Kokultury komórek fibroblastów z drobnoustrojami tworzącymi biofilmy

92

Na podstawie analizy obrazów, uzyskanych techniką skaningowej mikroskopii elektronowej, stwierdzono, że w rozwoju biofilmu C. albicans można wyróżnić trzy fazy (Rys. 26 – 28). W fazie pierwszej, trwającej od momentu inokulacji hodowli do ok. 8 h, obserwowano adhezję komórek do podłoża. Analiza morfologii komórek C. albicans wykazała, że miały one kuliste kształty o regularnych krawędziach, typowe dla tego gatunku (Rys. 26 A, B). W fazie przejściowej, która rozpoczynała się od ok. 24 h hodowli obserwowano przyrost liczby komórek drożdży oraz ich większe zróżnicowanie morfologiczne. Pojawiły się komórki wydłużone, które tworzyły pseudostrzępki (Rys. 27 A, B). W kolejnej fazie rozpoczynającej się od 48 h hodowli, obserwowano dalszy przyrost ilości komórek drożdży oraz postępujące różnicowanie. Oprócz pseudostrzępek pojawiły się w pełni wykształcone strzępki, które tworzyły mocno zagęszczoną strukturę maty (Rys.

28 A, B).

4.2 Kokultury komórek fibroblastów z drobnoustrojami tworzącymi

93

Na podstawie analizy uzyskanych obrazów potwierdzono prawidłową morfologię komórek fibroblastów linii L929. W 16 h hodowli większość komórek silnie przylegała do podłoża. Analizowane komórki miały wrzecionowaty, typowy dla fibroblastów, kształt.

Natomiast nieliczne komórki o kulistym kształcie były najprawdopodobniej w fazie podziału komórkowego.

Na rysunku 30 przestawiono wyniki analizy żywotności komórek z zastosowaniem czerwieni obojętnej (rozdział 3.3.1) w 24 h hodowli. Żywotność komórek przedstawiono jako zależność pomiędzy czasem hodowli w pełni konfluentnej monowarstwy komórek, a absorbancją mierzoną przy długości fali λ = 540 nm.

Rys. 30 Zależność pomiędzy czasem hodowli w pełni konfluentnej monowarstwy komórek fibroblastów linii L929, a absorbancją przy długości fali λ = 540 nm.

Na podstawie analizy rysunku 30 stwierdzono, że komórki fibroblastów linii L929 zachowują wysoką żywotność przez cały czas trwania hodowli.

Proces kohodowli konfluentnej monowarstwy komórek fibroblastów i badanych drobnoustrojów prowadzono zgodnie z metodyką opisaną w rozdziale 3.3. W celu identyfikacji punktu czasowego, w którym kolonizacja hodowli fibroblastów przez drobnoustroje, powoduje wyraźny spadek ich żywotności (tzw. punkt krytycznej kolonizacji), określano żywotność drobnoustrojów oraz komórek fibroblastów w kohodowli. Obrazowanie kokultur wykonywano z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (rozdział 3.2.4) oraz konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (rozdział 3.3.2).

94

Na rysunku 31 A, B zestawiono wyniki analizy żywotności kokultury fibroblastów i gronkowca złocistego S. aureus prowadzonej przez 24 godziny.

Rys. 31 Analiza żywotności kokultury fibroblastów i S. aureus w czasie 24 godzin kohodowli, A – krzywa wzrostu S. aureus B– żywotność komórek fibroblastów linii L929, czerwony kwadrat oznacza punkt krytycznej kolonizacji.

Na podstawie analizy krzywych wzrostu przedstawionych na rysunku 31, określono punkt krytycznej kolonizacji w 12 godzinie prowadzenia kokultury fibroblastów z biofilmem S. aureus. W 12 godzinie hodowli liczba komórek gronkowca osiągnęła swoje maksimum (4,28 × 10⁹ CFU/ml), a liczba żywych (posiadających nieuszkodzoną błonę komórkową) gwałtownie zaczęła spadać.

A A

B A

95

Po określeniu punktu czasowego, w którym doszło do krytycznej kolonizacji monowarstwy fibroblastów przez gronkowca złocistego S. aureus przeprowadzono dalsze analizy z zastosowaniem skaningowej mikroskopii elektronowej oraz mikroskopii konfokalnej. Na rysunku 32 przedstawiono wynik obrazowania kohodowli fibroblastów i komórek gronkowca złocistego S. aureus w krytycznym punkcie kolonizacji (12 h kohodowli).

Na podstawie analizy zdjęć SEM stwierdzono, że w 12 h kohodowli obserwuje się nieliczne komórki fibroblastów linii L929, pokryte silnie przylegającymi do ich powierzchni agregatami komórek gronkowca złocistego. (Rys. 32 A, B).

