2. MATERIAŁ I METODY
2.2. FAZA II – badania właściwe
FAZA II badań została podzielona na dwa etapy:
▪ ETAP I - (CON); 8-tygodniowe badania kontrolne - bez treningów nordic walking,
▪ ETAP II - (NW); 8-tygodniowe badania, w trakcie których realizowano 24 treningi nordic walking.
Kolejność i sposób wykonywania poszczególnych procedur badawczych były identyczne w obu etapach. Podczas badań kontrolnych kobiety nie uczestniczyły w treningach NW. Treningi NW wdrożono bezpośrednio po zakończeniu badań kontrolnych. Wyniki ostatnich pomiarów i oznaczeń wykonanych podczas badań kontrolnych były jednocześnie wyjściowymi dla etapu NW. Tym samym, grupa badana stanowiła dla siebie jednocześnie grupę kontrolną.
Podczas badań właściwych wykonano:
▪ testy wysiłkowe:
− test 2×6 minut,
− test stopniowany,
▪ pomiary somatyczne i ocenę składu ciała (DEXA),
▪ oznaczenia biochemiczne,
▪ pomiar ciśnienia tętniczego krwi,
▪ analizę sposobu żywienia.
2.2.1. Nordic walking
Nauka marszu nordic walking
Bezpośrednio przed rozpoczęciem treningów NW wprowadzono naukę techniki marszu w oparciu o wytyczne Polskiej Federacji Nordic Walking (PFNW) oraz Międzynarodowej Federacji Nordic Walking (INWA) [Pellegrini i wsp., 2018].
Nauka techniki marszu NW (technika klasyczna, tzw. poziom zdrowotny) została przeprowadzona przez wykwalifikowanego instruktora.
Prawidłowa technika klasyczna NW opiera się na poniższych założeniach:
− zachowanie naturalnego, naprzemiennego rytmu chodu
− pochylenie całego ciała do przodu
− marsz rozpoczynamy od pięty i kończymy go na odpychaniu się palcami
− zwiększamy długość kroku
− kończyna górna porusza się w płaszczyźnie strzałkowej
− ręka trzymana możliwie blisko tułowia
− naprzemienność ruchów - lewy kijek umieszczamy na podłożu wówczas, gdy stawiamy na nim prawą piętę
− podczas fazy odpychania kijek umieszczamy pomiędzy nogą wykroczną a zakroczną, po stronie nogi zakrocznej
− kijek wbity w podłoże pod kątem ostrym
− faza odepchnięcia wykonywana do poziomu bioder (kijek w tej fazie nie przekracza linii ciała), bez wyprostu w stawie łokciowym i „otwierania” ręki na rękojeści podczas fazy końcowej odepchnięcia
− tułów wykonuje naprzemienny obrót wokół osi ciała w linii środkowej
Podczas nauki NW, instruktor dobierał prawidłową długość kijków dla każdej uczestniczki według wytycznych PFNW/INWA [Pellegrini i wsp., 2018].
Treningi nordic walking
Treningi NW trwały 60 minut i były prowadzone z instruktorem przez 8 tygodni z częstotliwością 3 razy w tygodniu. Każdą sesję NW rozpoczynała 5-minutowa rozgrzewka, a kończyły 5-minutowe ćwiczenia uspokajające i wyciszające. Marsze NW odbywały się na płaskich terenach zielonych Krakowa: m.in. wzdłuż Bulwarów Wiślanych oraz w Parku AWF i w Parku Jordana, o tej samej porze dnia i w tej samej porze roku. W celu lepszej opieki instruktorskiej badana grupa została podzielona na podgrupy w zależności od możliwości wysiłkowych.
Prędkość marszu została tak określona, aby powodowała wzrost częstości skurczów serca (HR) do wartości odpowiadającej intensywności pracy, przy której spalanie tłuszczu było najwyższe (FATmax) [Frayn, 1983; Tan, 2012], co wyznaczono indywidualnie podczas testu stopniowanego, wykonywanego bezpośrednio przed rozpoczęciem treningów. Każda z kobiet kontrolowała zadaną wartość HR za pomocą monitora częstości skurczów serca marki Polar Elektro S610i (Finlandia). Zmiana zadanej wartości HR o więcej niż ±10 uderzeń sygnalizowana była dźwiękowo, co informowało o konieczności korekty prędkości marszu.
