Oznaczenie ekspresji genu i produkcji białka GHS-R1a

Sygnał mRNA GHS-R1a w izolowanych pęcherzykach trzustkowych w warunkach in vitro oznaczono we wszystkich badanych próbkach. W grupie kontrolnej zwierząt (0,9% NaCl) współczynnik ekspresji genowej GHS-R1a/GAPDH wyniósł 0,25  0,01. Dootrzewnowe podanie szczurom egzogennej GHRL w ustalonej dawce 50,0 μg/kg, na 48 godzin przed wykonaniem eksperymentu in vitro, spowodowało istotny statystycznie wzrost współ-czynnika sygnału mRNA GHS-R1a/GAPDH do poziomu 0,46  0,02 (Ryc. 21).

Hiperstymulacja pęcherzyków trzustkowych z użyciem wyselekcjonowanego stęże-nia ceruleiny – 10^–8 M przez 5 godzin – spowodowała znamienny statystycznie spadek

$NW\ZQRĞü62'ZWNDQFHWU]XVWNRZHM8J

.RQWUROD 

GHRL

μJNJLS GHRL

μJNJLS GHRL

μJNJLS













D

&'61

&=7 b

b D

D

F d

b

b

Ryc. 20. Wpływ dootrzewnowego podawania GHRL w dawkach wzrastających (12,5, 25,0 lub 50,0 μg/kg i.p.) na aktywność SOD w tkance trzustkowej w przebiegu CZT u zwierząt z zachowanymi SN lub z CD SN. ^ap < 0,05 w porównaniu z kontrolą z SN. ^bp < 0,05 w porównaniu z grupą CZT z SN.

cp < 0,05 w porównaniu z grupą z GHRL (50,0 μg/kg i.p.) + CZT z SN. ^dp < 0,05 w porównaniu z grupą z GHRL (50,0 μg/kg i.p.) z SN. Średnia ± SEM z wartości otrzymanych od 10–15 szczurów w grupie doświadczalnej

współczynnika ekspresji genowej GHS-R1a/GAPDH do poziomu 0,14  0,005 w po-równaniu z grupą kontrolną szczurów (0,9% NaCl). W warunkach in vivo dootrzewnowe podanie zwierzętom egzogennej GHRL w dawce 50,0 μg/kg, na 48 godzin przed zasto-sowaniem ceruleiny w warunkach in vitro, wywołało znamienny statystycznie wzrost współczynnika sygnału mRNA GHS-R1a/GAPDH do wartości 0,43  0,02 (Ryc. 21).

CD SN, w porównaniu z grupą z ceruleiną i zachowanymi SN, nie wpłynęła na wiel-kość współczynnika sygnału mRNA GHS-R1a/GAPDH w pęcherzykach trzustkowych pobudzanych ceruleiną o stężeniu 10^–8 M, który utrzymał się na poziomie 0,12  0,005.

Obwodowe zastosowanie w warunkach in vivo egzogennej GHRL w dawce 50,0 μg/kg i.p. w grupie zwierząt z CD SN na 48 godzin przed podaniem sekretagogu trzustkowego o stężeniu 10^–8 M w warunkach in vitro wywołało znamienny statystycznie wzrost współ-czynnika ekspresji genowej GHS-R1a/GAPDH do wielkości 0,41  0,02 vs grupy bez GHRL. Zmiana ta doprowadziła do wyrównania wartości badanego parametru w stosun-ku do grupy szczurów otrzymujących GHRL w tej samej dawce, z następowym podaniem ceruleiny w grupie zwierząt z zachowanymi SN (0,43  0,02). Porównując współczynniki

764 bp Ѩ

Ryc. 21. Analiza ekspresji genu GHS-R1a oznaczonego metodą RT-PCR w szczurzych pęcherzykach trzustkowych: ścieżka 1 – kontrola przy zachowanych SN; ścieżka 2 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 3 – ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy zachowanych SN; ścież-ka 4 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro + ce-ruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy zachowanych SN;

ścieżka 5 – ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy CD SN; ścieżka 6 – GHRL podawana in vivo w dawce 50 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro + ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy CD SN;

ścieżka 7 – GHRL podawana in vivo w dawce 50 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro przy CD SN. NC – negatywna kontrola. Gen referencyjny – β-aktyna. ^{a, b}p < 0,05 w porównaniu z kontrolą z SN. ^cp < 0,05 w porównaniu z grupą stymulowaną ceruleiną (10^–8 M) z SN. ^dp < 0,05 w porównaniu z grupą stymulowaną ceruleiną (10^–8 M) z CD SN. Grupa doświadczalna liczyła 2 szczury, każdy ekspe-ryment powtarzano sześciokrotnie

ekspresji genowych GHS-R1a/GAPDH w pęcherzykach trzustkowych zwierząt otrzy-mujących egzogenną GHRL w warunkach in vivo (50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed izolacją komórek) pomiędzy grupą z zachowanymi SN (0,46  0,02) a grupą z CD SN (0,44  0,02), wykazano brak znamiennych różnic pomiędzy nimi (Ryc. 21).