Na rysunku 33 przedstawiono obrazowanie kokultur fibroblastów linii L929 z gronkowcem złocistym, wykonane z zastosowaniem mikroskopii konfokalnej w 2, 8, 12 i 24 godzinie od wprowadzenia inokulum bakteryjnego.

Rys. 32 Kokultura gronkowca złocistego z fibroblastami w punkcie krytycznej kolonizacji (12 h hodowli), powiększenie A – 2 500, B –10 000 razy.

A B

96

Rys. 33 Obrazowanie modelu infekcji rany przewlekłej in vitro powodowanej przez gronkowca złocistego S. aureus w 2, 8, 12 i 24 h od rozpoczęcia kohodowli z fibroblastami linii L929.

A: barwnik Cell Trace Violet^®, B: Syto 9^®, C: jodek propidyny D: nałożenie barwników. Kolor zielony – żywe komórki, czerwony i fioletowy –martwe komórki, niebieski – komórki fibroblastów.

Na podstawie analizy obrazów z kohodowli fibroblastów i gronkowca złocistego, przedstawionych na rysunku 33, uzyskanych z zastosowaniem trzech barwników fluorescencyjnych (fluoroforów), w opracowanym modelu rany przewlekłej in vitro możliwa była identyfikacja, zarówno bakterii, jak i proliferujących komórek fibroblastów linii L929 oraz określenie ich żywotności.

Komórki fibroblastów były widoczne jako duże, wrzecionowate kształty, a komórki gronkowca złocistego jako małe, kuliste pojedyncze komórki lub większe ich agregaty o nieregularnym kształcie. Charakterystyczny niebieski kolor fibroblastów (po barwieniu barwnikiem CellTrace Violet TM^®) umożliwił odróżnienie ich komórek od komórek

A: B: C: D:

Skala-20µM

97

gronkowca (Rys. 33). Barwienie barwnikami Syto 9^® i jodkiem propidyny pozwoliło na identyfikację żywych komórek, które barwiły się na kolor zielony oraz komórek martwych fluoryzujących w kolorach czerwonym i fioletowym. Na podstawie analizy zmiany intensywności fluorescencji, pomiędzy komórkami pochodzącymi z różnych etapów kohodowli, stwierdzono, że wraz z wzrostem biofilmu gronkowca złocistego następuje spadek żywotności komórek fibroblastów. Świadczy o tym rosnący sygnał od jodku propidyny i większa liczba komórek fibroblastów w kolorze czerwonym (Rys. 33).

W drugiej godzinie kohodowli obu typów komórek obserwowano wyłącznie komórki fibroblastów będące w prawidłowym stanie fizjologicznym, o czym świadczy brak sygnału fluorescencji od jodku propidyny. Na zdjęciach wykonanych w 8 godzinie kohodowli (w reprezentatywnym polu widzenia) odnotowano tylko jedną komórkę wybarwioną jodkiem propidyny na kolor czerwony. Natomiast na zdjęciach wykonanych w 24 h kohodowli większość komórek fibroblastów obserwowanych w polu widzenia jest uszkodzona (czerwony sygnał od jodku propidyny) (Rys. 33).

Wzrost biofilmu gronkowca potwierdza natomiast intensywny sygnał od barwnika Syto 9® i pojawienie się dużej ilości zielonych punktów na zdjęciach wykonanych w 12 h kohodowli (Rys. 33). Podsumowując, obrazowanie przeprowadzone dla opracowanego modelu infekcji rany przewlekłej za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, potwierdziło dynamikę rozwoju infekcji gronkowca złocistego w obrębie monowarstwy fibroblastów. Ponadto stwierdzono, że punkt krytyczny tego procesu następuje w 12 godzinie od czasu wprowadzenia inokulum gronkowca.

W kolejnym etapie, w podobny do opisanego powyżej sposób przeprowadzono analizę żywotności kohodowli fibroblastów linii L929 i pałeczki okrężnicy E. coli oraz drożdżaka C. albicans. Na rysunku 34 A, B przedstawiono wyniki analizy żywotności kokultury fibroblastów i pałeczki okrężnicy E. coli.

98

Rys. 34 Analiza żywotności kokultury fibroblastów i E. coli w czasie 24 godzin kohodowli, A – krzywa wzrostu E. coli B – żywotność komórek fibroblastów linii L929, czerwony kwadrat oznacza punkt krytycznej kolonizacji.

Na podstawie analizy rysunku 34 stwierdzono, że krytyczna kolonizacja monowarstwy fibroblastów przez bakterie E. coli, następuje w 16 godzinie ich kohodowli.

Liczba komórek E. coli osiąga swoje maksimum 3,09 × 10⁹ (CFU/ml), a populacja A

B

99

nieuszkodzonych, żywych komórek fibroblastów jest 38,9 razy mniejsza niż w chwili rozpoczęcia hodowli.