Ustalono miejsce oraz terminy 24. treningów NW i wpisano je do kalendarza uczestniczek, jako dodatkowy czynnik motywujący. Przed rozpoczęciem serii
treningów odbył się instruktaż słowny dotyczący bezpieczeństwa oraz zasad obowiązujących w trakcie treningu.
2.2.2. Testy wysiłkowe
Badane w 1. i w 8. tygodniu etapu CON oraz w 8. tygodniu etapu NW wykonały test wysiłkowy o dwóch stałych prędkościach tj.: test 2×6 minut test oraz stopniowany.
Wysiłki testowe wykonano na bieżni mechanicznej h/p/Cosmos Saturn COS 10198 (Niemcy).
Podczas każdego z testów co 30 sekund rejestrowano uśrednione wartości poziomu wskaźników oddechowych:
– minutowej wentylacji płuc (VE) – objętości oddechowej (VT) – częstości oddechów (BF)
– minutowego poboru tlenu (VO2)
– minutowego wydalania dwutlenku węgla (VCO2) – współczynnika wymiany oddechowej (RER).
W odstępach 30-sekundowych rejestrowana była uśredniona wartość HR. Rejestrację rozpoczynano 2. minuty przed rozpoczęciem każdego z testów wysiłkowych i kontynuowano do końca 3. minuty restytucji powysiłkowej.
Pomiar poziomu wskaźników wymiany oddechowej dokonywany był przy użyciu ergospirometru ML3B Cortex Biophysik GmbH (Niemcy), natomiast HR rejestrowana była przy użyciu elektronicznego monitora pracy serca typ POLAR VANTAGE NV firmy Polar Elektro (Finlandia).
Test 2×6 minut
Test polegał na wykonaniu dwóch 6-minutowych wysiłków z prędkościami kolejno: 6,0 km/h (marsz) i 7,8 km/h (bieg), rozdzielonych 3-minutową przerwą, podczas której badane odpoczywały w pozycji siedzącej. Kąt nachylenia bieżni wynosił 0°. Przed rozpoczęciem testu wysiłkowego, w przerwie pomiędzy wysiłkami oraz bezpośrednio po ich zakończeniu pobierano krew arterializowaną w celu oznaczenia stężenia mleczanu i wskaźników równowagi kwasowo-zasadowej. Przed rozpoczęciem testu wysiłkowego oraz po jego zakończeniu pobierano również krew żylną w celu oznaczenia stężenia wskaźników stresu oksydacyjnego.
Około 10 sekund przed zakończeniem każdego z wysiłków badane dokonywały subiektywnej oceny ciężkości pracy (RPE) z wykorzystaniem 15-punktowej skali Borga [Borg, 1982; Williams, 2017].
W analizie uwzględniono średnie wyniki wskaźników oddechowych i częstości skurczów serca obliczone z 2. ostatnich minut każdego z wysiłków.
Test stopniowany
Zastosowano marszowy test stopniowany. Test rozpoczynano 3-minutowym marszem z prędkością 3,5 km/h przy kącie nachylenia bieżni 1. Następnie, zachowując przyjęty kąt nachylenia bieżni, zwiększano prędkość przesuwu taśmy o 0,8 km/h co 3 minuty, aż do osiągnięcia wartości RER równego 1,0, a następnie co 2. minuty do momentu niemożności kontynuowania pracy.
Podczas testu zmierzono maksymalną minutową wentylację płuc (VEmax) maksymalny minutowy pobór tlenu (VO2max), który wyrażono w wielkościach globalnych (l/min) oraz w relacji do masy ciała (ml/min/kg) oraz maksymalną częstość skurczów serca (HRmax).
Na podstawie wyników uzyskanych w teście stopniowanym wykonanym bezpośrednio przed rozpoczęciem etapu NW, korzystając ze wzoru: FAT (g) = 1,67×VO2 (l/min) – 1,67×VCO2 (l/min)[Frayn, 1983; Tan, 2012], obliczono dla każdej z uczestniczek masę tłuszczu utlenionego w kolejnych minutach wysiłku. Wartość najwyższą oznaczono jako FATmax. Następnie, dla intensywności pracy, przy której osiągnięto FATmax, wyznaczono HR treningowe.
