie metabolizmu oraz szybki przyrost ilości biomasy, spowodowany zarówno intensywną proliferacją komórek, jak i wydzielaniem macierzy zewnątrzkomórkowej ECM. Faza stacjonarna rozpoczyna się, gdy drobnoustroje osiągają określoną gęstość komórek CFU/ml (107 – 108 CFU/ml).
W czasie trwania tej fazy drobnoustroje zaczynają produkować wtórne produkty przemiany materii, charakterystyczne dla danego gatunku. Ze względu na wyczerpywanie źródeł pokarmu i/lub wzrost stężenia produktów przemiany materii, następuje spowolnienie metabolizmu części komórek, pozwalające na długotrwałe przeżycie w danej niszy, uruchomienie mechanizmów Quorum Sensing oraz wydzielanie czynników umożliwiających dyspersję komórek aktywnych metabolicznie ikolonizację kolejnych środowisk. Faza zamierania rozpoczyna się gdy ilość produkowanych metabolitów staje się toksyczna dla komórek, a brak substancji odżywczych prowadzi do śmierci (głodowej) [193].
Na podstawie przebiegu krzywych wzrostu, otrzymanych dla badanych szczepów określono fazę ekspotencjalnego wzrostu i stacjonarną dla bakterii oraz fazę lag, ekspotencjalną i stacjonarną dla C. albicans. Faza zamierania nie została zaobserwowana, gdyż hodowle przerywano w fazie stacjonarnej tj. po 24 h dla bakterii i po 96 h dla drożdżaka. W związku z tym, że wymienione fazy odpowiadają etapom rozwoju biofilmu, wyselekcjonowano punkty czasowe, w których przeprowadzono kolejne analizy pozwalające na scharakteryzowanie tworzonego biofilmu. W tym celu określono zmiany gęstości optycznej w hodowlach (ilość tworzonej biomasy żywej i martwej) i aktywność metaboliczną tworzonego biofilmu. Do określenia ilości tworzonej biomasy wykorzystano szeroko stosowaną w badaniach nad biofilmami, metodę barwienia biomasy biofilmowej fioletem krystalicznym CV, opracowaną w 1985 przez Christensena i współpracowników [194]. Badania zostały przeprowadzone w trzech rodzajach pożywek. Bulion z wyciągiem mózgowo-sercowym (BHI), powszechnie stosowany w badaniach mikrobiologicznych nad biofilmami S. aureus [195], [196], [197] i E. coli [198], [199] zastosowano do hodowli bakterii, a pożywkę Sabourauda do hodowli C. albicans [200]. Trzecią zastosowaną pożywką była pożywka RPMI 1640, suplementowana 10% płodową surowicą bydlęcą.
Zapewnia ona optymalne warunki do wzrostu fibroblastów i została implementowana do prowadzenia kohodowli. Aktywność metaboliczną biofilmów tworzonych przez
146
drobnoustroje określono metodą TTC, opracowaną przez Richards‘a [201]. W czasie wzrostu biofilmów wykonywano również obrazowanie techniką skaningowej mikroskopii elektronowej.
Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że fazie ekspotencjalnego wzrostu mikroorganizmów obserwowano szybki przyrost ilości biomasy, spowodowany poprzez podziały komórek i wydzielanie macierzy zewnątrzkomórkowej ECM. W tej fazie odnotowywano również wysoką aktywność metaboliczną drobnoustrojów. Po osiągnięciu maksymalnej liczby komórek [CFU/ml] hodowle mikroorganizmów wchodziły w fazę stacjonarną. Następowało charakterystyczne dla tego etapu spowolnienie metabolizmu części komórek. Według Ren i in. [193] takie rozwiązanie pozwala komórkom bakterii długotrwałe przeżycie w danej niszy pomimo wyczerpywania się substancji odżywczych i tlenu. Gdy komórki tworzące biofilm nie są już w stanie utrzymać zwartej struktury (m. in z powodu mechanizmu Quorum Sensing) wysyłają sygnały dyspersji, które poprzedzają kolonizację kolejnych nisz [191], [192], [193]. Wartości absorbancji mierzonej przy długości fali λ = 580 nm, powyżej 3,0, dowodzą, że wybrane do badań szczepy mikroorganizmów wykazują wysoką zdolność do formowania biofilmu, co jest zgodne z doniesieniami innych grup badawczych [202], [203]. Uzyskane wyniki badań własnych pozwalają stwierdzić, że w pierwszych etapach tworzenia biofilmów następuje silna proliferacja komórek, do której wymagana jest wysoka aktywność metaboliczna.
