Ze względu na dostępność materiału badania przepro-wadzono na jajach glisty świńskiej Ascaris suum, której rozwój jest identyczny jak glisty ludzkiej Ascaris lumbri-coides oraz podobny do glisty psiej Toxocara canis i gli-sty kociej Toxocara cati. Zapłodnione jaja glist izolowano w roztworze PBS z końcowych odcinków macic dojrzałych samic tak, żeby w 1 mL zawiesiny było 8–10 tys. jaj. Robaki pochodziły z jelit świń bezpośrednio po uboju w Zakładach Mięsnych w Szczecinie.
Wyizolowane z gleby szczepy grzybów Metarhizium flavoviride i Metarhizium anisopliae hodowano na standar-dowym podłożu Czapka w temperaturze 25°C.
W szalkach Petriego założono jednocześnie 9 hodowli, umieszczając po ok. 10 mL zawiesiny jaj w każdej szalce.
W 3 hodowlach kontrolnych jaja inkubowano wyłącznie w PBS.
W 3 hodowlach doświadczalnych umieszczano dodat-kowo po jednym krążku grzybni o średnicy 40 mm M. fla-voviride, a w pozostałych trzech po jednym krążku o tej samej średnicy M. anisopliae.
Do codziennych obserwacji mikroskopowych z po-szczególnych hodowli pobierano po 10 μL zawiesiny jaj.
Doświadczenie prowadzono do 60. dnia włącznie. W każdej hodowli, spośród 300 kolejno napotkanych jaj określano liczbę jaj będących w stadium zygoty, w trakcie bruzdkowa-nia, w stadium blastuli, gastruli oraz larwy. Z poszczegól-nych grup hodowli oceniano średnie wartości uzyskaposzczegól-nych danych. W ten sam sposób oceniano liczbę jaj z wadami rozwojowymi zarodków.
W celu oceny śmiertelności larw zastosowano barwienie jaj roztworem jodu [13]. Martwe larwy nie poruszały się, a w roztworze jodu barwiły się na kolor brunatny.
Do opracowania statystycznego wyników zastosowano test chi-kwadrat dla prób niezależnych.
Wyniki
Czas trwania poszczególnych etapów embriogenezy w hodowlach kontrolnych i doświadczalnych zilustrowa-no na rycinie 1. W porównaniu z hodowlami kontrolnymi, w hodowlach z M. anisopliae oraz z M. flavoride stwier-dzono opóźnienie podziału zygoty odpowiednio o 3 i 4 dni. Jaja w stadium zygoty obserwowano znacznie dłużej w hodowlach z grzybami w porównaniu z kontrolnymi.
Z M. anisopliae niepodzielone zygoty obserwowano jeszcze w 47. dniu inkubacji.
Ryc. 1. Porównanie tempa rozwoju jaj Ascaris suum w hodowli kontrolnej i doświadczalnej
Fig. 1. The comparison of the pace of Ascaris suum eggs development in control and experimental cultures
W hodowlach kontrolnych większość bruzdkujących jaj (2–8 blastomerowych) stwierdzono w 10 dniu inkuba-cji, podczas gdy w hodowlach z grzybnią obu gatunków najwięcej bruzdkujących zarodków obserwowano z 8- i 9- dniowym opóźnieniem.
Z podobnym opóźnieniem w hodowlach z grzybami odnotowano najwięcej jaj w stadium blastuli. Natomiast przekształcenie blastuli do stadium dwuwarstwowej gastruli w większości jaj inkubowanych z M. anisopliae i z M. fla-voride trwało odpowiednio o 2 i 4 dni krócej w porównaniu z kontrolnymi. Rozwój gastruli do postaci larwy w hodow-lach z grzybami w porównaniu z kontrolnymi był znacznie wydłużony: z M. flavoridae trwał o 28, a z M. anisopliae 20 dni dłużej.
