Oznaczenie ekspresji genu i produkcji białka GHRL

Ekspresję genu GHRL oznaczono w izolowanych pęcherzykach trzustkowych otrzyma-nych w modelu in vitro od wszystkich badaotrzyma-nych grup zwierząt. Współczynnik sygnału mRNA GHRL/GAPDH w grupie kontrolnej (0,9% NaCl) wyniósł 0,48  0,02. Obwodowe podanie szczurom egzogennej GHRL w dawce 50,0 μg/kg i.p., na 48 godzin przed eks-perymentem w warunkach in vitro, spowodowało znamienny statystycznie wzrost współ-czynnika ekspresji genowej GHRL/GAPDH do wielkości 0,88  0,04 (Ryc. 23).

Hiperstymulacja ceruleinowa pęcherzyków trzustkowych z użyciem wyselekcjono-wanego stężenia sekretagogu 10^–8 M przez 5 godzin nie spowodowała, w porównaniu z grupą kontrolną szczurów (0,9% NaCl), zmiany współczynnika ekspresji genowej GHRL/GAPDH, który wynosił 0,41  0,02. Dootrzewnowe podanie zwierzętom w wa-runkach in vivo egzogennej GHRL w dawce 50,0 μg/kg na 48 godzin przed zastoso-waniem ceruleiny w warunkach in vitro spowodowało znamienny statystycznie wzrost współczynnika sygnału mRNA GHRL/GAPDH do poziomu 0,83  0,04 (Ryc. 23).

CD SN, w porównaniu z grupą z ceruleiną i zachowanymi SN, nie wpłynęła na wiel-kość współczynnika ekspresji genowej GHRL/GAPDH w pęcherzykach trzustkowych stymulowanych sekretagogiem w stężeniu 10^–8 M, który utrzymał wartość na poziomie 0,40  0,02. Dootrzewnowe podanie egzogennej GHRL grupie zwierząt z CD SN w wa-runkach in vivo w dawce 50,0 μg/kg, na 48 godzin przed podaniem ceruleiny o stężeniu 10^–8 M w warunkach in vitro, spowodowało istotny statystycznie wzrost współczynnika ekspresji genowej GHRL/GAPDH do poziomu 0,82  0,04 vs grupy bez GHRL. Wzrost ten doprowadził do wyrównania wartości w stosunku do grupy szczurów otrzymujących GHRL w identycznej dawce z następowym podaniem sekretagogu z zachowanymi SN (0,83  0,04). Porównując współczynniki sygnałów mRNA GHRL/GAPDH w pęche-rzykach trzustkowych zwierząt otrzymujących egzogenną GHRL w warunkach in vivo w ustalonej dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed izolacją komórek pomiędzy grupą zwierząt z zachowanymi SN (0,88  0,04) a grupą z CD SN (0,87  0,04), wykazano brak znamiennych różnic pomiędzy nimi (Ryc. 23).

764 bp Ѩ

Ryc. 23. Analiza ekspresji genu GHRL oznaczonego metodą RT-PCR w szczurzych pęcherzykach trzustko-wych: ścieżka 1 – kontrola przy zachowanych SN; ścieżka 2 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 3 – ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 4 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro + ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 5 – ceru-leina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy CD SN; ścieżka 6 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro + ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy CD SN; ścieżka 7 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro przy CD SN. NC – ne-gatywna kontrola. Gen referencyjny – β-aktyna. ^ap < 0,05 w porównaniu z kontrolą z SN. ^bp < 0,05 w porów-naniu z grupą stymulowaną ceruleiną (10^–8 M) z SN. ^cp < 0,05 w porównaniu z grupą stymulowaną ceruleiną (10^–8 M) z CD SN. Grupa doświadczalna liczyła 2 szczury, każdy eksperyment powtarzano sześciokrotnie