Na rysunku 35 przedstawiono wynik obrazowania kohodowli fibroblastów i komórek pałeczki okrężnicy w 6 h kohodowli, a na rysunku 36 w krytycznym punkcie kolonizacji (16 h kohodowli).

C

A B

D

Rys. 35 Kohodowla E. coli i fibroblastów linii L929 w 6 h od rozpoczęcia kohodowli, powiększenie: A – 500, B – 1 000, C i D – 5 000 razy.

100

Rys. 36. Kohodowla E. coli i fibroblastów L929 w punkcie krytycznej kolonizacji (16 h kohodowli), powiększenie: A – 500, B –1 000, C i D –5 000 razy.

Na podstawie analiz zdjęć wykonanych w 6 godzinie hodowli fibroblastów linii L929 i E. coli, stwierdzono, że w polu widzenia mikroskopu, można zaobserwować drobne skupiska pałeczek, przylegające do komórek fibroblastów o prawidłowym kształcie (Rys.

35). W 16 h kohodowli obserwowano znacząco mniejszą liczbę komórek fibroblastów oraz zmiany w ich morfologii. Powierzchnia komórek fibroblastów ulegała wyraźnemu pofałdowaniu, a ich kształt przestał być regularny. Ponadto stwierdzono znaczący wzrost liczby komórek E. coli (Rys. 36).

Chcąc potwierdzić dane uzyskane w ramach analiz ilościowych oraz obrazowania SEM wykonano barwienie różnicujące komórki żywe i martwe, i zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej, co przedstawiono na rysunku 37.

Na rysunku 37 przedstawiono wyniki obrazowania kokultur fibroblastów linii L929 i pałeczki okrężnicy, wykonanego z zastosowaniem mikroskopii konfokalnej w 2, 8 i 16 godzinie od wprowadzenia inokulum bakterii.

A B

C D

101

Na podstawie analizy zdjęć wykonanych w 2 h i w 8 h kohodowli dla opracowanego modelu infekcji rany przewlekłej in vitro powodowanej przez pałeczkę okrężnicy E. coli, stwierdzono prawidłowo proliferujące komórki fibroblastów linii L929. Były one zabarwione na kolor niebieski (Rys. 37). Na zdjęciach wykonanych w drugiej godzinie prowadzonej kohodowli (w polu widzenia mikroskopu) zaobserwowano tylko żywe komórki fibroblastów zabarwione na kolor zielony przez Syto 9^® (brak sygnału z barwienia jodkiem propidyny). Nie stwierdzono natomiast komórek bakterii, co może świadczyć o tym, że ich, liczba była na tyle mała, że nie zostało to uchwycone w polu widzenia (Rys. 37) lub komórki planktoniczne zostały usunięte w czasie preparatyki próbek. Na zdjęciach wykonanych w 8 godzinie kohodowli fibroblastów i E. coli zaobserwowano tylko jedną martwą komórkę fibroblastu, zabarwioną na kolor czerwony

Czas od inokulacji [h]

D: Nałożenie barwników C: Jodek propidyny

B: Syto 9^® A: Cell Trace Violet^®

2

8

16

Skala-20µM Rys. 37 Obrazowanie modelu infekcji rany przewlekłej in vitro, powodowanej przez pałeczkę okrężnicy E. coli w 2, 8, i 16 h od rozpoczęcia kohodowli z fibroblastami linii L929. A –barwnik Cell Trace Violet^®, B – Syto 9^®, C – jodek propidyny D – nałożenie barwników. Kolor zielony – żywe komórki, czerwony i fioletowy –martwe komórki, niebieski – komórki fibroblastów.

102

przez jodek propidyny (Rys. 37). Natomiast na zdjęciach wykonanych w 16 h godzinie kohodowli wzrosło natężenie sygnału pochodzącego od jodku propidyny, co oznacza, że barwnik ten penetrował wszystkie, widoczne w polu widzenia, komórki fibroblastów.

Wzrosła również intensywność sygnału pochodzącego od barwika Syto 9®, co uwidoczniło dużą liczbą żywych komórek E. coli (drobne punkty zabarwione na kolor zielony) (Rys. 37). Dowodzi to niezaburzonego wzrostu biofilmu E. coli, który powoduje znaczące uszkodzenia lub śmierć fibroblastów w punkcie krytycznej kolonizacji.

Na rysunku 38 przedstawiono wyniki uzyskane dla dziewiędziesięciosześcio godzinnej kohodowli fibroblastów i drożdżaka C. albicans.