W jajach inkubowanych z grzybami, poczynając od 7. dnia doświadczenia stwierdzono postępujący wzrost licz-by jaj z deformacjami, a różnice w porównaniu z kontrolą były statystycznie istotne (tab. 1). W początkowym okresie rozwoju, do stadium gastruli, znacznie więcej deformacji obserwowano w jajach hodowanych z M. anisopliae, a w dal-szych dniach embriogenezy znacznie wyższy odsetek de-formacji zarodków stwierdzano w jajach inkubowanych z M. flavoride.
hodowla jaj A.summ z M. anisopliae / experimrntal cultura of A. suum eggs with M. anisopliae hodowla jaj A. suum z M. flavoviride / experimental culture of A. suum eggs with M. flavoviridae najwyższt odsetek jaj A. suum w danych stadiach rozwojowych
highest percentage of A. suum eggs in a given developmental stage
dzień hodowli / day of culture 00 05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
WPłYW GRZYBÓW Z RODZAJU METARHIZIUM NA ROZWóJ EMBRIONALNY ASCARIS SUUM 21
Ta b e l a 1. Odsetek zdeformowanych jaj Ascaris suum w hodowlach:
kontrolnej, z Metarhizium anisopliae i Metarhizium flavoviride Ta b l e 1. The percentage of deformed eggs Ascaris suum in control culture and with Metarhizium anisopliae and Metarhizium flavoviride
cultures
% zarodków z zaburzeniami rozwojowymi
% embryos with developmental disturbances
3 0,7 1,3 1,1
* różnica istotna p < 0,05 / significant difference p < 0,05
** różnica wysoce istotna p < 0,001 / highly significant difference p < 0,001
Badania mikroskopowe nie wykazały penetracji strzępek grzybni do wnętrza jaj. W zygotach obserwowano wakuoli-zację i granulację cytoplazmy. Najczęściej obserwowanymi zaburzeniami w czasie bruzdkowania były nierównomierne podziały blastomerów, nieprawidłowo wykształcone morule i blastule. Często dzielącym się blastomerom towarzyszy-ły przeźroczyste granule (ryc. 2a). W niektórych jajach stwierdzano całkowitą destrukcję zarodka (ryc. 2b). Wady rozwojowe larw występowały w postaci ich fragmentacji (ryc. 2c) lub jedynie częściowego rozwoju gastruli do po-staci larwy (ryc. 2d).
W ostatnim, tj. 60. dniu doświadczenia stwierdzono znacznie wyższy odsetek martwych larw w jajach inkubo-wanych z M. flavoviridae (26%) w porównaniu z M. ani-sopliae (17%).
Dyskusja
Wyniki przeprowadzonych badań świadczą, że obydwa gatunki Metarhizium hamują rozwój zarodkowy Ascaris suum i wydatnie zmniejszają żywotność rozwiniętych larw, przy czym M. flavoviridae wydaje się oddziaływać bardziej toksycznie.
Obserwacje nie wykazały penetracji grzybni przez osłonki jajowe. Stwierdzono jednak wyraźne wady rozwo-jowe, co może świadczyć o przenikaniu wydzielin grzybów do wnętrza zarodka. Na przenikanie wydzielin grzybów przez osłonki jajowe może wskazywać obecność granul, które obserwowano w sąsiedztwie dzielących się blasto-merów. Podobne granule obserwowali Kołodziejczyk i wsp.
[14] w swoich badaniach nad wpływem ochratoksyny A na rozwój Ascaris suum.
Badania jajobójczych zdolności różnych gatunków grzybów mogą ujawnić nowe perspektywy dla biologicznej kontroli pasożytów. W pracach innych autorów jaja geohel-mintów były hodowane z takimi saprofitycznymi grzyba-mi jak Penicillium frequentans, Stachybotrys chartarum
[14, 15], Paecilomyces lilicinus, Paecilomyces maraquandii [16] oraz Fusarium pallidoroseum [17]. Powyższe gatunki grzybów w różnym stopniu wpływały na rozwój embrio-nalny pasożytniczych nicieni. W pracach Ciarmela i wsp.
