Wstęp

Procesy biotransformacji zachodzą z dużą wydajnością, w niewysokich temperaturach (20–40°C) i przy niskich ciśnieniach, co czyni je bardziej atrakcyjnymi od procesów che-micznych, ze względu na małe zapotrzebowanie na energię. Główną jednak ich zaletą jest to, że przebiegają w określonym miejscu substratu (regioselektywnie) i wytwarzają poje-dyncze, czynne optycznie izomery produktu (są stereospecyficzne), co daje nam możliwość uzyskania chiralnych półproduktów, często wysoko funkcjonalnych, a więc bardzo cen-nych, w dużej przewadze enancjomerów.

Mikrobiologiczne transformacje przy użyciu mieszanych kultur mikroorganizmów by-ły szeroko wykorzystywane przez ludzkość od dawna w rolnictwie i żywieniu – do produk-cji chleba, produktów mlecznych oraz napojów alkoholowych. Naukowe podstawy bio-transformacji położył Pasteur w 1862 r., utleniając etanol do kwasu octowego przy użyciu kultury Bacterium xylinum. Obecnie wykorzystuje się w biotransformacji czyste hodowle mikroorganizmów, komórki w stanie spoczynku, spory, wysuszone komórki lub wyizolo-wane z nich enzymy. Mogą być one stosowyizolo-wane w postaci roztworów (enzymy) bądź zawie-sin, lecz częściej są wiązane (immobilizowane) ze stałymi, niereaktywnymi nośnikami, co ma na celu zwiększenie ich stabilności i umożliwienie wielokrotnego użycia.

Źródłem enzymów dla biotransformacji są komórki mikroorganizmów, roślin i zwie-rząt. Reakcje z użyciem mikroorganizmów znajdują najszersze zastosowanie, ze względu na szeroki asortyment enzymów, zdolnych katalizować różnorodne procesy. Dużym pro-blemem w takich transformacjach jest więc problem selektywności i ukierunkowania zdol-ności katalitycznej. Gdy większość aktywnych enzymów w komórkach działa w podobnych warunkach, jest często rzeczą samego substratu kierowanie reakcją tak, by powstał określo-ny produkt. Na kierunek reakcji wpływa się przez:

 modyfikację struktury substratu,

 zmianę pH środowiska reakcji,

 stężenie substratu,

 naturę składnika odżywczego,

 dodatek nieodwracalnych inhibitorów enzymów,

 immobilizację komórek,

 warunki wzrostu komórek.

Idealny substrat powinien spełniać określone warunki (rys. 1).

Substrat idealny zapewnia dużą wydajność

jest rozpuszczalny w środowisku fermentacyjnym

prowadzi do regio- i stereo-specyficznych produktów jest w stanie przeniknąć przez

błonę komórkową aktywność katalityczna mikroorganizmu nie jest blokowana przez substrat bądź produkt Rys. 1. Warunki jakie powinien spełniać idealny substrat w procesach biotransformacyjnych

Rzadko jednak substraty wykorzystywane w praktyce spełniają wszystkie wymienione wymagania. Można wówczas wykorzystać jedną z poniższych możliwości:

Substrat nie przenika przez błonę komórkową:

 przeprowadzenie reakcji za pośrednictwem oczyszczonych enzymów,

 chemiczna lub fizyczna zmiana stanu komórek (zmielenie, wysuszenie, liofilizacja, dodatek detergentów, autoliza, zamrożenie),

 rozdrobnienie kryształów substratu do rozmiaru mikrona.

Substrat zapewnia zbyt małą wydajność lub niedostateczną stereospecyficzność:

 zmiana rasy mikroorganizmu,

 dodatek substancji pobudzającej lub inhibitora,

 zmiana stanu fizjologicznego mikroorganizmu poprzez zmianę warunków gazowych, pH, dodatek rozpuszczalników organicznych, soli, detergentów, zmianę składu środo-wiska, zmianę gęstości komórek,

 genetyczne udoskonalenie rasy mikroorganizmu,

 przeprowadzenie reakcji za pośrednictwem oczyszczonych enzymów.

