1Katedra Nauk o Środowisku Glebowym, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie
Department of Soil Environment Sciences, The Warsaw Agricultural University
2 Zakład Sanitacji Wsi, Instytut Melioracji i Użytków Zielonych w Falentach Department of Rural Sanitization, Institute for Land Reclamation and Grassland Farming, Falenty
Do badań wybrano szczep grzyba Trametes versicolor, pochodzący z kolekcji University of Alexandria z Aleksandrii. Badany szczep hodowano w temp. 25 ˚C przez 30 dni w warunkach stacjonarnych i wytrząsanych w pożywce z dodatkiem 1% lignocelulozy. Źródłem ligniny i celu-lozy była sieczka lub słoma zmielona z pszenżyta, pszenicy lub żyta. Po 10, 20 i 30 dniach w płynach pohodowlanych określano aktywność lignolityczną (lakkazy, peroksydazy), ogólną ak-tywność enzymów scukrzających celulozę (FP-azy) i akak-tywność karboksymetylocelulazy (CMC-azy).
Produkcja lakazy w hodowli T. versicolor w pożywce z dodatkiem zmielonej słomy zbożowej była wyższa w hodowli wytrząsanej niż w stacjonarnej. Najwyższą produkcję lakkazy w pożywce ze zmieloną słomą wykazano po 30 dniach inkubacji w hodowli wytrząsanej (0,72 µmol· min-1·mg-1 białka) i po 20 dniach inkubacji w hodowli stacjonarnej (0,5 µmol·min-1·mg-1 białka). W przypadku dodatku do pożywki sieczki pszenżyta najwyższą aktywność lakazy uzyskano po 20 dniach inkubacji bez względu na warunki hodowli. W hodowli wytrząsanej aktywność lakazy wynosiła 12,6 µmol·min-1·mg-1 białka natomiast w hodowli stacjonarnej 7,04 µmol·min-1·mg-1
Ewa B. Górska i wsp. 72
Produkcja enzymów celulolitycznych FP-azy i CMC-azy była najwyższa w hodowli stacjo-narnej po 20 dniach inkubacji wynosiła odpowiednio 50 mU· min-1 i 120 mU· min-1.
Aktywność enzymów celulolitycznych określona w hodowlach grzyba w pożywce ze słomą zmieloną była wyższa w warunkach wytrząsanych dla CMC-azy w ciągu całego trwania do-świadczenia. Aktywność FP-azy po 10 dniach była zdecydowanie najwyższa w warunkach wy-trząsania hodowli natomiast w późniejszym czasie ulegała zmniejszeniu o 50%.
Badania enzymatyczne wykazały wpływ rozdrobnienia słomy, czasu i warunków prowadze-nia hodowli na aktywność enzymów lignolitycznych i hydrolitycznych.
SŁOWA KLUCZOWE: Trametes versicolor, lakkaza, celulazy, lignoceluloza
WSTĘP
Lignina i polisacharydy (celuloza, ksylan) to główne związki chemiczne budujące tkanki roślinne. W przyrodzie substancje te rozkładane są przez bakterie i grzyby do związków prostych takich jak celobioza, glukoza i inne. Grzyby w zależności od uzdol-nień do biosyntezy określonych enzymów mogą rozkładać wybiórczo ligninę bądź celulozę lub w różnych proporcjach równocześnie oba związki chemiczne. W związku z tym wyróżniamy grzyby tzw. białego, brunatnego i szarego rozkładu [Adb El-Nesser i wsp., 1997; Breen i Singleton, 1999; Krajewski i Witomski, 2003; Leatham, 1986; Morais i wsp., 2001; Pazarlioglu i wsp., 2005; Perez i wsp., 2002; Rodriguez i wsp., 2003; Rodriguez i wsp., 2004; Young i wsp., 1995].
Trametes versicolor, należący do klasy Basidiomycetes, jest grzybem powszechnie występującym w Polsce i na świecie, głównie kolonizującym drzewa liściaste, spora-dycznie iglaste, a także drewno użytkowe. Grzyb T. versicolor z racji biosyntezy enzy-mów lignolitycznych (lakkazy, peroksydazy ligninowej i innych) i hydrolitycznych zaliczany jest do grzybów „białego rozkładu” [Rodriguez i wsp., 2003; Rodriguez i wsp., 2004].
Celem pracy jest zbadanie produkcji lakazy i enzymów celulolitycznych w hodowli grzyba Trametes versicolor w pożywce płynnej z dodatkiem słomy pszenżytniej, psze-nicznej i żytniej. Również podjęto pracę wykazania wpływu stopnia rozdrobnienia sło-my, warunków i czasu trwania hodowli na produkcję badanych enzymów.