[17] oraz Bausaldo i wsp. [16] toksyczne oddziaływanie grzybni oceniano w skali pięciostopniowej: 1 – brak (jaja niezmienione), 2 – niski (poniżej 20% wykazywało zmiany), 3 – pośredni (20–50%), 4 – wysoki (50–80%) i 5 – bardzo wysoki (powyżej 80%). W badaniach własnych wpływ grzybni M. flavoviride na jaja Ascaris można ocenić jako wysoki – po 60 dniach inkubacji stwierdzono deforma-cje zarodków w 75,2% jaj. Efekt owostatyczny w hodowli z Metarhizium anisopliae wg tej skali był pośredni, bowiem w 40% jaj stwierdzano embriopatie.
Pomimo wielu badań, mechanizm antagonistycznego oddziaływania grzybni na jaja nicieni jest mało poznany.
Według Basualdo i wsp. [16] w procesie jajobójczym uczest-niczą zarówno enzymy, jak i wyspecjalizowane struktury grzybni. Autorzy wykazali u grzybów Paeciolomyces lilici-nus obecność struktur zwanych apressoriami, które ułatwiają strzępkom wrastanie poprzez osłonki do wnętrza jaj Toxocara canis. Ponadto, według autorów, otaczająca jajo grzybnia wytwarza wysokie ciśnienie, co powoduje uszkodzenie osło-nek jajowych. Obserwacje w tej pracy nie potwierdzają tego poglądu. Obserwowano jedynie uszkodzenie wewnętrznej osłonki lipidowej, podczas gdy zewnętrzna-białkowa i chi-tynowa nie były naruszone. Badania Dożańskiej i Iwańczuk [18] wykazały, że rozpuszczalniki tłuszczowe działały owo-cydnie na skutek rozpuszczenia lipoidalnej warstwy skorupki jaja. Ponadto według autorów zniszczenie białkowej otoczki jaja Ascaris nie odgrywało większej roli w procesie owosta-tycznego i owocydnego działania badanych związków. Nie-które związki chemiczne mimo wybitnie rozpuszczającego działania w stosunku do białkowej warstwy otoczki jaj, nie wywierały ujemnego wpływu na ich rozwój.
Opóźnienie rozwoju zarodkowego jaj inkubowanych z grzybnią M. anisopliae i M. flavoviride może być efektem inhibicyjnego ich efektu na replikację, transkrypcję i trans-lację. Według Mazurkiewicz i wsp. [12] destruksyny A, B i E wyizolowane z M. anizopliae powodują zahamowanie syntezy DNA, RNA i białek.
Wyniki badań autorów niniejszej pracy są zgodne z ob-serwacjami innych autorów, którzy wykazali powstawanie deformacji zarodków w poszczególnych stadiach embrio-genezy geohelmintów pod wpływem wydzielin grzybów pleśniowych [14]. Kuźna-Grygiel i wsp. [15] obserwowały wakuolizację zygoty i zaburzenia w rozmieszczeniu sub-stancji żółtkowej jaj Ascaris inkubowanych z metabolitami Penicillium frequentas. Podobne zmiany zaobserwowano w badaniach własnych. W jajach inkubowanych z grzybnią obu gatunków stwierdzono granulację masy żółtkowej, wa-kuolizację cytoplazmy oraz często obserwowano zniszcze-nie otoczek jajowych. Jaja te wykazywały zniszcze-nierównomierne bruzdkowanie, deformacje w stadium blastuli i gastruli.
Deformacje zarodków jak i śmiertelność larw były istotnie wyższe hodowlach z M. flavoviridae.