Następnie, po wejściu w fazę stacjonarną, ulegała ona obniżeniu. Z tego powodu aktywność metaboliczną można uznać za parametr charakterystyczny dla poszczególnych etapów tworzenia biofilmu przez drobnoustroje.
Wykorzystane w niniejszej rozprawie, obrazowanie mikroskopowe (SEM oraz fluorescencyjne) pozwoliło na opisanie organizacji przestrzennej biofilmów, tworzonych przez badane drobnoustroje. Okazało się ono szczególnie przydatne w odniesieniu do biofilmów tworzonych przez Candida albicans. Na podstawie uzyskanych obrazów, nie tylko potwierdzono, że morfologia komórek w tworzonych biofilmach była typowa dla tego gatunku, ale określono moment w którym nastąpiło zróżnicowanie morfologiczne komórek do formy pseudostrzępek i strzępek. Ułatwiło to identyfikację krytycznego punktu kolonizacji hodowli fibroblastów linii L929 przez biofilm drożdżaka [204], [205], [206].
Przeprowadzona charakterystyka procesu rozwoju biofilmu w wybranych dla badanych szczepów drobnoustrojów warunkach eksperymentalnych umożliwiła rozpoczęcie prac nad opracowaniem autorskiego modelu ich kokultury z komórkami
147
fibroblastów. Do stworzenia modelu komórek przyrannych zastosowano fibroblasty tkanki łącznej linii L929. Wybór linii komórkowej mysich fibroblastów opierał się na bardzo wysokiej powtarzalności, porównywalności i powszechności ich zastosowania w badaniach innych zespołów badawczych [207], [208], [209]. Fibroblasty pełnią istotne funkcje podczas procesu gojenia się ran, a warunki występujące w ich hodowlach doskonale odzwierciedlają warunki w ranie in vivo [210]. Prawidłowe morfologicznie fibroblasty są wydłużone, duże i płaskie. Ich wrzecionowate komórki tworzą charakterystyczne wyrostki, wychodzące z brzegów komórki [210]. Typową morfologię fibroblastów linii L929 uwidoczniono również na zamieszczonych w niniejszej rozprawie zdjęciach.
W pierwszym etapie badań określono wpływ inokulum badanych drobnoustrojów chorobotwórczych, na żywotność fibroblastów w poszczególnych etapach tworzenia biofilmu. Umożliwiło to identyfikacje kluczowego etapu procesu infekcji – punktu krytycznej kolonizacji. Zgodnie z teorią przebiegu zakażenia obejmującą (kontinuum zakażenia), krytyczna kolonizacja to moment w którym drobnoustroje obecne w ranie zaczynają wywierać negatywny wpływ na jej stan. Kluczowa dla tego etapu utrata żywotności fibroblastów linii L929 następowała w 12 h ich kohodowli z gronkowcem Staphylococcus aureus, w 16 h kohodowli z pałeczką okrężnicy Escherichia coli i w 24 h kohodowli z drożdżakiem Candida albicans. Późniejsze osiągnięcie punktu krytycznej kolonizacji w kohodowlach grzyba wynikało z faktu, że jego biofilmy tworzyły się wolniej w porównaniu do biofilmu bakteryjnego. Potwierdziły to również badania innych zespołów badawczych [200], [203], [204]. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że intensywne obumieranie komórek fibroblastów jest związane z osiągnieciem maksymalnej gęstości komórek przez biofilmy bakteryjne oraz z wejściem w fazę stacjonarną przez hodowle C. albicans. Może to oznaczać, że określenie punktu krytycznej kolonizacji w warunkach in vivo będzie kluczowe dla dalszego postępowania z raną. Na tym etapie dojrzały biofilm jest trudny do usunięcia, a jego obecność może powodować intensywne obumieranie komórek gospodarza i powstawanie tkanki martwiczej [37].