MATERIAŁY I METODY
Do badań wybrano szczep grzyba Trametes versicolor, pochodzący z kolekcji University of Alexandria z Egiptu, który hodowano na podłożu ziemniaczano--glukozowym w płytkach Petriego w temp. 25 ˚C. Z podłoża hodowlanego wycięto jałowo 10 kwadratów o wymiarach 10x10 mm i wprowadzono do 100 ml płynnej po-żywki ziemniaczano-glukozowej. Po upływie 10 dni 10 ml tak przygotowanego inocu-lum wsiewano do 100 ml pożywki produkcyjnej w oparciu o zmodyfikowaną pożywkę Czapeka [Burbianka, 1983]. Modyfikacja pożywki polegała na zastąpieniu 1% sacharo-zy zmieloną lub pociętą słomą pszenżyta odmiany Tornado, żytnią odmiany Hegro lub
Wytwarzanie enzymów celulolitycznych i lignolitycznych ... 73
pszeniczną odmiany Korweta. W celu oznaczenia aktywności lignolitycznej i celuloli-tycznej badany szczep grzyba hodowano w temp. 25 ˚C przez 30 dni w warunkach stacjonarnych i wytrząsanych (150 obr. na minutę) w pożywce produkcyjnej. Po 10, 20 i 30 dniach określano w płynach pohodowlanych aktywność lakkazy, ogólną aktywność celulolityczną (FP-azy) i aktywność karboksymetylocelulazy (CMC-azy).
Aktywność lakkazy oznaczano zmodyfikowaną metodą Leonowicza i Grzywnowi-cza z użyciem syryngaldazyny jako substratu [Leonowicz i Grzywnowicz, 1981]. Ak-tywność enzymu wyrażono w µmolach produktów, otrzymanych w wyniku działania lakkazy na substrat w warunkach oznaczenia (temp. 27 ˚C, pH 5,0), przeliczonych na mg białka w ciągu minuty.
Aktywność enzymów celulolitycznych oznaczono metodami zalecanymi przez Mię-dzynarodową Komisję Biotechnologii [Ghose, 1987]. Metody te polegają na pomiarze ilości cukrów redukujących, uwalnianych podczas działania roztworu enzymu na sub-strat. W przypadku oznaczania FP-azy jako substrat stosowano 50 mg bibuły Whatman No 1, dla CMC-azy 2% roztwór karboksymetylocelulozy. Miarą aktywności FP-azy i CMC-azy była taka ilość enzymu, która uwalnia 1 µmol cukrów redukujących (w prze-liczeniu na glukozę), w ciągu 1 minuty w warunkach oznaczenia (pH 4,8; temp. 50 ˚C).
WYNIKI I DYSKUSJA
Wzrost, rozwój i wytwarzanie enzymów w hodowlach grzybów „białego rozkładu” jest uzależniona od wielu czynników, między innymi od odczynu i stanu skupienia pożywki, czasu i temperatury inkubacji, substratów lignocelulozowych oraz dodatku witamin, aminokwasów, a także mikro- i makropierwiastków do pożywki. Badania enzymatyczne w hodowli szczepu grzyba Trametes versicolor wykazały wpływ roz-drobnienia słomy, czasu i warunków prowadzenia hodowli na biosyntezę lakkazy i enzymów celulolitycznych. Podobne wyniki nad aktywnością produkowanych enzy-mów przez grzyby „białego rozkładu” należących do klasy Basidiomycetes hodowanych w pożywce płynnej uzyskali między innymi Tekere i wsp. [2001], Masaphy i Levanon [1992] oraz Jang i wsp. [2001] .
Wyniki prezentowane na rysunku 1 wskazują, że produkcja lakkazy w hodowli T. versicolor z dodatkiem zmielonej słomy zbożowej była nieznacznie wyższa w ho-dowli wytrząsanej niż w stacjonarnej. Aktywność lakkazy w pożywce ze zmieloną słomą po 30 dniach inkubacji w hodowli wytrząsanej wynosiła 0,72 µmol·min-1·mg-1
białka, a po 20 dniach inkubacji w hodowli stacjonarnej była nieznacznie niższa (0,5 µmol·min-1·mg-1 białka). W przypadku dodatku do pożywki sieczki pszenżytniej naj-wyższą aktywność lakkazy uzyskano po 20 dniach inkubacji bez względu na warunki hodowli. W hodowli wytrząsanej aktywność lakkazy wynosiła 12,6 µmol·min-1·mg-1
białka, natomiast w hodowli stacjonarnej 7,04 µmol·min-1·mg-1 białka.