Ryc. 2. Zaburzenia morfologiczne w embriogenezie jaj Ascaris suum inkubowanych z grzybami saprofitycznymi Metarhizium: a – bruzdkujące jajo z hodowli z Metarhizium flavoviride z widocznymi granulami (×1000); b – całkowicie zniszczony zarodek w 19. dniu inkubacji z Metarhizium
flavoviride (×1000); c – zdeformowana larwa w jaju z hodowli z Metarhizium flavoviride w 46. dniu hodowli (×1000); d – zdeformowana larwa w jaju z hodowli z grzybnią Metarhizium anisopliae w 46. dniu hodowli (×1000)
Fig. 2. Morphologic disturbances in embryogenesis of Ascaris suum eggs incubated with saprophytic fungi Metarhizium: a – egg in cleavage stage from culture with Metarhizium flavoviride; visible granules (×1000); b – complete destruction of embryo in egg from 19th day culture with Metarhizium flavoviride (×1000); c – deformed larva in egg from 46th day culture with Metarhizium flavoviride (1000×); d – deformed larva in egg
46th day culture with Metarhizium anisopliae (1000×)
Wniosek
Zarówno Metarhizium flavoviride, jak i Metarhizium ani-sopliae mogą ograniczać liczebność jaj inwazyjnych Ascaris suum, przy czym M. flavoviride jest bardziej toksyczny.
Piśmiennictwo
1. Lýsek H.: Biological liquidation of ascarid eggs in spring pasture soil.
Acta Parasitol. Pol. 1967, 15 (36), 263–267.
2. Jarnicka-Stanios H., Wawrzkiewicz K.: Działanie grzybów rodzaju Fusarium na rozwój jaj Ascaris suum Goeze. Wiad. Parazytol. 1974, 20 (6), 829–837.
a b
c d
WPłYW GRZYBÓW Z RODZAJU METARHIZIUM NA ROZWóJ EMBRIONALNY ASCARIS SUUM 23
3. Lýsek H.: To the problem of possible biological control of geohelmin-thoses. Helminthologia, 1979, 16, 107–113.
4. Mizgajska H.: Wpływ czynników biotycznych na jaja Ascaris spp.
Wiad. Parazytol. 1994, 40 (3), 299–303.
5. Piontek M.: Grzyby pleśniowe. Wyd. Polit. Zielonog., Zielona Góra 1999.
6. Krasnonos L.N.: Mnogoletnaja wyzwaemost jajc ascarid (Ascaris lum-bricoides L., 1758) w pocve Samarkanda. Med. Parazitol. Parazitarn.
Bol. 1978, 47, 103–105.
7. Lýsek H.: A scanning electron microscope study of the effect of an ovicidal fungus on the eggs of Ascaris lumbricoides. Parasitology, 1978, 77, 139–141.
8. Scholte E.-J. et al.: Infection of malaria (Anopheles gambiae s.s.) and filariasis (Culex quinquefasciatus) vectors with the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Malar. J. 2003, 2 (1), 29.
9. Ekesi S., Maniania N.K., Lux S.A.: Effect of soil temperature and mo-isture on survival and infectivity of Metarhizium anisopliae to four tephritid fruit fly puparia. J. Invertebr. Pathol. 2003, 83 (2), 157–167.
10. Sun J., Fuxa J.R., Handerson G.: Effects of virulence, sporulation, and temperature on Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana laboratory transmission in Coptotermes formosanus. J. Invertebr. Pathol.
2003, 84 (1), 38–46.
11. Smits J.E., Johnson D.L., Lomer Ch.: Pathological and physiological responses of ring-necked pheasant chicks following dietary exposure to the fungus Metarhizium flavoviride, a biocontrol agent for locusts in Africa. J. Wildl. Dis. 1999, 35 (2), 194–203.
12. Mazurkiewicz-Zapałowicz K. et al.: Materiały VII Międzynarodowej Konferencji Naukowej Mycotoxins and pathogenic mould in the envi-ronment, Bydgoszcz 2004, 171–176.
13. Engelbrecht H., Buske M.: Przyczynek do badań i oceny jajobójczego działa-nia środków dezynfekcyjnych. Wiad. Parazytol. 1970, 16 (4), 448–455.