W niniejszej rozprawie doktorskiej zamieszczono bogatą dokumentację zdjęciową, wykonaną na różnych etapach prowadzonych kohodowli. Na podstawie jej analizy dowiedziono, że w badaniach morfologii komórek fibroblastów linii L929, kolonizowanych przez biofilmy poszczególnych drobnoustrojów, pomocnym narzędziem może być skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM). Natomiast do określenia zmian
148
w żywotności komórek fibroblastów (np. przerwania błony cytoplazmatycznej) bardziej odpowiednia jest mikroskopia konfokalna, w połączeniu z barwieniem fluorescencyjnym.
Wyniki przedstawione w niniejszej rozprawie pozwoliły na obserwacje wysokiej zmienności procesu tworzenia biofilmu przez poszczególne gatunki drobnoustrojów, w warunkach eksperymentalnych odzwierciedlających część parametrów środowiska rany przewlekłej. Przebieg infekcji w czasie różnił się dla wszystkich trzech zastosowanych patogenów. Kluczowym punktem zainteresowania zgodnie z obowiązującym konsensusem dotyczącym przebiegu infekcji rany była identyfikacja czasu po którym dochodzi do krytycznej kolonizacji danej niszy środowiskowej przez patogen. Największą zjadliwość wykazał gronkowiec złocisty Staphylococcus aureus dla którego punkt krytycznej kolonizacji został osiągnięty najszybciej tj. w 12 h kohodowli z fibroblastami. Z kolei podczas kontaminacji fibroblastów drożdżakiem Candida albicans obserwowano najlepszą przeżywalność komórek linii L929, a punkt krytycznej kolonizacji został osiągnięty najpóźniej (24 h kohodowli). Należy jednak pamiętać, że w warunkach in vivo, ze względu na złożoność środowiska rany i odpowiedź układu odpornościowego, proces infekcji może być jeszcze bardziej opóźniony, względem danych uzyskanych w warunkach in vitro.
Dowiedziono również, że środowisko istotnie wpływa na dynamikę wzrostu oraz proces tworzenia biofilmu drobnoustrojów. Każda z faz rozwoju tej struktury charakteryzuje się określoną, zmienną aktywnością metaboliczną mikroorganizmów, co może mieć istotny wpływ na progresję infekcji w ranach. Zmiany w aktywności metabolicznej świadczą o heterogeniczności fenotypowej wewnątrz biofilmu i stochastycznemu powstaniu populacji komórek przetrwalnych (ang. persister cells). Nie są one mutantami lecz rodzajem komórek o „dzikim” (ang. wild), fenotypie, które są zdolne tolerować bardzo wysokie stężenia antybiotyków. Niestety oznacza to, że stosowane do walki z biofilmami rany, środki przeciwdrobnoustrojowe będą zabijały wyłącznie komórki planktonowe oraz aktywne metabolicznie komórki, pozostawiając komórki przetrwale nienaruszone. Powstanie „peristers” jest indukowane przez różne czynniki stresowe i środowiskowe takie jak: niedobór składników pokarmowych, stres oksydacyjny, wodny, cieplny itp. Ponieważ zmiany fenotypowe mogą ulec odwróceniu (np. w chwili przerwania terapii antybiotykowej przez pacjenta) komórki przetrwalne mogą reaktywować się ze stanu uśpienia oraz odbudować całą strukturę biofilmu. Efektem tego będzie nawrót zakażenia [271]. Jest to kolejny dowód wskazujący na to, jak istotne jest zidentyfikowanie formy występowania mikroorganizmów jeszcze przed wystąpieniem krytycznej kolonizacji.
149
Celem opracowania ko-kultury biofilmów z komórkami mysich fibroblastów tkanki łącznej L929, będącymi modelem komórek przyrannych było przeprowadzenie analiz metabolicznych obejmujących identyfikację metabolitów wytwarzanych zewnątrzkomórkowo (tzw. „śladu metabolicznego”) i wewnątrzkomórkowowo (tzw.
„odcisku palca”).
Metabolomika biofilmów oparta na badaniach wykonywanych z użyciem spektroskopii rezonansu magnetycznego NMR polega na kompleksowym podejściu do analizy próbek metabolomicznych, które obejmują protokoły przygotowania próbek i zebrania danych jakościowych i ilościowych [211]. Sukces analizy metabolomicznej w dużej mierze zależy od wykonania każdego kroku w wysoce kontrolowany i jednolity sposób. Różnice w zebranych widmach NMR powinny wynikać ze zmienności biologicznej, istniejącej między próbkami zawierającymi metabolity komórkowe, a nie ze sposobu ich przygotowania. Z tego powodu ważne jest by ekstrakcja metabolitów z lizowanych komórek następowała szybko i w jak najniższych temperaturach.