2.2.3. Pomiary somatyczne i ocena składu ciała Pomiary somatyczne
Pomiary obwodów talii (WC) i bioder (HC) oraz pomiar masy ciała (BM) zostały przeprowadzone 5-krotnie: w 1., 4. i 8. tygodniu etapu CON oraz w 4. i 8. tygodniu etapu NW. Przed rozpoczęciem badań zmierzono również wysokość ciała (BH).
Pomiar BM został wykonany z wykorzystaniem analizatora składu ciała Jawon Medical, model IOI-353 (Korea); pomiar BH za pomocą stadiometru Seca 231 (Niemcy); obwody ciała z wykorzystaniem nierozciągliwej taśmy antropometrycznej Seca 201 (Niemcy).
Dla każdej osoby obliczono BMI, WHR, WHtR oraz wskaźnik otłuszczenia ciała (BAI - Body Adipocity Index) według wzorów:
BMI = BM (kg) / (BH (m))2 WHR = WC (cm) / HC (cm) WHtR = WC (cm) / BH (cm) BAI = HC (cm) / (BH (m))1,5
Obwód talii zmierzono w najwęższym miejscu pomiędzy dolnym brzegiem łuków żebrowych, a górnym grzebieniem kości biodrowych, w końcowej fazie spokojnego wydechu. Pomiar obwodu bioder wykonano w najszerszym miejscu na wysokości talerza biodrowego, jednak nie niżej niż spojenie łonowe. Pomiary obwodów dokonano na gołej skórze. W trakcie pomiarów taśma antropometryczna ułożona była prostopadle do osi pionowej ciała, równolegle do podłogi [Ahmad i wsp.
2016].
Ocena składu ciała
Ocenę składu ciała wykonano trzykrotnie tj.: przed rozpoczęciem badań oraz po zakończeniu etapu CON i NW z wykorzystaniem absorpcjometrii promieniowania rentgenowskiego o podwójnej energii (DEXA - dual-energy X-ray absorptiometry). Badanie zostało wykonane w Centrum Medycznym iMed24 w Krakowie. W badaniu wykorzystano technikę wiązki wachlarzowej z 64-kanałowym detektorem półprzewodnikowym aparatem GE Healthcare Lunar iDXA (GE Medical System, USA). Przed wykonaniem badania wolontariuszkom przekazano dokładne informacje na temat procedury przeprowadzenia badania. W celu prawidłowej realizacji badania kobiety:
− usuwały biżuterię oraz plastikowe, metalowe i gumowe elementy,
− ubrane były w wygodne ubranie (top bez rękawów i spodenki gimnastyczne).
Ocenę składu ciała wykonano według instrukcji producenta z zastosowaniem standardowego protokołu. W trakcie badania kobiety leżały nieruchomo na plecach.
Czas trwania badania wynosił około 10 minut. W celu zachowania wiarygodności otrzymanych wyników, urządzenie codziennie przed wykonaniem pomiarów poddawano procedurze kontrolnej.