14. Kołodziejczyk L. et al.: Antagonistyczny wpływ saprofitycznych grzy-bów glebowych na rozwój pasożytniczych nicieni. Folia Univ. Agric.
Stetin. Zootechnica, 2001, 42, 83–88.
15. Kuźna-Grygiel W. et al.: Effect of some saprotrophic soil fungi on the embryonic development of Ascaris suum (Nematoda). Acta Mycol.
2001, 36 (2), 283–291.
16. Basualdo J.A. et al.: Biological activity of Paecilomyces genus against Toxocara canis eggs. Parasitol. Res. 2000, 86 (10), 854–859.
17. Ciarmela M.L. et al.: Biological interaction between soil fungi and Toxocara canis eggs. Vet. Parasitol. 2002, 103 (3), 251–257.
18. Dożańska W., Iwańczuk I.: Wpływ różnych związków chemicznych na żywotność jaj Ascaris. Acta Parasitol. Pol. 1959, 7 (2), 72–93.
Komentarz
Autorzy podjęli się próby wyjaśnienia ciekawego zagad-nienia dotyczącego oddziaływania grzybów pleśniowych
z rodzaju Metarhizium na rozwój zarodkowy i żywotność larw pasożytniczych geohelmintów Ascaris suum. Uważa się, że jednym z głównych rezerwuarów grzybów tak sapro-fitycznych, jak i chorobotwórczych dla człowieka i zwierząt jest gleba, w której pokarmem dla nich jest między innymi zawarta w ziemi keratyna pochodząca z rozkładających się tu szczątków organicznych. Wykrycie zjawisk antybiozy między grzybami a bakteriami zapoczątkowało erę stoso-wania antybiotyków w medycynie. Ze zjawiskami antybiozy musimy się także liczyć w klinice i w laboratorium, i to nie tylko między grzybami i bakteriami. Grzyby, oddziałując antagonistycznie z różnymi innymi organizmami żyją-cymi w ziemi, odgrywają istotną rolę w utrzymywaniu równowagi glebowego ekosystemu. W ostatnich latach stwierdzono, że grzyby z rodzaju Metarhizium oddziału-ją toksycznie na dorosłe i larwalne postacie niektórych stawonogów. Stąd też zrodził się pomysł wykorzystania tych saprofitycznych grzybów glebowych do zwalczania uciążliwych stawonogów.
Przedstawione w pracy pionierskie badania dotyczą próby zahamowania embriogenezy, a także żywotności rozwiniętych już larw glisty świńskiej, której rozwój jest identyczny jak glisty ludzkiej. Badania te wykazały, że dwa gatunki grzybów pleśniowych z rodzaju Metarhizium przez działanie swoich toksyn mogą doprowadzać do po-wstawania deformacji zarodków w poszczególnych stadiach embriogenezy glisty świńskiej, co często jest przyczyną ich obumierania, jak również mogą powodować zwiększoną śmiertelność dorosłych już larw. Przedstawione wyniki badań są bardzo zachęcające i być może w przyszłości antagoni-styczne oddziaływanie niektórych grzybów pleśniowych może odegrać istotną rolę w ograniczeniu namnażania się pasożytniczych nicieni. Trzeba jednak pamiętać, że niektóre toksyny wytwarzane między innymi przez grzyby pleśniowe, mogą być także szkodliwe dla zdrowia ludzi i zwierząt. Stąd też szersze zastosowanie tej ekologicznej metody zwalczania pasożytniczych nicieni powinno być poprzedzone badaniami wykluczającymi niekorzystny wpływ na organizmy ludz-kie i zwierzęce toksyn wytwarzanych przez poszczególne gatunki grzybów.
prof. dr hab. n. med. Romuald Maleszka
ANNALES ACADEMIAE MEDICAE STETINENSIS
R O C Z N I K I P O M O R S K I E J A K A D E M I I M E D Y C Z N E J W S Z C Z E C I N I E ANNALS OF THE POMERANIAN MEDICAL UNIVERSITY
2006, 52, 1, 25–34
MICHAł RAć