Krytycznym momentem w przygotowaniu próbki szybkie i skuteczne „wygaszenia”
wszystkich aktywności enzymatycznych i biologicznych w analizowanych komórkach [150], [152]. W protokole przygotowania próbek, opisanym w niniejszej rozprawie, wykorzystano schłodzony do –20 ⁰C roztwór 96% metanolu z wodą dejonizowaną.
Alkohol ten jest powszechnie stosowany ze względu na niską temperaturę zamarzania i minimalną toksyczność w porównaniu z innymi rozpuszczalnikami organicznymi [212].
W zebranych widmach NMR opisano piki charakterystyczne dla metabolitów wewnątrzkomórkowych m.in. glukozy, pirogronianu i fruktozo-6-fosforanu, które cechuje szybki wskaźnik rotacji [mM/s]. Oznacza to, że przyjęta procedura była poprawna i pozwoliła na właściwą identyfikację metabolitów na wszystkich etapach wzrostu biofilmów. Należy bowiem zaznaczyć, że wskaźnik rotacji wyżej wymienionych metabolitów jest szczególnie wysoki dla rosnących mikroorganizmów (pierwsza faza tworzenia biofilmu). Dla przykładu glukoza w cytozolu Saccharomyces cerevisiae jest konwertowana z szybkością około 1 mM/s, podczas gdy szybkość obrotu ATP i ADP mieści się w zakresie 1,5 do 2,0 mM/s [212]. W procedurze przygotowania próbek do analizy metabolomicznej ważne jest również zastosowanie odpowiedniej metody ekstrakcji metabolitów, tak by nie spowodować ich degradacji lub modyfikacji (enzymatycznej, chemicznej lub fizycznej). Na podstawie wysokiej powtarzalności wyników stwierdzono, że zaproponowany w niniejszej rozprawie doktorskiej protokół oraz zastosowanie
150
koncentratora próżniowego do ekstrakcji, pozwala na wydajne pozyskanie metabolitów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych z biofilmów bakteryjnych i kohodowli.
Techniki spektroskopii rezonansu magnetycznego NMR pozwalają na identyfikację związku chemicznego oraz struktury chemicznej metabolitu. Co ważne, intensywność piku w zarejestrowanych widmach jest wprost proporcjonalna do stężenia metabolitu. Jednym z najbardziej krytycznych problemów związanych z podejściami -omicznymi, stosowanymi w odniesieniu do biofilmów jest to, że uzyskane dane pochodzą od całej populacji komórek. Jak widomo biofilm jest z definicji niejednorodny, co oznacza, że skład metabolitów pochodzących z komórek bakteryjnych, może się znacznie różnić w zależności od miejsca (lokalizacji w obrębie biofilmu), jak i czasu (etapu rozwoju biofilmu) [213].
Wykorzystując technikę NMR do analizy podłoży pohodowlanych z hodowli biofilmów S. aureus, E. coli i C. albicans oraz ich kohodowli z fibroblastami linii L929, w sumie zidentyfikowano 31 różnych metabolitów wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych.
Biorąc pod uwagę, że metabolom komórkowy może zawierać ponad tysiące metabolitów, w zakresie stężeń rzędu 7 – 9 (pikomoli do milimoli) jest to oczywiście niewielki procent rzeczywistej ich ilości obecnych w hodowlach [214]. Ponieważ analiza metabolomiczna opiera się na określeniu jak podobne lub jak różne są widma NMR pomiędzy badanymi grupami próbek, nie ma potrzeby przypisywania każdego piku do określonego związku oraz identyfikacji ilościowej wszystkich metabolitów obecnych w próbce [215]. Z analizy widm NMR można jednak uzyskać dodatkowe informacje, dotyczące np. stopnia wykorzystania substancji odżywczych z podłoża przez rosnące komórki. Dla przykładu porównanie widma 1H NMR zarejestrowanych dla pożywki pohodowlanej fibroblastów linii L929 po 2 h i 24 h hodowli pozwoliło stwierdzić, że największy spadek intensywności sygnału odnotowano dla glukozy. Ponieważ ten monosacharyd jest najbardziej podstawowym źródłem energii dla rosnących komórek fibroblastów można na tej podstawie wnioskować, że ich hodowla przebiegała bez zakłóceń.