Substrat osłabia zdolność życia i reprodukcji komórek:

 wzrost komórek w obecności niskich stężeń substratu,

 dodawanie do środowiska reakcji rozproszonego substratu w małych porcjach lub w sposób ciągły,

 chemiczna modyfikacja substratu przez wprowadzenie, przesunięcie lub zmianę grupy ochronnej.

Substrat nie jest rozpuszczalny w środowisku reakcji:

 rozpuszczenie substratu w nietoksycznym, dającym się mieszać z wodą rozpuszczalni-ku (aceton, etanol, glikol propylenowy, DMSO) przed dodaniem do środowiska reakcji,

 dwu- lub wielofazowe środowisko reakcji (n-alkany, cykloheksan, octan etylu, octan butylu) lub wprowadzenie stałych adsorbentów liofilowych (druga faza nie powinna wykazywać efektu inhibitora),

 dodatek czynnika emulgującego,

 rozdrobnienie kryształów substratu do rozmiaru mikrona.

W wielu poznanych i wykorzystywanych reakcjach biotransformacji z użyciem mikro-organizmów nie potrafimy ściśle określić, który konkretnie enzym (enzymy) w komórce jest odpowiedzialny za rodzaj przemiany. W chwili obecnej znamy niemal 3000 różnych enzymów, jednak tylko niewielka ich część (około 300) jest dostępna i stosowana w synte-zie jako biokatalizatory.

Enzymy są białkami zawierającymi od 60 do 1000 reszt aminokwasów w postaci jedne-go lub kilku łańcuchów polipeptydowych. Rozmiar enzymu pozwala na odpowiednie sfałdo-wanie i precyzyjne ułożenie aminokwasów w miejscu, gdzie zachodzi reakcja chemiczna, tak by osiągnąć optymalny efekt katalityczny. Wiele enzymów należy do białek złożonych, które składają się z części białkowej oraz związanej z nią grupy prostetycznej (np. polisacharydu, lipidu, porfiryny, kationu metalu). Jeżeli grupa prostetyczna związana jest w sposób odwra-calny, wówczas nazywamy ją koenzymem, a część białkową – apoenzymem.

Stosując jako kryterium podziału rodzaj katalizowanej reakcji, sklasyfikowano enzymy (system IUB – International Union of Biochemistry) w 6 grupach (tab. 1).

Znacząca część enzymów stosowanych jako biokatalizatory potrzebuje do swego dzia-łania tzw. koenzymów. Są to związki o stosunkowo niewielkiej masie cząsteczkowej, przy-łączone (kowalencyjnie lub niekowalencyjnie) do części białkowej enzymu. Koenzymy

odpowiedzialne są za transport elektronów (reakcje oksydacyjno-redukcyjne), wodoru lub innych grup, a także transport energii. Wśród bardziej znanych koenzymów wymienić można: NAD⁺/NADH, NADP⁺/NADPH, ATP, acetylo-CoA, pochodne witamin grupy B i monofosforanu adenozyny (AMP). W wielu przypadkach do pełnienia funkcji katalitycz-nej niezbędne są jony metali, związane z enzymem wiązaniem koordynacyjnym (Fe, Ni, Cu, Co, V, Zn, Mg, Mn).

Na proces katalizy enzymatycznej składają się procesy fizyczne (łączenie substratu z enzymem, oderwanie enzymu od gotowego produktu reakcji) i chemiczne (przemiany substratu w produkt):

P P

S S

Enz Enz

Enz Enz

+

+

Rys. 2. Uproszczony schemat procesu katalizy enzymatycznej

0 20 40 60 80 100 120 140 160

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

postęp reakcji

potencjał termodynamiczny

reakcja enzymatyczna

reakcja niekatalizowana

substrat

produkty pośrednie produkt

Rys. 3. Porównanie zmian energetycznych obserwowanych w reakcji enzymatycznej i niekatalizowanej [wg P. Kafarski, B. Lejczak: Chemia bioorganiczna, Wydawnictwo Naukowe PWN, 1994]

Aby doprowadzić do zajścia reakcji, należy dostarczyć cząsteczce pewnej ilości ener-gii, zwanej energią aktywacji (jest to różnica pomiędzy energią najwyższego punktu na wykresie – tzw. stanu przejściowego, a energią substratu). Katalizator (enzym) obniża energię aktywacji, prowadząc reakcję w kilku etapach, charakteryzujących się stanami przejściowymi o niższych energiach (rys. 3). Podobnie działają katalizatory chemiczne.

