Klonowanie cDNA

terminalna transferaza dodaje kolejno nukleotydy do końców 5’

egzonukleaza III usuwa nadmiarowe

nukleotydy

AAAAA

AAAAA TTTTTT

T TTTTTTTTTTT

ligaza DNA polimeraza I dostosowuje

brakujące odcinki DNA łańcuchów DNA według matrycy, jaką jest druga nić

Rys. 3. Synteza sztucznych lepkich końców i łączenie wyposażonych w nie fragmentów DNA [wg P. Węgleński: op. cit.]

Ponieważ czas podwojenia liczby namnażanych komórek E. coli w warunkach optymal-nych wynosi 20–30 min, możliwe jest powielenie jednej kopii rekombinowanego plazmidu do więcej niż 10¹⁰ cząsteczek w ciągu 12 godzin. W ten sposób układ „wektor–gospodarz”

pozwala produkować ogromne ilości identycznych cząsteczek plazmidów, umożliwiając w ten sposób dalsze manipulacje poszczególnymi genami.

VIII.2.2. Klonowanie cDNA

Klonowanie i ekspresja genów ludzkich są szczególnie interesujące z farmaceutyczne-go punktu widzenia. Posiadają pewne charakterystyczne dla nich cechy. Polegają one na tym, że większość genów ludzkich zawiera wewnętrzne regiony, które w żadnej części nie kodują odpowiedniego białka.

Te regiony, zwane intronami (introns, intervening sequences) są czasem większe od re-jonów kodujących, zwanych egzonami (rys. 4).

GEN EUKARIOTYCZNY Podwójna nić DNA

PROMOTOR TERMINATOR

PIERWOTNY TRANSKRYPT RNA Pojedyncza

nić RNA

DOJRZAŁE mRNA

EGZON INTRON

Transkrypcja

Proces łączenia

JĄDRO CYTOPLAZMA

TRANSLACJA

ŁAŃCUCH POLIPEPTYDOWY

Większość genów eukariotycznych składa się z rejonów kodujących (egzonów) przedzielonych rejonami niekodującymi (intronami). Ekspresja zaczyna się transkrypcją, która inicjowana jest od tzw. promotora i kończy na terminatorze. Otrzymany pierwotny transkrypt jest przepisywany na dojrzałe mRNA bez in-tronów przez specjalne enzymy łączące RNA, znajdujące się w jądrze komórkowym (splicing). Dojrzałe (mature) mRNA jest następnie przenoszone do cytoplazmy komórkowej i ulega translacji w łańcuch poli-peptydowy.

Rys. 4. Struktura i ekspresja genu eukariotycznego [wg A Textbook of Drug Design and Development, ed.

P. Krogsgaard-Larsen, T. Liljefors and U. Madsen, Copyright © 1996 OPA (Overseas Publishers Association) Amsterdam B.V., Harwood Academic Publishers]

Geny ludzkie mogą zawierać więcej niż 200000 par zasad. Wskutek tego trudno jest wytworzyć fragment restrykcyjny zawierający kompletny gen. Innym problemem jest to, że duże fragmenty DNA są trudne do utrzymania w całości w wektorach bakteryjnych. E. coli nie jest zdolna do prawidłowej ekspresji genów zawierających introny, ponieważ brak jej pewnych funkcji niezbędnych dla tego procesu.

Rozwinięto jednak metodę, która pozwala na klonowanie fragmentów DNA zawierają-cych jedynie regiony kodujące ludzkich genów. Metoda ta korzysta z faktu, że transkrypcja eukariotyczna i mechanizmy komórkowe wytwarzają dojrzałe cząsteczki mRNA, w któ-rych zostały usunięte rejony intronów. W wyniku reakcji enzymatycznej in vitro z użyciem enzymu wirusowego, zwanego odwrotną transkryptazą, możliwe jest wykonanie kopii DNA z mRNA. Ta kopia DNA, zwana cDNA (copy DNA lub complementary DNA), zawie-ra nieuszkodzony rejon kodujący, który można klonować i poddawać ekspresji w E. coli (rys. 5).

Aby wytworzyć cDNA kodujące pożądane białko, izoluje się mRNA z odpowiednich tkanek i organów, w których jest ono syntetyzowane. Wyizolowane mRNA jest populacją cząsteczek reprezentujących wszystkie geny, które ulegają ekspresji w tej tkance. Jednakże jedynie niewielka ilość cząsteczek cDNA wytwarzanych przez odwrotną transkrypcję od-powiada pożądanemu białku. Kompletna populacja cDNA z danej tkanki, organu lub orga-nizmu nosi nazwę biblioteki cDNA (cDNA library). Klony z tej biblioteki, które zawierają pożądane cDNA (często mniej niż jeden na tysiąc), muszą być zidentyfikowane i izolowane przed analizą. To niekiedy może być bardzo trudnym zadaniem. Stosowana wówczas me-toda uwzględnia rodzaj potrzebnego cDNA.