Analiza porównawcza widm NMR pozwoliła na wyróżnienie metabolitów zewnątrzkomórkowych, występujących w podwyższonym stężeniu (większa intensywność piku) w czasie krytycznej kolonizacji monowarstwy fibroblastów linii L929 przez gronkowca złocistego, jeden z badanych szczepów mikroorganizmów patogennych. Jak wykazano w pracy własnej w czasie fazy dojrzewania biofilmu S. aureus obserwujemy podwyższone stężenie pirogronianu oraz 2-hydroksy-3-metyloglutaranu [216]. Jedyną z najistotniejszych zmienności adaptacyjnych gronkowca złocistego jest zdolność do
151
przeżycia zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych Z literatury wiadomo, że u tego gatunku katabolizm cukrów może być przeprowadzany trzema szlakami biochemicznymi – Embdena-Meyerhofa-Parnasa (EMP), pentozowo-fosforanowym oraz cyklem kwasów trójkarboksylowych TCA [217]. Oznaczone w badanych próbkach, podwyższone stężenie pirogronianu może świadczyć o tym, że w fazie dojrzewania biofilmu S. aureus jego metabolizm oparty jest o ścieżkę glikolizy. Proces ten zachodzi w warunkach tlenowych i polega na przekształcaniu jednej cząsteczki glukozy do dwóch cząsteczek pirogronianu. Na każdą cząsteczkę zużytej glukozy redukowane są do NADH dwie cząsteczki NAD+. Ze względu na dużą ilość generowanego w tym procesie ATP, podwyższone stężenie pirogronianu prowadzi do nadregulacji szlaków komórkowych, promujących tworzenie biofilmu u gronkowca złocistego [218, 219]. Natomiast w warunkach wzrostu mikrotlenowego lub beztlenowego większość pirogronianu jest redukowana do kwasu mlekowego. By zmniejszyć akumulację kwasów organicznych w komórce, możliwe jest również przeniesienie pirogronianu na szlak butanodiolowy, a następnie utlenianie NADH z powrotem do NAD+. Obserwuje się wówczas wzrost aktywności enzymów glikolitycznych, zwiększoną syntezę enzymów fermentujących (np.
dehydrogenaz mleczanowych LDH1 i LDH2, dehydrogenazy alkoholowej ADH, dekarboksylazy α-acetomleczanowej BudA1, syntazy acetylomleczanowej BudB), przy jednoczesnym spadku aktywności enzymów cyklu kwasów trikarboksylowych (oddychanie tlenowe). Następuje także nagromadzenie produktów fermentacji, takich jak:
mleczan i octan [220], [221]. Ponieważ zysk energetyczny z przemian beztlenowych jest mniejszy niż tlenowych, następuje obniżenie tempa tworzenia biofilmu [220].
Potwierdzają to również wyniki badań własnych. W czasie krytycznej kolonizacji (czyli 12 h od kontaminacji fibroblastów linii L929 przez S. aureus) na zarejestrowanych widach 1H NMR identyfikowany jest octan, mleczan (jonowa forma kwasu mlekowego) oraz mrówczan. Metabolity te wydzielane są tylko w kohodowlach. Można przypuszczać, że mleczan, który powstaje z pirogronianu pochodzi z głębszych warstw biofilmu, w których występują warunki beztlenowe [222]. Z kolei octan, może być wydzielany przez część aktywnych metabolicznie komórek, znajdujących się w górnych częściach biofilmu. Przy braku glukozy jako źródła węgla i przy umiarkowanym dostępie do tlenu, mleczan jest przekształcany w octan. Znalazło to potwierdzenie w otrzymanych wynikach badań. Po 24 h kohodowli fibroblastów i S. aureus oprócz mleczanu i octanu, wydzielany był również mrówczan oraz glukozo-6-fosforan. Glukozo-6-fosforan to metabolit, który może pochodzić zarówno z biofilmów bakteryjnych, jak i z komórek fibroblastów, które uległy
152
śmierci komórkowej [223]. Natomiast akumulacja mrówczanu może być skutkiem długotrwałego utrzymywania się warunków beztlenowych oraz nagromadzenia się produktów rozpadu fibroblastów [224]. Dopełnieniem badań nad metabolizmem gronkowca złocistego i fibroblastów linii L929 na etapie krytycznej kolonizacji była analiza NMR metabolitów wewnątrzkomórkowych. Wykazano podwyższony poziom metabolitów takich jak: kwas mlekowy, glukoza, kwas mrówkowy metanol, pirogronian i trimetyloamina. Wśród nich kwas mrówkowy, pirogronian i trimetyloamina występowały tylko w próbkach pochodzących z kohodowli. Kwas mrówkowy mógł pochodzić z komórek fibroblastów, gdyż jest jednym z produktów α-oksydacji kwasów tłuszczowych [225], [226]. Natomiast trimetyloamina może być pochodną choliny obecnej w pożywce RPMI 1640 [227]. Metabolitem charakterystycznym dla rozwoju biofilmu S. aureus była dimetyloamina, a dla fibroblastów – kwas izowalerianowy.
