Oznaczenie ekspresji genu i produkcji białka SOD-3

Obecność sygnału mRNA enzymu antyoksydacyjnego SOD-3 w izolowanych pęche-rzykach trzustkowych w modelu in vitro wykazano we wszystkich badanych grupach zwierząt. Współczynnik ekspresji genowej SOD-3/GAPDH wyniósł w grupie kontrolnej zwierząt (0,9% NaCl) 1,00  0,05. Obwodowe zastosowanie u zwierząt GHRL w dawce 50,0 μg/kg i.p., na 48 godzin przed eksperymentem w warunkach in vitro, wywołało znamienny statystycznie wzrost współczynnika ekspresji genowej SOD-3/GAPDH do poziomu 1,60  0,08 (Ryc. 27).

Zastosowanie ceruleiny w wyselekcjonowanym stężeniu 10^–8 M przez 5 godzin do pobudzenia pęcherzyków trzustkowych wywołało istotny statystycznie spadek współ-czynnika ekspresji genowej SOD-3/GAPDH do poziomu 0,35  0,02 w porównaniu z grupą kontrolną szczurów (0,9% NaCl). W modelu in vivo obwodowe podanie

szczu-rom GHRL w dawce 50,0 μg/kg i.p., na 48 godzin przed zastosowaniem sekretagogu w warunkach in vitro, wywołało znamienny statystycznie wzrost współczynnika sygnału mRNA SOD-3/GAPDH do wielkości 1,32  0,07 (Ryc. 27).

CD SN w porównaniu z grupą z sekretagogiem i zachowanymi SN spowodowa-ła znamienny statystycznie spadek współczynnika ekspresji genowej SOD-3/GAPDH w pęcherzykach trzustkowych pobudzanych ceruleiną o stężeniu 10^–8 M do poziomu 0,19  0,01. Obwodowe podanie w modelu in vivo GHRL w dawce 50,0 μg/kg i.p.

w grupie zwierząt z CD SN, na 48 godzin przed podaniem ceruleiny o stężeniu 10^–8 M w warunkach in vitro, spowodowało niewielki wzrost współczynnika ekspresji genowej SOD-3/GAPDH do poziomu 0,24  0,01 vs grupy bez GHRL. Ten nieznaczny wzrost nie miał jednak wpływu na istotną statystycznie różnicę względem grupy zwierząt

otrzymu-764 bp Ѩ

Ryc. 27. Analiza ekspresji genu SOD-3 oznaczonego metodą RT-PCR w szczurzych pęcherzykach trzustko-wych: ścieżka 1 – kontrola przy zachowanych SN; ścieżka 2 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p.

na 48 godzin przed eksperymentem in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 3 – ceruleina podawana w stęże-niu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 4 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro + ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 5 – ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy CD SN; ścieżka 6 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro + ceruleina podawana w stęże-niu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy CD SN; ścieżka 7 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro przy CD SN. NC – negatywna kontrola.

Gen referencyjny – β-aktyna. ^ap < 0,05 w porównaniu z kontrolą z SN. ^bp < 0,05 w porównaniu z grupą sty-mulowaną ceruleiną (10^–8 M) z SN. ^cp < 0,05 w porównaniu z grupą z GHRL (50,0 μg/kg i.p.) + stymulacja ceruleiną (10^–8 M) z SN. ^dp < 0,05 w porównaniu z grupą z GHRL (50,0 μg/kg i.p.) z SN. Grupa doświadczalna liczyła 2 szczury, każdy eksperyment powtarzano sześciokrotnie

jących GHRL w identycznej dawce z następowym podaniem sekretagogu w grupie zwie-rząt z zachowanymi SN (1,32  0,07). Porównując współczynniki ekspresji genowych SOD-3/GAPDH w pęcherzykach trzustkowych szczurów otrzymujących GHRL w wa-runkach in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed izolacją komórek, pomię-dzy grupą z zachowanymi SN (1,60  0,08) a grupą z CD SN (1,40  0,07), wykazano znamiennie niższy poziom sygnału mRNA badanego enzymu w tej ostatniej (Ryc. 27).