Efekty katalityczne osiągane w reakcjach enzymatycznych są bardzo duże, reakcja jest przyspieszana od 10⁹ do 10¹⁵ razy w stosunku do odpowiedniej niekatalizowanej reakcji chemicznej. Proces katalizy zachodzi w określonym miejscu enzymu, nazywanym centrum aktywnym lub niszą katalityczną enzymu. Tworzą ją reszty aminokwasów biorących bezpośredni udział w wiązaniu cząsteczki substratu, odpowiedzialne za specyficzność dzia-łania katalizatora i jego aktywność katalityczną. Najważniejsze czynniki odpowiedzialne za strukturę centrum aktywnego to:

 odpowiedni układ grup chemicznych łańcuchów bocznych aminokwasów, zdolny do zdeformowania i polaryzacji wiązań cząsteczki substratu tak, by uczynić ją bardziej re-aktywną;

 odpowiednia budowa centrum wiążącego, które unieruchamia cząsteczkę substratu w położeniu odpowiadającym ułożeniu grup reaktywnych w niszy katalitycznej;

 odpowiednia i precyzyjna orientacja przestrzenna cząsteczki substratu, która pozwala na zajście poszczególnych etapów reakcji z minimalnymi przemieszczeniami w obrę-bie cząsteczki;

 odpowiednie wiązanie substratu, tak aby obniżyć energię aktywacji kompleksu enzymu z substratem.

Tabela 1 Podział enzymów wg IUB

Klasa enzymów Podklasy enzymów Typ reakcji katalizowanej 1.

Oksyreduktazy

dehydrogenazy, oksydazy, reduktazy, peroksydazy, katalaza, oksygenazy, hydroksylazy

reakcje utleniania i redukcji

2.

Transferazy

transaldolaza, transketolaza, acylo-, metylo-, glukonylo-, fosforylotransferazy, kinazy, fosfomutazy

reakcje przenoszenia grup funkcyjnych z cząsteczki donora do cząsteczki akceptora

3.

Hydrolazy

esterazy, peptydazy, tiolazy, fosfolipazy, amidazy, dezamidazy, glikozydazy

hydroliza i formowanie wiązań w estrach, amidach, laktonach, laktamach, epoksydach, nitrylach, bezwodnikach, glikozydach

4.

Liazy

dekarboksylazy, aldolazy, ketolazy, hydratazy, dehydratazy, syntazy, liazy

reakcje addycji (lub eliminacji) małych cząsteczek (H2O, CO2, NH3) do wiązań podwójnych C═C, C═N, C═O

5.

Izomerazy

racemazy, epimerazy, mutazy izomeryzacja czyli wzajemne przekształcanie jednych izomerów w drugie (przekształcanie izomerów optycznych, geometrycznych, konstytucyjnych, tautomerów itp.) 6.

Ligazy

syntetazy, karboksylazy reakcje formowania (lub rozpadu) wiązań C–O, C–S, C–N, C–C sprzężone z rozerwa-niem wiązania pirofosforanowego w ATP

Najdogodniejszy sposób prowadzenia transformacji biologicznych polega na użyciu czystych, wyizolowanych enzymów. Są to jednak odczynniki bardzo kosztowne, dlatego stosuje się je jedynie wtedy, gdy celem syntezy jest uzyskanie związków niedostępnych lub bardzo trudno dostępnych na drodze syntezy chemicznej. Znacznie częściej stosuje się gotowe preparaty enzymatyczne, zawierające oprócz konkretnego enzymu (enzymów) inaktywowane proteiny, stabilizatory i sole buforowe oraz inne substancje pochodzące z hodowli. Preparaty takie są tańsze i często bardziej trwałe niż czyste, wyizolowane enzy-my.