Na podstawie analizy NMR metabolitów zewnątrzkomórkowych, wytwarzanych przez dojrzały biofilm E. coli (16 h hodowli), stwierdzono wzrost stężenia octanu oraz kwasu aminomasłowego. Z literatury przedmiotu wiadomo, że octan jest regulatorem metabolizmu glukozy i wpływa na ekspresję genów cyklu glikolitycznego oraz kwasów trójkarboksylowych. Jego wytwarzanie jest wynikiem braku biochemicznego mechanizmu umożliwiającego gromadzenie Acetylo-CoA w komórkach E. coli [228], [229]. W czasie ekspotencjalnego wzrostu biofilmu, Acetylo-CoA jest przekształcany w acetylofosforan AcP przez fosfotransacetylazę (Pta), a następnie przez kinazę octanową (AckA) tworzony jest octan [230]. Szlak ten może przebiegać w odwrotnym kierunku, co oznacza, że z octanu powstawać może acetylo-CoA [231]. Na podstawie badań własnych udało się dowieść, że na etapie krytycznej kolonizacji fibroblastów przez bakterie E. coli, następuje spadek stężenia glukozy (mniej intensywne piki na widmach 1H NMR) i wzrost stężenia octanu (bardziej intensywne piki na widmach 1H NMR). Ubytek glukozy najprawdopodobniej wynika z intensywnych procesów namnażania się komórek E. coli, w fazie poprzedzającej fazę dojrzewania biofilmu. Natomiast powstawanie octanu (w wyniku niecałkowitego utleniania cukrów) jest najprawdopodobniej skutkiem aktywacji cyklu kwasu cytrynowego (TCA) w warunkach ograniczonej (dla części komórek biofilmu) dostępności tlenu [232]. Analizujące widma 1H NMR metabolitów wewnątrzkomórkowych, wytwarzanych w fazie krytycznej kolonizacji fibroblastów przez E. coli, zidentyfikowano tylko jeden niskocząsteczkowy metabolit wewnątrzkomórkowy, dla którego intensywność sygnałów była podwyższona, w porównaniu do intensywności
153
sygnałów w widmach zebranych z hodowli biofilmu E. coli bez obecności fibroblastów.
Była to dimetyloamina.