VIII.2.2.1. Metody identyfikacji genów

Typową metodą identyfikacji (metody niżej wymienione można stosować z pominię-ciem tworzenia biblioteki genów) jest technika hybrydyzacji DNA przedstawiona na rysun-ku (rys. 6). Ta metoda wymaga pewnej wiedzy o sekwencji cDNA, którą to wiedzę uzyskać można na podstawie znajomości, choćby tylko częściowej, sekwencji aminokwasów kodo-wanego białka. Sekwencja ta może być użyta do zsyntetyzowania radioaktywnej sondy DNA (zawierającej zwykle nukleotydy z izotopem fosforu ³²P), która jest w stanie związać się (hybrydyzować) z pożądanym cDNA poprzez fragment DNA komplementarny w pew-nym stopniu do sondy, dając w ten sposób możliwość otrzymania sygnału z tego klonu (tab. 2). Obecnie coraz częściej stosuje się sondy nieradioaktywne, które – w przeciwień-stwie do radioaktywnych – są trwałe i bezpieczne dla zdrowia. Sonda nieradioaktywna ma przyłączone dodatkowe ugrupowanie chemiczne (np. digoksygeninę lub biotynę), pozwala-jące na wykrycie poprzez reakcję barwną. Uwidocznienie sondy wskazuje, do którego klonu się ona przyłączyła.

Jeżeli nie jest dostępna informacja na temat sekwencji, trzeba użyć innych metod, które zazwyczaj polegają na ekspresji białka kodowanego przez cDNA. Wówczas wektor klono-wania zawiera sygnały, które pozwalają na ekspresję insertu cDNA. Chociaż nie zawsze możliwe jest wytwarzanie białek eukariotycznych, które utrzymują swą aktywność biolo-giczną w E. coli, zazwyczaj możliwe jest otrzymanie białek, które utrzymują determinanty antygenowe białka natywnego. Dlatego metoda opierająca się na skriningu przeciwciałem biblioteki ekspresji cDNA, może być użyta do identyfikacji, o ile dostępne jest specyficzne przeciwciało. Metoda ta (poszukiwanie przeciwciałami) jest podobna do techniki hybry-dyzacji przedstawionej na rys. 6, z tym, że teraz przeciwciało jest używane w miejsce son-dy DNA.

Tabela 2 Systemy znakowania i detekcji sond [wg 22]

Systemy znakowania Rodzaj markera Detekcja Radioizotopowe Do sondy włączany jest

nukleo-tyd znakowany radioaktywnym izotopem, np. ³⁵S, ³³P, ³²P, ³H.

Najczęściej jest stosowana siarka

35S.

Autoradiografia.

Stosuje się filmy wrażliwe na promieniowanie β lub płynne emulsje fotograficzne do powlekania preparatów.

Fluorescencyjne Do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z barwnikiem scencyjnym – pochodną fluore-sceiny, rodaminy lub kumaryny.

Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Immunochemiczne Cytochemiczne

Do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z haptenem: biotyną, digoksygeniną lub fluoresceiną.

Za pomocą przeciwciał specyficznych dla danego haptenu. Przeciwciała sprzężone są z umożliwiającymi ich uwidocznienie cząstecz-kami:

alkaliczną fosfatazą → przeprowadza reakcje barwne, np. z NBT (nitro blue tetrazolium) i BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforanem) → przeprowadza reakcję z CSPD^®, której towarzy-szy emisja fotonów (chemiluminescencja) → detekcja przy użyciu filmu fotograficznego, peroksydazą → przeprowadza reakcje barwne, np. z diaminobenzydyną,

barwnikami fluorescencyjnymi (fluoresceina, rodamina) → detekcja przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego,

koloidalnym złotem → stosowane do mikro-skopii elektronowej.

Sondy znakowane biotyną mogą też być wy-krywane na podstawie reakcji biotyny z awidy-ną.

Enzymatyczne Do sondy włączany jest nukleo-tyd sprzężony z cząsteczką enzymu, np. alkalicznej fosfata-zy.

Reakcja barwna katalizowana przez enzym markerowy (np. z NBT i BCIP dla alkalicznej fosfatazy).