Podczas badania oceniono:
− beztłuszczową masę ciała ‒ LBM (kg)
− masę tkanki tłuszczowej ‒ FAT (kg)
− procentową zawartość tkanki tłuszczowej ‒ FAT (%)
− procentową zawartość tkanki tłuszczowej w obszarze trzewnym ‒ FATTRZEWIA (%)i biodrowym ‒ FATBIODRA (%)
2.2.4. Oznaczenia biochemiczne Oznaczane wskaźniki biochemiczne
W pracy poddano analizie:
▪ stężenie wybranych adipokin w osoczu krwi:
− asprozyna,
− iryzyna,
− rezystyna,
− wisfatyna
− leptyna,
− adiponektyna,
− obliczono stosunek stężenia leptyna/adiponektyna – LEPT/ADIPO,
▪ stężenie wskaźników stresu oksydacyjnego w osoczu krwi:
− utlenione lipoproteiny o niskiej gęstości (ox-LDL),
− 3-nitrotyrozyna (3-NT),
− całkowity status oksydacyjny (TOS),
− całkowita pojemność antyoksydacyjna (TAC), oraz
− kwas moczowy (UA) w surowicy krwi,
− obliczono wskaźnik stresu oksydacyjnego OSI = TOS/TAC,
▪ stężenie wskaźników metabolizmu węglowodanów:
− glukoza (GLU) w osoczu krwi,
− insulina (INS) w surowicy krwi,
− obliczono wskaźniki:
HOMA-IR = INS (µIU/ml) × GLU (mmol/l)/22,5 QUICKI = 1/(log INS (μIU/ml) + log GLU (mg/dl)) TyG = ln (TG (mg/dl) × GLU (mg/dl)/2)
▪ profil lipidowy surowicy krwi:
− stężenie cholesterolu całkowitego (TC),
− stężenie lipoprotein o wysokiej gęstości - HDL-cholesterol (HDL-C),
− stężenie trójglicerydów (TG),
− obliczono stężenie lipoprotein o niskiej gęstości – LDL-cholesterol (LDL-C):
LDL-C = TG – (HDL-C + TG/5),
− obliczono wskaźniki aterogenezy:
CRI-I = TC/HDL-C, CRI-II = LDL-C/HDL-C, AIP = log (TG/HDL-C),
− obliczono również wartość wskaźnika wisceralnej tkanki tłuszczowej (VAI - Visceral Adiposity Index), a także wskaźnika akumulacji produktów lipidowych (LAP - Lipid Accumulation Product) korzystając z wzorów:
VAI kobiety = WC (cm) / (36,58 + (1,89 × BMI)) × (TG (mmol/l]) / 0,81) × (1,52 / HDL-C (mmol/l)) LAP kobiety = (WC (cm) – 58) × TG (mmol/l)
▪ wskaźniki równowagi kwasowo-zasadowej we krwi arterializowanej
− stężenie mleczanu (La-) w osoczu,
− stężenie jonów wodorowych (H+) w pełnej krwi,
− poziom nadmiaru lub niedoboru zasad buforujących (BE) w pełnej krwi.
Analizując powysiłkowy poziom wskaźników stresu oksydacyjnego obliczono korektę [Kraemer i Brown, 1986] z uwzględnieniem procentowych zmian objętości osocza (%PV), które wyliczono na podstawie równania Dilla i Costilla w modyfikacji Harissona [Dill i Costill, 1974; Harrison i wsp., 1985]. W tym celu oznaczono stężenie hemoglobiny (Hb) i wartość hematokrytu (Hct). Stężenie Hb i wartość Hct oznaczono w trzech powtórzeniach z każdej próbki krwi, w analizie uwzględniano wartość średnią.
%PV wyliczono korzystając ze wzoru:
%ΔPV = 100 × {(Hbprzed / Hbpo) × [100 - (0.874 × Hctpo)] / [100 - (0.874 × Hctprzed)] - 1}
gdzie: Hbprzed i Hbpo to odpowiednio stężenie hemoglobiny przed i po wysiłku Hctprzed i Hctpo to odpowiednio wartość hematokrytu przed i po wysiłku
Korekty stężenia dokonano korzystając ze wzoru:
Wkor = (%ΔPV×0.01×W) + W
gdzie: Wkor – steżenie badanego wskaźnika po korekcie - po uwzględnieniu %PV W – oznaczone stężenie
Czas dokonywania oznaczeń i procedury przedanalityczne Próbki krwi żylnej były pobierane:
▪ w 1. tygodniu etapu CON na czczo oraz przed wykonaniem testu 2×6 minut i bezpośrednio po jego zakończeniu,
▪ w 4. tygodniu etapu CON na czczo,
▪ w 8. tygodniu etapu CON na czczo oraz przed wykonaniem testu 2×6 minut i bezpośrednio po jego zakończeniu (pomiar wyjściowy do etapu NW),
▪ w 4. tygodniu etapu NW na czczo,
▪ w 8. tygodniu etapu NW na czczo oraz przed wykonaniem testu 2×6 minut i bezpośrednio po jego zakończeniu.
Krew pobierano z naczyń żylnych w zgięciu stawu łokciowego, z uwzględnieniem obowiązujących standardów, z wykorzystaniem systemu próżniowego BD Vacutainer® (USA).
