Badania technikami biologii molekularnej

3.6.1. Oznaczenie ekspresji genów: receptora grelinowego typ 1a, greliny, czynnika martwicy nowotworów typu alfa, dysmutazy ponadtlenkowej oraz białka szoku cieplnego 70 metodą polimerazowej reakcji łańcuchowej odwrotnej transkryptazy

3.6.1.1. Ekstrakcja kwasu rybonukleinowego

Całkowity kwas rybonukleinowy (ang. Ribonucleic Acid – RNA) izolowano metodą Chomczyńskiego i Sacchi (1987) przy użyciu Stratagene Kit (Heidelberg, Germany) [421]. Zamrożony materiał homogenizowano w roztworze denaturacyjnym (4,0 M guani-dinium isotiocyanate; 0,02 M sodium citrate; 0,5% sarcosyl) z 1,0 M β-merkaptoetanolem.

Następnie homogenizat inkubowano z 2,0 M octanem sodu (pH 4,0), fenolem (pH 5,5) i mieszaniną chloroform : alkohol izoamylowy (zestaw Stratagene). Po odwirowaniu

mieszaniny zbierano fazę wodną zawierającą RNA. Na kolejnym etapie przeprowa-dzono precypitację RNA izopropanolem. Następnie uzyskany czysty precypitat RNA osuszono i rozpuszczono w wodzie wolnej od RNazy (DEPC-H₂0). Stężenie RNA w roztworze mierzono przez pomiar absorbancji przy λ = 260 nm, stosując RNA/DNA Calculator (GeneQuant II, Pharmacia Biotech, Sweden). Do czasu dalszej analizy próbki RNA przechowywano w warunkach −80ºC.

3.6.1.2. Synteza komplementarnego kwasu deoksyrybonukleinowego

Jednoniciowy komplementarny kwas deoksyrybonukleinowy (ang. Complementary Deoxyribonucleic Acid – cDNA) syntetyzowano z 2,0 μg całkowitego RNA przy użyciu zestawu RT-PCR Kit (Stratagene, Heidelberg, Germany). W celu rozwinięcia RNA – 2,0 μg RNA zawieszono w DEPC-H₂O i poddano denaturacji termicznej przez 5 minut, w temperaturze 65ºC. Na kolejnym etapie dokonano reakcji odwrotnej transkrypcji do cDNA. W tym celu do roztworu RNA dodano starter oligo-(dT) (0,3 μg); 1,0 μl RNase Block Ribonuclease Inhibitor (40,0 U/μl); 2,0 μl mieszaniny dNTP (25,0 mM dATP;

25,0 mM DTP; 25,0 nM dTP; 25,0 Mm d TTP); 5,0 μl 10 × buforu (10,0 mM Tris HCL;

50,0 mM KCL; 5,0 mM MgCl₂; pH 8,3), 1,0 μl (50,0 U) Moloney Murine Leukemia Virus RT. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 50,0 μl. Reakcję odwrot-nej transkrypcji przeprowadzono przez godzinę w temperaturze 37ºC i zatrzymywano poprzez 5-minutową inkubację w 90ºC.

3.6.1.3. Reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction – PCR)

Jednoniciowe cDNA (matryca) w ilości 2,0 μl amplifi kowano w 50,0 μl mieszaniny reakcyjnej, która zawierała: 1,0 U polimerazy DNA TaKaRa Taq^TM; 200,0 μM dATP;

200,0 μM DTP; 200,0 μM DTP; 200,0 μM dTTP; 1,5 mM MgCl₂; 2,0 mM Tris-HCL (pH 8,3); 10,0 mM KCL; 10,0 μM EDTA; 100,0 μM DTT (odczynniki Takara Shuzo Co. Ltd., Shiga, Japan) oraz primery sensowny i antysensowny każdy w stężeniu koń-cowym – mM. Amplifi kacja została przeprowadzona w termocyklerze PE-9600 (Pekin Elmer Cetus Norwalk, Connecticut, USA). Primery były projektowane na podstawie sekwencji zamieszczanych w publikacjach i syntetyzowane na zamówienie (GIBCO/

Life Technologies, Eggenstein, Germany). Geny, sekwencje genowe, długości produk-tów oraz warunki poszczególnych reakcji RT-PCR przedstawia Tabela 7.