W niektórych przypadkach aktywność biologiczna białka może być jedyną drogą iden-tyfikacji klonu kodującego cDNA. Wtedy trzeba używać komórek gospodarza, które za-chowują tę aktywność. Oczywistym wyborem jest hodowla kultur komórkowych ssaków.

Obecnie dostępnych jest wiele różnych stosowanych w tym celu układów „gospodarz – wektor”. Inne komórki gospodarza, mianowicie oocyty żaby, są – jak stwierdzono – bardzo dogodne, ponieważ mogą powodować ekspresję skomplikowanych funkcjonalnie białek, takich jak receptory błonowe ssaków lub kanały jonowe.

G A T C C

koniec poly A (ogonek)

oligo dT primer np. w plazmidzie pBR322

odwrotna transkryptaza wirusowa

NaoH

polimeraza I DNA

nukleaza SI (specyficzna dla jednej nici)

dodatek BamHI linkery syntetyczne DNA

Fragmenty DNA, które zawierają jedynie regiony kodujące genów eukariotycznych mogą być syntetyzowa-ne in vitro z eukariotyczsyntetyzowa-nego mRNA. Na początku chemicznie zsyntetyzowany primer oligo-dT jest polia-denylowany do 3^’ końców cząsteczek mRNA. Łańcuchy komplementarnego DNA (cDNA) są syntetyzowa-ne z deoksynukleotydów za pomocą odwrotsyntetyzowa-nej transkryptazy. Matrycowe mRNA usuwa się hydrolizą wodo-rotlenkiem sodowym; w wyniku otrzymuje się populacje cząsteczek jednoniciowego cDNA, które z kolei są używane jako matryce dla syntezy nowych cząsteczek DNA przy użyciu polimerazy DNA. W wyniku otrzymuje się dwuniciowe cDNA. Pętle jednoniciowe są usuwane za pomocą nukleazy SI. Aby skonstruo-wać bibliotekę cDNA, syntetyczne linkery, które zawierają odpowiednie miejsce rozpoznawane przez endo-nukleazę restrykcyjną (np. BamHI) mogą być dodawane do końców dwuniciowych cząsteczek DNA.

Otrzymany preparat jest rozcinany enzymem restrykcyjnym i klonowany do wektora DNA (np. pBR 322), jak to pokazano na rys. 1.

Rys. 5. Synteza cDNA z eukariotycznego mRNA [wg A Textbook of Drug Design and Development, ed.

P. Krogsgaard-Larsen, T. Liljefors and U. Madsen, Copyright © 1996 OPA (Overseas Publishers Association) Amsterdam B.V., Harwood Academic Publishers]

ligaza DNA DNA plazmidu

przeciętego enzymem restrykcyjnym BamHI

.

. .

. ...

..

transformacja bakterii

bakterie bez plazmidów

klony bakteryjne

rosną jedynie bakterie zawierające plazmid cDNA z linkerami BamHI

pożądane DNA

filtr nitrocelulozowy

inkubacja filtra z sondą radioaktywną

autoradiogram dla zlokalizowania potrzebnego klonu filtr

ekspozycja filmu

selekcja klonu

powielanie potrzebnego klonu płytka z podłożami agarowymi

zawierającymi ampicylinę

replikacja płytki na filtrze nitrocelulozowym

Rys. 6. Konstruowanie biblioteki cDNA i identyfikacja specyficznych klonów za pomocą techniki hybrydyzacji DNA [wg A Textbook of Drug Design and Development, ed. P. Krogsgaard-Larsen, T. Liljefors and U. Madsen, Copyright © 1996 OPA (Overseas Publishers Association) Amsterdam B.V., Harwood Academic Publishers]

Do namnożenia DNA niezbędny jest jego dwuniciowy fragment (a). W roztworze podgrzanym do 95^oC wiązania wodorowe między dwoma nićmi kwasu nukleinowego pękają, co powoduje ich rozdzielenie (b). Kiedy mieszanina jest następnie schładzana do temperatury 50–65^oC , specjal-nie przygotowane startery wiążą się do komplementarnych nici w miejscach, które z dwóch stron ograniczają powiela-ne DNA (c). W temperaturze 72^oC polimeraza wydłuża w jednym kierunku przyłączone startery, wykorzystując nici oryginalnego DNA jako matryce (d). Produktem reakcji są dwie nowe nici DNA, takie same jak wyjściowe (e). Cykl ten trwa tylko kilka minut i może być powtarzany bez końca.