W izolowanych pęcherzykach trzustkowych w warunkach in vitro we wszystkich grupach zwierząt wykazano występowanie białka GHS-R1a. W warunkach kontrolnych (0,9% NaCl) współczynnik produkcji białka GHS-R1a/GAPDH wyniósł 135,0  0,6.

Dootrzewnowe podanie szczurom egzogennej GHRL w dawce 50,0 μg/kg, na 48 go-dzin przed wykonaniem eksperymentu w warunkach in vitro, doprowadziło do istotnego statystycznie wzrostu współczynnika produkcji białka GHS-R1a/GAPDH do poziomu 245,0  0,8 (Ryc. 22).

Zastosowanie hiperstymulacji pęcherzyków trzustkowych z użyciem ceruleiny w stężeniu 10^–8 M przez 5 godzin spowodowało znamienny statystycznie, najmniejszy w porównaniu z pozostałymi stężeniami, spadek współczynnika produkcji białka GHS--R1a/GAPDH, który wyniósł 65,0  0,3. W warunkach in vivo obwodowe zastosowanie

37 kDa Ѩ

Ryc. 22. Analiza produkcji białka GHS-R1a oznaczona metodami immunoblottingu i immunoprecypitacji w szczurzych pęcherzykach trzustkowych: ścieżka 1 – kontrola przy zachowanych SN; ścieżka 2 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 3 – ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 4 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro + ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 5 – ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 go-dzin w warunkach in vitro przy CD SN; ścieżka 6 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro + ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy CD SN; ścieżka 7 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 go-dzin przed eksperymentem in vitro przy CD SN. Białko referencyjne – GAPDH. ^{a, b}p < 0,05 w porównaniu z kontrolą z SN. ^cp < 0,05 w porównaniu z grupą stymulowaną ceruleiną (10^–8 M) z SN. ^dp < 0,05 w porów-naniu z grupą stymulowaną ceruleiną (10^–8 M) z CD SN. Grupa doświadczalna liczyła 2 szczury, każdy eksperyment powtarzano sześciokrotnie

egzogennej GHRL w dawce 50,0 μg/kg i.p., na 48 godzin przed eksperymentem w wa-runkach in vitro, wywołało istotny statystycznie wzrost współczynnika produkcji białka GHS-R1a/GAPDH, odpowiednio do poziomu 200,0  0,8 (Ryc. 22).

CD SN nie zmieniła wielkości współczynnika produkcji białka GHS-R1a/GAPDH w pęcherzykach trzustkowych pobudzanych ceruleiną w stężeniu 10^–8 M, który utrzymy-wał się na poziomie 55,0  0,2 w porównaniu z grupą z sekretagogiem i zachowanymi SN.

W grupie zwierząt z CD SN dootrzewnowe podanie egzogennej GHRL w warunkach in vivo w wyselekcjonowanej dawce 50,0 μg/kg, na 48 godzin przed podaniem sekretagogu trzustkowego o stężeniu 10^–8 M w warunkach in vitro, wywołało znamienny statystycz-nie wzrost współczynnika produkcji białka GHS-R1a/GAPDH, który osiągnął wielkość 191,0  0,8. Zmiana ta doprowadziła do wyrównania wielkości badanego współczynnika w stosunku do grupy zwierząt otrzymujących GHRL w identycznej dawce z następowym podaniem ceruleiny z zachowanymi SN (200,0  0,8). Porównując współczynniki pro-dukcji białka GHS-R1a/GAPDH w pęcherzykach trzustkowych szczurów otrzymujących egzogenną GHRL w warunkach in vivo w ustalonej dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed izolacją komórek pomiędzy grupą szczurów z zachowanymi SN (245,0  0,8) a gru-pą z CD SN (230,0  0,8), wykazano brak istotnych różnic między nimi (Ryc. 22).