Dodatkowo przed rozpoczęciem testu 2×6 minut oraz po zakończeniu obu wysiłków 6-minutowych pobierane były próbki krwi arterializowanej z opuszki palca.
Krew została pobrana przez wykwalifikowaną pielęgniarkę w Pracowni Fizjologicznych Podstaw Adaptacji w Instytucie Nauk Biomedycznych w AWF w Krakowie.
Do pobrań krwi żylnej wykorzystano:
▪ probówki zawierające EDTA, w celu oznaczenia stężenia Hb i Hct oraz uzyskania osocza do oznaczeń stężenia ox-LDL, 3-NT, TOS, TAC,
▪ probówki zawierające EDTA z inhibitorem proteaz (aprotynina 0,6 TIU/1 ml krwi), w celu uzyskania osocza do oznaczeń stężenia adipokin w osoczu.
▪ probówki zawierające EDTA z inhibitorem glikolizy (5 mg NaF i 4 mg szczawianu potasu/2 ml krwi) do oznaczeń stężenia GLU w osoczu,
▪ probówki z aktywatorem wykrzepiania, w celu separacji surowicy do oznaczeń stężenia UA, INS i profilu lipidowego.
Po pobraniu krwi, probówki na surowicę przechowywano przez około 20 minut w temperaturze 21°C do czasu uzyskania skrzepu. W tym czasie probówki na osocze przechowywano w temperaturze 4-8C. Po oznaczeniu Hb i Hct oraz po uzyskaniu skrzepu, wszystkie probówki z krwią wirowano przez 15 minut w temperaturze 4°C przy RCF 1.000×g (wirówka MPW-351R, MPW Med. Instruments Polska). Osocze i surowicę porcjowano i przechowywano do czasu analizy w temperaturze -70°C (zamrażarka laboratoryjna ZLN-UT 300 PREM, POL-EKO-APARATURA, Polska).
Stężenie La- oznaczano w osoczu krwi kapilarnej. W tym celu pobierano 300 l krwi z opuszki palca do mikroprobówek zawierających K2EDTA oraz fluorek sodu (Sarstedt, Niemcy). Krew wirowano bezpośrednio po pobraniu przez 3 minuty przy RCF 14300×g (MPW 55, Polska). Do oznaczeń pozostałych wskaźników równowagi kwasowo-zasadowej pobierano 80 l krwi arterializowanej do kapilar zawierających heparynę sodową.
Technika oznaczeń biochemicznych
Pomiar stężenia asprozyny, iryzyny, leptyny, adiponektyny, rezystyny, wisfatyny, ox-LDL i 3-NT wykonano metodą immunoenzymatyczną (ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Stężenie UA, TOS, TAC oraz La- oznaczono z wykorzystaniem enzymatycznych testów kolorymetrycznych, a stężenie Hb metodą cyjanomethemoglobinową. TOS został określony na podstawie oznaczenia stężenia produktów peroksydacji lipidów. TAC oznaczono bazując na reakcji eliminacji H2O2, dodanego do badanej próbki w zdefiniowanej ilości, przez zawarte w tej próbce antyoksydanty. Do pomiaru absorbancji wykorzystano czytnik mikropłytek E-LizaMat 3000 (USA) oraz Thermo Scientific Evolution 201 UV-Visible Spectrophotometer (USA). Oznaczając stężenie H+ i BE posłużono się aparatem Corning 348 pH/Blood Gas Analyser (Niemcy). Powyższe oznaczenia wykonano w Pracowni Fizjologicznych Podstaw Adaptacji w AWF w Krakowie.