3.6.1.4. Analiza densytometryczna produktów reakcji łańcuchowej polimerazy

Produkty PCR wykrywano, przeprowadzając ich elektroforezę w 1,5% żelu agarozo-wym z dodatkiem bromku etydyny. Następnie dokonano oceny wielkości produktów w odniesieniu do zastosowanego standardu (100 bp drabinka, Takara Shuzo Co. Ltd., Shiga, Japan). Oceny intensywności prążków dokonano przy użyciu metody densyto-metrycznej, posługując się programem Gel-Pro Analyzer (Fotodyne Incorporated, ML, USA). Normalizację wyników przeprowadzono, porównując intensywność sygnału pro-duktów badanych z sygnałem uzyskanych w amplifi kacji tych samych próbek, przy za-stosowaniu primerów β-aktyny housekeeping gene. Całość przedstawionych wyników uzyskano 6 razy z rzędu w kolejnych eksperymentach i są one reprezentatywne dla za-obserwowanego zjawiska.

3.6.2. Oznaczenie poziomu produkcji białek: receptora grelinowego typ 1a, greliny, czynnika martwicy nowotworów typu alfa, dysmutazy ponadtlenkowej, białka szoku cieplnego 70 technikami immunoblottingu i immunoprecypitacji

Izolacja całkowitego białka z komórek pęcherzykowych trzustki była przeprowadzona według standardowej metody opisanej przez Sambrook (1989) [426]. Stężenie białka w próbkach zostało ustalone przez zastosowanie Quanti Pro BCA Assay Kit (Sigma, USA), zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta. Próbki zawierające te same ilości białka (10,0 μg) były poddane denaturacji poprzez zagotowanie w standardowym bufo-rze do immunoblottingu (50,0 mM Tris-HCl pH 6,8; 100,0 mM ditiothreitol; 2,0% SDS;

0,1% błękitu bromofenolowego, 10,0% glicerolu), a następnie nałożone na 10,0% lub 12,0% żel poliakrylamidowy z SDS. Po rozdziale białka były przenoszone na membranę PVDF w procesie elektrotransferu mokrego. Membrany były blokowane w 5,0% roztwo-rze odtłuszczonego mleka w PBS proztwo-rzez godzinę w temperaturoztwo-rze pokojowej. Następnie membrany były poddane ekspozycji na I- i II-rzędowe przeciwciała w rozcieńczeniu odpowiednio 1:1000 i 1:5000. Pomiędzy jedną a drugą ekspozycją membrany były płukane trzykrotnie po 15 minut w 20,0 ml buforu TBST (0,1 M Tris-base pH 8,0;

1,5 M NaCl; 0,5% TritonX-100). Związane do unieruchomionych na membranie białek przeciwciała były wykrywane metodami chemiluminescencyjnymi z wykorzystaniem BM Chemiluminescence Blotting Substrate (Boehringer Mannheim, Germany). Wyniki uzyskano poprzez ekspozycję klisz rentgenowskich (Kodak, Wiesbaden, Germany) na wybarwione membrany.

Na etapie immunoprecypitacji białek komórki pęcherzykowe trzustki przemywano zimnym roztworem PBS i zawieszano w 10,0 ml buforu, a następnie zawiesinę wirowa-no przez 10 minut przy 300 × g w temperaturze 4ºC. Nasącz usuwawirowa-no, a osad komórek zawieszano w 1,0 ml PBS i przenoszono do probówek Eppendorfa. Zawiesinę wirowano przez 15 sekund przy 13 000 × g w temperaturze 4ºC. Uzyskany osad komórek

zawie-T a b e l a 7 Geny, sekwencje genowe, długości produktów oraz warunki poszczególnych reakcji RT-PCR

(opracowanie własne na podstawie: 126, 422–425)

Gen Sekwencja 5’ – > 3’ Prod. Temp.

anilingu (ºC) Piśm.