W modelu in vitro izolowanych pęcherzyków trzustkowych wykazano obecność biał-ka enzymu antyoksydacyjnego SOD-3 we wszystkich badanych grupach. Współczynnik produkcji białka SOD-3/GAPDH wyniósł 500,0  1,6 w warunkach kontrolnych (0,9%

NaCl). Dootrzewnowe podanie zwierzętom GHRL w dawce 50,0 μg/kg, na 48 godzin przed eksperymentem w warunkach in vitro, wywołało istotny statystycznie wzrost współczynnika produkcji białka SOD-3/GAPDH do wielkości 790,0  1,8 (Ryc. 28).

37 kDa Ѩ

Ryc. 28. Analiza produkcji białka SOD-3 oznaczona metodami immunoblottingu i immunoprecypitacji w szczu-rzych pęcherzykach trzustkowych: ścieżka 1 – kontrola przy zachowanych SN; ścieżka 2 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 3 – ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 4 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vi-tro + ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 5 – ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy CD SN; ścieżka 6 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro + ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy CD SN;

ścieżka 7 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro przy CD SN. Białko referencyjne – GAPDH. ^ap < 0,05 w porównaniu z kontrolą z SN. ^bp < 0,05 w porównaniu z grupą stymulowaną ceruleiną (10^–8 M) z SN. ^cp < 0,05 w porównaniu z grupą z GHRL (50,0 μg/kg i.p.) + sty-mulacja ceruleiną (10^–8 M) z SN. ^dp < 0,05 w porównaniu z grupą z GHRL (50,0 μg/kg i.p.) z SN. Grupa doświadczalna liczyła 2 szczury, każdy eksperyment powtarzano sześciokrotnie

Hiperstymulacja pęcherzyków trzustkowych z użyciem ceruleiny w stężeniu 10^–8 M przez 5 godzin doprowadziła w odniesieniu do grupy kontrolnej zwierząt (0,9% NaCl) do istotnego statystycznie spadku współczynnika produkcji białka SOD-3/GAPDH do poziomu 160,0  0,6. Obwodowe podanie GHRL w dawce 50,0 μg/kg i.p. w warunkach in vivo, na 48 godzin przed zastosowaniem sekretagogu w modelu in vitro, wywołało zamienny statystycznie wzrost współczynnika produkcji białka SOD-3/GAPDH do po-ziomu 670,0  1,7 (Ryc. 28).

CD SN wywołała znamienny statystycznie spadek współczynnika produkcji biał-ka SOD-3/GAPDH w pęcherzybiał-kach trzustkowych pobudzanych ceruleiną w stężeniu 10^–8 M, do wielkości 91,0  0,4 w porównaniu z grupą z sekretagogiem i zachowanymi SN. Dootrzewnowe podanie GHRL w modelu in vivo w dawce 50,0 μg/kg, na 48 godzin przed podaniem sekretagogu trzustkowego o stężeniu 10^–8 M w warunkach in vitro, wy-wołało niewielki wzrost współczynnika produkcji białka SOD-3/GAPDH do poziomu 106,0  0,5 względem grupy bez GHRL. Ta nieznaczna zmiana nie wpłynęła jednak na znamienną statystycznie różnicę w odniesieniu do grupy szczurów otrzymujących GHRL w takiej samej dawce z następowym podaniem ceruleiny w grupie zwierząt z zachowany-mi SN (670,0  1,7). Dokonując analizy porównawczej współczynników produkcji białka SOD-3/GAPDH w pęcherzykach trzustkowych zwierząt otrzymujących GHRL w dawce 50,0 μg/kg i.p. w modelu in vivo, na 48 godzin przed izolacją komórek, pomiędzy grupą z zachowanymi SN (790,0  1,8) a grupą z CD SN (700,0  1,7), wykazano istotnie niż-szy poziom współczynnika produkcji badanego enzymu w tej ostatniej (Ryc. 28).