Do oznaczeń biochemicznych wykorzystano wymienione zestawy odczynników:
− Nori®Human Asprosin ELISA Kit GR 111426 (Genorise, USA), zakres detekcji 1,5-100 ng/ml; intra-assay CV < 6%, inter-assay CV < 9%,
− Human Irisin ELISA Kit RAG 018R (BioVendor, Czechy), zakres detekcji 0,001-5μg/ml; intra-assay CV < 8,2%, inter-assay CV < 9,7%,
− Human Leptin ELISA Kit RD191001100 (BioVendor, Czechy), zakres detekcji 0-50 ng/ml; intra-assay CV < 7,6%, inter-assay CV < 6,7%,
− Human Adiponectin ELISA Kit RD191023100 (BioVendor, Czechy), zakres detekcji 2-150 ng/ml; intra-assay CV < 4,4%, inter-assay CV < 6,6%,
− Human Resistin ELISA Kit RD191016100 (BioVendor, Czechy), zakres detekcji 0-50 ng/ml; intra-assay CV < 3,4%, inter-assay CV < 6,9%,
− Human Visfatin ELISA Kit RAG00R (BioVendor, Czechy), zakres detekcji 0-8 ng/ml; intra-assay CV < 9,11%, inter-assay CV < 7,24 %,
− UA 230 Kit (Randox, Wielka Brytania), zakres detekcji 0,599 - 24,5 mg/dl,
− ox-LDL/MDA Adduct ELISA Kit K7810 (Immundiagnostik AG, Niemcy), zakres detekcji 0-250 ng/ml; intra-assay CV < 5,7%, inter-assay CV < 11,0%,
− Nitrotyrosine ELISA Kit K7827 (Immundiagnostik AG, Niemcy), zakres detekcji 0-400 nM; intra-assay CV < 9,0%, inter-assay CV < 9,2%,
− PerOx (TOS/TOC) Kit KC5100 (Immundiagnostik AG, Niemcy), intra-assay CV < 2,9%, inter-assay CV < 6,9%,
− ImAnOx (TAS/TAC) Kit KC5200 (Immundiagnostik AG, Niemcy), intra-assay CV < 4,0%, inter-assay CV < 3,9%,
− L-Lactate LC2389 (Randox, Wielka Brytania), czułość testu 0,165 mmol/L, liniowość zależności absorbancji i stężenia do 19,7 mmol/l,
− Hb, standardowy odczynnik Drabkina (Aqua-med, Polska).
Stężenie GLU, INS i profil lipidowy oznaczono w Laboratorium Medycznym DIAGNOSTYKA w Krakowie wykorzystując zestawy odczynnikowe firmy Roche Diagnostics International Ltd. (Niemcy):
− GLUC3, zakres detekcji 2-750 mg/dl,
− Elecsys Insulin, zakres detekcji 0,4-1000 mU/ml,
− CHOL2, zakres detekcji 3,86-800 mg/dl,
− HDLC3, zakres detekcji 3-120 mg/dl,
− TRIGL,zakres detekcji 8,85-885 mg/dl.
Stężenie GLU oraz składowych profilu lipidowego wykonano metodą enzymatyczną z wykorzystaniem analizatora biochemicznego cobas c701/702 (Roche Diagnostics International Ltd., Niemcy). Stężenie INS oznaczono metodą
elektrochemiluminescencji (ECLIA) z wykorzystaniem aparatu cobas e801 (Roche Diagnostics International Ltd., Niemcy).
2.2.5. Pomiar ciśnienia tętniczego krwi
Pomiar skurczowego (SBP - systolic blood pressure) i rozkurczowego (DBP - diastolic blood pressure) ciśnienia tętniczego krwi wykonywany był w pozycji siedzącej na tętnicy ramiennej lewej, po kilkuminutowym odpoczynku, przy użyciu ciśnieniomierza zegarowego SOHO 150. Pomiar wykonano w 1., 4. i 8. tygodniu etapu CON oraz w 4. i 8. tygodniu etapu NW.
2.2.6. Ocena sposobu żywienia
Sposób żywienia został oceniony z użyciem 3-dniowych dzienniczków żywieniowych. Po instruktarzu, badane kobiety samodzielnie sporządzały szacunkowy zapis spożycia w specjalnie zaprojektowanych dzienniczkach żywieniowych. Badane samodzielnie wprowadzały informacje na temat godziny posiłku, gramatury spożywanych produktów, potraw i napojów z podaniem ilości w miarach domowych lub handlowych. Wielkość porcji oceniana była subiektywnie przez badane kobiety na podstawie Albumu Fotografii Produktów i Potraw [Szponar i wsp., 2000]. Do oceny sposobu żywienia wykorzystano program komputerowy Dieta 6.0 (IŻŻ, Warszawa).
Ocenę sposobu żywienia przeprowadzono w 1., 4. i 8. tygodniu etapu CON oraz w 4. i 8. tygodniu etapu NW.