β-aktyna S: TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG

A: GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG 764 bp 60 422

GHS-R1a S: GAG ATC GCT CAG ATC AGC CAG ATC AGC CAG TAC

A: TAA TCC CCA AAC TGA GGT TCT GC 313 bp 60,7 126

GHRL S: CAG AGG ACA GAG GAC AAG CAG AAG A

A: GCT GGA TGT GAG TTC TTG CTT AGG A 234 bp 59,5 126

TNF-α S: TAC TGA ACT TCG GGG TGA TTG GTC C

A: CAG CCT TGT CCC TTG AAG AGA ACC 295 bp 60 423

SOD-3 S: TTC GAG CAG AAG GCA AGC GGT GAA

A: AAT CCC AAT CAC ACC ACA AGC CAA 396 bp 58 424

HSP70 S: GTG AAG ATC TGC GTC TGC TTG

A: TTT GAC AAC AGG CTG GTG AAC C 590 bp 60 425

Legenda: S – Sense; A – Antisense.

szano przez pipetowanie w 400,0 μl buforu A (10,0 mM HEPES pH 7,8; 10,0 mM KCl;

2,0 mM MgCl₂; 1,0 mM DTT; 0,1 mM EDTA; 0,1 mM PMSF) i pozostawiano przez 15 minut na lodzie. Następnie dodawano 25,0 μl 10,0% roztworu Nonidetu i bardzo intensywnie wytrząsano przez 15 sekund. Próbki wirowano 15 sekund przy 13 000 × g w temperaturze 4ºC, nasącz zawierający białka cytoplazmatyczne przenoszono do no-wych probówek i zamrażano w ciekłym azocie. Osad zawierający jądra komórkowe zawieszano przez intensywne pipetowanie w 50,0 μl buforu C (50,0 mM HEPES pH 7,8;

50,0 mM KCl; 300,0 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 1,0 mM DTT; 0,1 mM PMSF; 10,0%

glicerolu) i pozostawiano na lodzie przez 20 minut, mieszając intensywnie co 2 minu-ty. Po inkubacji próbki wirowano przez 5 minut przy 13 000 × g w temperaturze 4ºC.

Nadsącz zawierający białka jądrowe przenoszono do nowych probówek i zamrażano w ciekłym azocie. Próbki zawierające tę samą ilość białka (5,0–10,0 μg) pozostawiano z przeciwciałami specyfi cznymi dla pierwszego z badanych elementów ewentualnego kompleksu przez 3 godziny w temperaturze 4ºC. Następnie do próbek dodawano 10,0 μl agarozy sprzężonej z białkiem A (Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA) i inkubowa-no przez całą inkubowa-noc w temperaturze 4ºC. Po zwirowaniu peletkę denaturowainkubowa-no poprzez zagotowanie w standardowym buforze do immunoblottingu. Pozostałe kroki procedu-ry były identyczne jak w przypadku immunoblottingu. I-rzędowe przeciwciało użyte w reakcji było specyfi czne do drugiego z białek ewentualnego kompleksu. Przeciwciała I-rzędowe: mysie monoklonalne IgG₁ przeciw GAPDH (A-3) [sc-137179]; królicze po-liklonalne IgG przeciw GHS-R1a (H-80) [sc-20748]; kozie popo-liklonalne IgG przeciw GHRL (C-18) [sc-10368]; kozie poliklonalne IgG przeciw TNF-α (R-19) [sc-1349]; ko-zie poliklonalne IgG przeciw SOD-3 (H-17) [sc-32220]; mysie monoklonalne IgG₁ prze-ciw HSP70 (3A3) [sc-32239]. Przeprze-ciwciała II-rzędowe: królicze antykozie IgG HRP [sc-2768], kozie antymysie IgG₁-HRP [sc-2060], kozie antykrólicze IgG-HRP [sc-2030].

Wszystkie stosowane przeciwciała I- i II-rzędowe zostały zakupione w fi rmie Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA. Do standaryzacji metody i porównywania poziomów białka w lizatach komórkowych stosowano białko referencyjne GAPDH jako wzorzec.

Wszystkie przedstawione wyniki uzyskano 6 razy z rzędu w kolejnych doświadczeniach i są one reprezentatywne dla zaobserwowanego zjawiska.