Zidentyfikowano również metabolity wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe wytwarzane przez kokultury fibroblastów i Candida albicans w fazie krytycznej kolonizacji. Na tym etapie hodowli analiza metabolitów zewnątrzkomórkowych wykazała mniej intensywne sygnały pochodzące od glukozy. Ponieważ najprawdopodobniej w kohodwoli występowały wówczas niedoboru tlenu, a glukoza przekształcana była do kwasu mlekowego, obecność na widmie NMR sygnału, pochodzącego od mleczanu dowodzi, że tworzony przez C. albicans biofilm był strukturą dojrzałą. Z literatury przedmiotu wiadomo, że gdy C. albicans wykorzystuje mleczan jako źródło węgla, jego ściana komórkowa charakteryzuje się mniejszą elastycznością, co zwiększa adhezję do komórek gospodarza [233], [234]. Zmiany metaboliczne zachodzące w biofilmie C. albicans, będące adaptacją do warunków środowiskowych, panujących w niszy rany powodują, że drożdżak wykazuje większą odporność na stres osmotyczny oraz środki przeciwgrzybicze (amfoterycynę B i kaspofunginę) [235]. Na podstawie analizy porównawczej widm 1H NMR stwierdzono, że kwas 4-hydroksybenzoesowy i nikotynowy to metabolity wewnątrzkomórkowe, które były wytwarzane tylko w czasie kohodowli biofilmu drożdżaka Candida albicans z fibroblastami. W tych samych warunkach z większą intensywnością tworzona była sarkozyna oraz glicerol. Sarkozyna jest fizjologicznym metabolitem będącym pochodną metylową glicyny, wytwarzanym przy udziale N-metylotransferazy glicyny lub dehydrogenazy dimetyloglicyny [233]. Nieznany jest jednak jej rola w tworzeniu biofilmów Candida albicans [234]. Również synteza glicerolu w komórkach C. albicans może być wynikiem adaptacji do warunków stresu osmotycznego. Stwierdzono, że stężenie glicerolu może być nawet pięciokrotnie większe w komórkach biofilmu, niż w komórkach planktonicznych. Jego wpływ na tworzenie biofilmu ma charakter regulacyjny, ponieważ jest niezbędny do ekspresji wielu genów związanych z biofilmem [234].
Uzyskane na podstawie analiz metabolicznych wyniki pozwalają wnioskować, że pewna część metabolitów, identyfikowanych podczas całego czasu trwania infekcji bakteryjnej, może pochodzić zarówno od drobnoustrojów, jak i komórek odpowiedzialnych za gojenie się rany. Przykładem takiego metabolitu był mleczan.
Obserwacja ma ogromne znaczenie dla rozwoju metabolomiki, jako narzędzia diagnostycznego infekcji biofilmowych ran przewlekłych. Należy zwrócić uwagę, że na wczesnym etapie kolonizacji fibroblastów gronkowcem złocistym – octan i mleczan są
154
charakterystycznymi metabolitami wytwarzanymi zewnątrzkomórkowo. Natomiast dla rozwiniętej infekcji będą to: mleczan, octan, mrówczan i glukozo-6-fosforan. Dla kokultur fibroblastów i E. coli metabolitami markerowymi mógłby być octan i hydroksywalerian.
Natomiast w kohodowlach C. albicans – mleczan i kwas acetooctowy. Z kolei jako markerowe metabolity wewnątrzkomórkowe dla kohodowli fibroblastów linii L929 należy zaliczyć: kwas mrówkowy, pirogronian i trimetyloaminę (S. aureus), dimetyloaminę (E. coli) oraz kwas 4-hydroksybenzoesowy i kwas nikotynowy (C. albicans).
Badania metabolomiczne uzupełniono o analizy genetyczne ekspresji genów, zaangażowanych w oddziaływania patogen-gospodarz. Ponieważ wykazano, że rozwój infekcji patogennymi drobnoustrojami, powoduje stopniowy spadek żywotności komórek fibroblastów linii L929, to istnieje prawdopodobieństwo, że mikroorganizmy kolonizujące ranę zwiększają ekspresję genów odpowiedzialnych za zaprogramowany genetycznie proces śmieci komórkowej – apoptozę. Proces ten w komórkach eukariotycznych (do których należą fibroblasty), polega na obkurczeniu się komórek i kondensacji cytoplazmy oraz zmianach na powierzchni komórek. Główny udział w apoptozie biorą enzymy z rodziny proteaz cysteinowo-aspartylowych – kaspazy. Wyróżniamy dwie grupy tych enzymów, różniące się aktywnością. Za uruchomienie kaskady zdarzeń prowadzących do śmierci komórkowej, odpowiadają kaspazy inicjatorowe, natomiast kaspazy efektorowe biorą