Coraz szersze zastosowanie znajdują także procesy z zastosowaniem immobilizowa-nych enzymów i komórek mikroorganizmów. Immobilizacja polega na związaniu enzy-mów bądź komórek z nośnikiem (przez związanie na powierzchni nośnika lub w jego wnę-trzu) lub umiejscowienie ich w określonej przestrzeni, np. w bioreaktorze. Można to osią-gnąć metodami fizycznymi lub chemicznymi:

a) wiązanie na powierzchni nośnika siłami jonowymi, wiązaniami wodorowymi (ad-sorpcja, adhezja) lub wiązaniami kowalencyjnymi (wiązania peptydowe, estrowe, węgiel–węgiel, węgiel–azot i in.) – drewno, celuloza, jonity, polimery syntetyczne, szkło porowate, ziemia okrzemkowa, węgiel aktywny,

b) wiązanie w matrycy nośnika – w żelach naturalnych lub syntetycznych (agar, algi-nian, kolagen, poliuretan, polistyren) lub we włóknach (włókna octanu celulozy), c) zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych – w komórkach naturalnych

(erytrocyty), pomiędzy membranami lub w wężach półprzepuszczalnych (nylono-wych, silikonowych i in.), kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie (liposomy, kap-sułki nylonowe, kolodionowe, polimocznikowe, z pochodnych celulozy),

d) unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego – sieciowanie przestrzenne, kopolimeryzacja enzymów z nośnikami rozpuszczalnymi przy uży-ciu odczynników dwufunkcyjnych, flokulacja komórek przy udziale polielektroli-tów, samoagregacja (naturalna flokulacja oraz wzrost drobnoustrojów w postaci kuleczek lub kłaczków biomasy).

Zdolność katalityczna komórek immobilizowanych jest nieco niższa w porównaniu z „nie immobilizowaną” kulturą – przyczyną jest powstanie dodatkowej bariery na granicy komórka–nośnik i utrudnienie dostępu substratu do katalizatora oraz uszkodzenie pewnej liczby komórek podczas immobilizacji. Jednak liczne zalety takiego sposobu prowadzenia biotransformacji przeważają nad wadami. Produkt reakcji, a także sam katalizator, łatwiej można wyizolować ze środowiska reakcji. Często odzyskany w ten sposób katalizator wy-korzystuje się ponownie. Możliwe jest prowadzenie procesu ciągłego, ze stałym dopływem substratu i odprowadzaniem produktu reakcji. Tempo procesów z użyciem komórek unie-ruchomionych można znacznie zwiększyć, eliminując barierę przepuszczalności błony komórkowej poprzez traktowanie substancjami powierzchniowo czynnymi, zamrażanie i rozmrażanie, ogrzewanie do temperatury powyżej 50°C, a także częściową autolizę komó-rek.

Duże znaczenie uzyskały obecnie metody biosyntezy z wykorzystaniem inżynierii ge-netycznej, w których stosowane są szczepy drobnoustrojów lub linie komórkowe modyfi-kowane genetycznie oraz enzymy modyfimodyfi-kowane metodami inżynierii białka. Umożliwia to mikrobiologiczną biosyntezę takich związków, których otrzymywanie przy użyciu drobno-ustrojów było dotychczas niemożliwe.

W obecnym rozdziale omówiono pokrótce wybrane przykłady opisanych w literaturze reakcji z zastosowaniem enzymów (lub preparatów enzymatycznych) wyizolowanych z komórek mikroorganizmów, roślin i zwierząt lub z użyciem całych komórek. Najważniej-sze z nich to reakcje hydrolizy oraz reakcje redukcji. W przykładach podawano struktury

użytych w biotransformacji substratów, wydajność reakcji oraz czystość optyczną produk-tów.

Miarą czystości optycznej związku jest nadmiar enancjomeryczny (oznaczany jako

„ee”), który wyraża względny nadmiar jednego z enancjomerów w mieszaninie. Jeśli np.

enancjomer R występuje w przewadze, wartość ee wyliczamy według wzoru:

% ee = [ R ]  [ S ]

[ R ] + [ S ] x 100%