Obecność białka GHRL w izolowanych pęcherzykach trzustkowych w warunkach in vitro wykazano we wszystkich badanych próbkach. W analizie wykryto pojedynczą grupę ścieżek na poziomie wielkości 13 kDa w ekstraktach komórkowych, co odpowia-da dojrzałemu hormonowi, w którym grupa hydroksylowa Ser-3 jest acylowana kwasem n-oktanowym; jest to 28-aminokwasowy peptyd, postać AG. Nie zaobserwowano in-nych grup ścieżek. Współczynnik produkcji białka GHRL/GAPDH w grupie kontrolnej zwierząt (0,9% NaCl) wyniósł 220,0  0,8. Dootrzewnowe podanie zwierzętom egzo-gennej GHRL w dawce 50,0 μg/kg, na 48 godzin przed eksperymentem w warunkach in vitro, spowodowało znamienny statystycznie wzrost współczynnika produkcji białka GHRL/GAPDH do poziomu 361,0  0,9 (Ryc. 24).

Stymulacja pęcherzyków trzustkowych z zastosowaniem wyselekcjonowanego stę-żenia ceruleiny – 10^–8 M przez 5 godzin wywołała nieistotną statystycznie tendencję ma-lejącą współczynnika produkcji białka GHRL/GAPDH, do poziomu 200,0  0,8 w po-równaniu z grupą kontrolną szczurów (0,9% NaCl). Podanie zwierzętom w warunkach in vivo egzogennej GHRL w dawce 50,0 μg/kg i.p., na 48 godzin przed zastosowaniem

sekretagogu trzustkowego w warunkach in vitro, spowodowało znamienny statystycz-nie wzrost współczynnika produkcji białka GHRL/GAPDH, odpowiednio do wielkości 345,0  0,9 (Ryc. 24).

CD SN nie wpłynęła na poziom współczynnika produkcji białka GHRL/GAPDH w pęcherzykach trzustkowych stymulowanych ceruleiną w stężeniu 10^–8 M (195,0  0,8) w porównaniu z grupą z ceruleiną i zachowanymi SN. Obwodowe zastosowanie egzogen-nej GHRL w warunkach in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p., na 48 godzin przed podaniem ceruleiny (10^–8 M) w warunkach in vitro, w grupie zwierząt z CD SN spowodowało zna-mienny statystycznie wzrost współczynnika produkcji białka GHRL/GAPDH do wartości 340,0  0,9 vs grupy bez GHRL. Ten wzrost spowodował wyrównanie wartości w stosun-ku do grupy szczurów otrzymujących GHRL w takiej samej dawce, z następowym poda-niem ceruleiny z zachowanymi SN (345,0  0,9). Dokonując porównania współczynników produkcji białka GHRL/GAPDH w pęcherzykach trzustkowych szczurów otrzymujących egzogenną GHRL w warunkach in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed izo-lacją komórek, pomiędzy grupą szczurów z zachowanymi SN (361,0  0,9), a grupą z CD SN (354,0  0,9), wykazano brak istotnych różnic między nimi (Ryc. 24).

37 kDa Ѩ

Ryc. 24. Analiza produkcji białka GHRL oznaczona metodami immunoblottingu i immunoprecypitacji w szczurzych pęcherzykach trzustkowych: ścieżka 1 – kontrola przy zachowanych SN; ścieżka 2 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 3 – ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 4 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro + ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 godzin w warunkach in vitro przy zachowanych SN; ścieżka 5 – ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 go-dzin w warunkach in vitro przy CD SN; ścieżka 6 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro + ceruleina podawana w stężeniu 10^–8 M, czas inkubacji 5 go-dzin w warunkach in vitro przy CD SN; ścieżka 7 – GHRL podawana in vivo w dawce 50,0 μg/kg i.p. na 48 godzin przed eksperymentem in vitro przy CD SN; ścieżka 8 – 0,1 μg peptydu GHRL. Białko referen-cyjne – GAPDH. ^ap < 0,05 w porównaniu z kontrolą z SN. ^bp < 0,05 w porównaniu z grupą stymulowaną ceruleiną (10^–8 M) z SN. ^cp < 0,05 w porównaniu z grupą stymulowaną ceruleiną (10^–8 M) z CD SN. Grupa doświadczalna liczyła 2 szczury, każdy eksperyment powtarzano sześciokrotnie