udział w katalizie rozpadu struktur komórkowych [236]. W niniejszej rozprawie doktorskiej przebadano ekspresję genów kodujących incjatorową kaspazę 9 (casp-9) oraz efektorową kaspazę 3 (casp-3). Ponadto przeanalizowano ekspresję genów kodujących białka apoptyczne (BAX i bcl-2), o antagonistyczny względem siebie wpływie na przebieg procesu apoptozy [236], [237], [238], [239], [240], [241]. Natomiast jako wskaźnik stanu zapalnego, który towarzyszy infekcji bakteryjnej [242], wybrano gen kodujący interleukinę 6 (il-6). Analizy genetyczne dla monohodowli testowanych drobnoustrojów oraz kohodowli znajdujących się w czasie krytycznej kolonizacji przeprowadzono metodą łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym RT-PCR. Po dwunastogodzinnej kohodowli fibroblastów z gronkowcem złocistym nie zaobserwowano podwyższonej ekspresji genów kodujących kaspazę 3 i 9. Może być to związane z oznaczoną w badaniach własnych nadekspresją genu kodującego białko bcl-2 oraz nadekspresją genu kodującego interleukinę 6. Taki profil ekspresji genów zaangażowanych w apoptozę potwierdzają badania Xu i in. [242]. W komórkach makrofagów linii RAW264.7 zaobserwowali oni podwyższoną ekspresję białka bcl-2, przy niskiej ekspresji białka BAX i cytokin prozapalnych, w tym il-6 [242]. Badania prowadzone przez inne zespoły
155
badawcze nad indukcją apoptozy przez oportunistyczny patogen Staphylococcus aureus w komórkach eukariotycznych potwierdzają hipotezę, że w czasie kolonizacji tkanek przez biofilm następuje indukcja procesów apoptotycznych w rożnych typach komórek [237]-[252]. Na podstawie wyników badań przeprowadzonych na komórkach nabłonka sutka bydlęcego MAC-T, zainfekowanych tą bakterią stwierdzono, że indukcja śmierci komórkowej następuje poprzez zwiększoną aktywność kaspaz 3 i 8 oraz cytokin prozapalnych [244]. Ponadto obecność drobnoustrojów sprzyja przepuszczalności błony zewnętrznej mitochondriów poprzez wzrost ekspresji białka BAX, kontrolującego ten proces [245], [246]. Apoptoza może być indukowana nie tylko w komórkach znajdujących się w miejscu infekcji, ale również w napływających komórkach układu odpornościowego, odpowiedzialnych za zwalczanie infekcji [244]-[248]. Sugerowany mechanizm opisany dla interakcji makrofagów i neutrofili oraz C. albicans, opiera się na założeniu, że grzyb wydziela białka wywołujące inaktywację białek zapobiegających apoptozie (antyapoptotycznych) u gospodarza, w tym bcl-2. Bez „białek opiekuńczych” komórki ulegają apoptozie, a w hodowlach in vitro obserwuje się znaczny spadek ich żywotności [252]. Jeszcze inne podejście prezentuje Häcker i in. dowodząc, że za indukcję apoptozy, oprócz szlaku kaspaz odpowiada LPS [232].
Aktywację procesu apoptozy poprzez geny kodujące kaspazy potwierdzają wyniki analiz wykonane dla pozostałych testowanych organizmów – Candida albicans i E. coli.
W 48 h kohodowli fibroblastów z biofilmem C. albicans oraz w 16 h (punkt krytycznej kolonizacji) fibroblastów L929 i bakterii E. coli, stwierdzono podwyższony poziom ekspresji genów kodujących kaspazę inicjatorową 9 9) i kaspazę wykonawczą 3 (cas-3) oraz białek blc-2 i BAX. Jak podaje Villar i in. infekcja C. albicans stymuluje szlaki sygnałowe prowadzące do apoptozy w komórkach nabłonka jamy ustnej przez aktywację kaskady kaspaz [251]. W tych samych badaniach wykazano, że do aktywacji apoptozy w komórkach gospodarza konieczny jest bezpośredni kontakt z komórkami grzyba (biofilmem). Warto zauważyć, że analizując obrazy z kohodowli fibroblastów linii L929 i testowanych mikroorganizmów, wykonane z wykorzystaniem mikroskopu konfokalnego, martwym komórkom fibroblastów zawsze towarzyszył biofilm, o znacznym stopniu dojrzałości.
Kolonizacja bakteryjna rozpoczyna się w wyniku rozpoznawania przez adhezyny bakteryjne, obecne na powierzchni komórek i umożliwiające bezpośrednią interakcje patogen-gospodarz. Jak wiadomo z literatury zachowanie ciągłości adhezji oraz dostosowanie się do panujących warunków środowiskowych, jest niezbędne do