103

Rys. 38 Analiza żywotności kokultury fibroblastów i C. albicans w czasie 96 godzin kohodowli, A – krzywa wzrostu C. albicans; B– żywotność fibroblastów linii L929, czerwony kwadrat oznacza punkt krytycznej kolonizacji

A

B

104

Na podstawie analizy rysunku 38 A, B stwierdzono, że punkt krytycznej kolonizacji następuje pomiędzy 24, a 32 h godziną inokulacji monowarstwy fibroblastów komórkami drożdżaka C. albicans. Liczba komórek C. albicans utrzymuje się na stabilnym poziomie (bliskim maksimum) tj. 1,9 × 10⁶ CFU/ml, a populacja żywych komórek fibroblastów zaczyna się zmniejszać. Ponieważ maksimum żywotności komórek fibroblastów (9,0 ×10⁶ CFU/ml) i komórek drożdżaka występuje w 24 h godzinie dla wskazania punktu krytycznej kolonizacji w 24, 48 i 72 h kohodowli wykonano obrazowanie z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej. Wyniki przedstawiono odpowiednio na rysunkach 39, 40 i 41.

Rys. 39 Kohodowla fibroblastów linii L929 i C. albicans w 24 h od rozpoczęcia hodowli, powiększenie: A – 500, B – 1 000 razy.

A B

Rys. 40 Kohodowla fibroblastów linii L929 i C. albicans w 48 h od rozpoczęcia hodowli, powiększenie: A – 500, B – 1 000 razy.

A B

105

Na podstawie analizy zdjęć wykonanych techniką SEM stwierdzono, że w 24 godzinie kohodowli fibroblastów linii L929 i drożdżaka Candida albicans obserwuje się gęstą monowarstwę fibroblastów linii L929 na powierzchni której widoczny jest biofilm C. albicans rozwijający się w postaci strzępek. (Rys. 39). W 48 godzinie prowadzonej kohodowli obserwuje się nieliczne fibroblasty, porośnięte gęstym biofilmem C. albicans w formie strzępek (Rys. 40). Obraz kohodowli w 72 godzinie uwidacznia rozbudowaną strukturę biofilmu C. albicans oraz pojedyncze komórki fibroblastów o wyraźnie zmienionej morfologii (Rys. 41).

Wykonano również obrazowanie kokultur fibroblastów linii L929 i drożdżaka Candida albicans z zastosowaniem mikroskopii konfokalnej w 8, 24 i 72 godzinie od rozpoczęcia kohodowli (Rys. 42).

Rys. 41 Kohodowla fibroblastów linii L929 i C. albicans w 72 h od rozpoczęcia hodowli, powiększenie: A – 500, B – 1 000, C – 2 500, D – 5 000 razy.

A B

C D

106

Na podstawie analizy obrazowania wykonanego w 8 i 24 h, dla opracowanego modelu infekcji rany przewlekłej in vitro, powodowanej przez drożdżaka C. albicans stwierdzono, że proliferacja wrzecionowatych fibroblastów linii L929 przebiegała prawidłowo (kolor niebieski i zielony). Wraz z namnażaniem się C. albicans, fibroblasty na powierzchni których rozwijał się biofilm zaczynały obumierać i w obrazie uzyskanym w 72 h kohodowli nie widać już ani jednej żywej komórki (Rys. 42). Barwienie z użyciem Syto 9^® i jodku propidyny pozwoliło na wizualizację żywych komórek C. albicans o różnej morfologii. Mniejsze owalne kształty to pojedyncze komórki, natomiast podłużne, nitkowate to strzępki. Ponadto stwierdzono, że na zdjęciach wykonanych w 24 godzinie od rozpoczęcia kohodowli następuje wzrost liczby komórek fibroblastów, wybarwionych jodkiem propidyny na kolor czerwony. Świadczy to o dużych uszkodzeniach komórek fibroblastów i wskazuje na znaczną ilość komórek martwych w monowarstwie (Rys. 42).

D: Nałożenie barwników C: Jodek

B: Syto 9^® A: Cell Trace

®

8

24

72

Czas od inokulacji [h]

Rys. 42 Obrazowanie modelu infekcji rany przewlekłej in vitro, powodowanej przez drożdżaka C albicans w 2, 8, i 16 godzinach od rozpoczęcia kohodowli. A –barwnik Cell Trace Violet®, B – Syto 9®, C – jodek propidyny D – nałożenie barwników. Kolor zielony – żywe komórki, czerwony i fioletowy –martwe komórki, niebieski – komórki fibroblastów.

Skala-20µM

107

W tym samym punkcie czasowym obserwuje się rosnący sygnał od barwnika Syto 9^® (duże zagęszczenie wybarwionych na zielono żywych komórek), co wskazuje na niezaburzony proces rozwoju biofilmu C. albicans.

Na podstawie analizy wyników żywotności kokultury fibroblastów i C. albicans oraz obrazów uzyskanych techniką mikroskopii skaningowej (SEM) i mikroskopii konfokalnej stwierdzono, że faza krytycznej kolonizacji następuje w 24 h od wprowadzenia inokulum drożdżaka.