Bollag i Leonowicz [1984] wykazali intensywniejszy wzrost grzybni T. versicolor i Pleurotus ostreatus w warunkach hodowli stacjonarnej niż wytrząsanej. Warunki ho-dowli nie wpływały jednakże na intensywność wzrostu szczepu grzyba Rhizoctonia practicola. Badania przeprowadzone w ramach niniejszej pracy nie potwierdzają wyni-ków analiz Bollaga i Leonowicza [1984] nad wpływem warunwyni-ków hodowli na
inten-Ewa B. Górska i wsp. 74
sywność wzrostu grzybni i aktywność lignolityczną Trametes versicolor. Jak wynika z rysunku 1, wytrząsanie wpływało na intensywność wzrostu grzybni i aktywność enzy-matyczną T. versicolor. Badany szczep grzyba hodowany w pożywce z dodatkiem sieczki pszenżytniej, żytniej i pszenicznej (tab. 1) wykazywał wyższą aktywność lakka-zy w warunkach hodowli wytrząsanej niż stacjonarnej.
Levin i Forchiasin [2001], Teker i wsp. [2001] wykazali, że aktywność lakkazy w hodowlach grzybów z klasy Basidiomycetes zależy od czasu prowadzenia hodowli, co potwierdzają również niniejsze badania. Aktywność lakkazy wytwarzanej przez T. ver-sicolor wzrastała w ciągu trwania hodowli, uzyskując bez względu na warunki najwyż-szą aktywność po 20 dniach hodowli. Związane to jest z faktem, że ligninazy są synte-tyzowane w metabolizmie wtórnym. Oznacza to, że grzyb wytwarza je wówczas, gdy w pożywce będzie się zmniejszać ilość łatwo dostępnych źródeł węgla. Ponieważ słoma zbudowana jest nie tylko z ligniny ale z celulozy i hemiceluloz (ksylan, mannan, galak-tan), związki te będą w pierwszej kolejności rozkładane jako łatwiej podatne na rozkład enzymatyczny niż lignina.
Tabela 1 Table 1 Aktywność lakkazy, FP-azy i CMC-azy w kulturach Tramates versicolor hodowanego na słomie
pszenżyta
Activity of laccase, FP-ase and CMC-ase in cultures of Tramates versicolor cultivated on triticale straw Słoma zmielona Grounded straw Słoma pocięta Chopped straw Dni hodowli Days of incubation Dni hodowli Days of incubation Typ hodowli Type of cultivation 10 20 30 10 20 30
Lakkaza (µmol·min-1·mg-1 białka) Laccase (µmol·min-1·mg-1 protein) Stacjonarna Stationary 0,10 0,50 0,30 0,20 6,50 5,90 Wytrząsana Shaken 0,50 0,60 0,72 2,20 12,20 8,10 FP-aza (mUFP·min-1) FP-ase (mUFP·min-1) Stacjonarna Stationary 29 20 10 10 50 20 Wytrząsana Shaken 40 15 20 20 30 22 CMC-aza (mUCMC·min-1) CMC-asea (mUCMC·min-1) Stacjonarna Stationary 37,0 29,5 20,0 15,0 120,0 20,0 Wytrząsana Shaken 65,0 70,0 60,0 70,0 60,0 50,0
Wytwarzanie enzymów celulolitycznych i lignolitycznych ... 75 Tabela 2 Table 2 Aktywność lakkazy, FP-azy i CMC-azy w kulturach Tramates versicolor hodowanego na słomie
pszenicy ozimej lub żytniej
Activity of laccase, FP-ase and CMC-ase in cultures of Tramates versicolor cultivated on winter wheat or rye straw
Słoma pszenicy ozimej Winter wheat straw
Słoma żytnia Rye straw Dni hodowli
Days of incubation Days of incubationDni hodowli Typ hodowli
Type of cultivation
10 20 30 10 20 30
Lakkaza (µmol·min-1·mg-1 białka) Laccase (µmol·min-1·mg-1 protein) Stacjonarna Stationary 1,00 3,25 3,00 2,00 5,00 8,00 Wytrząsana Shaken 2,25 2,75 3,30 48 68 15 FP-aza (mUFP·min-1) FP-ase (mUFP·min-1) Stacjonarna Stationary 20 40 21 30 80 10 Wytrząsana Shaken 19 39 18 10 30 20 CMC-aza (mUCMC·min-1) CMC-asea (mUCMC·min-1) Stacjonarna Stationary 60 80 100 40 100 220 Wytrząsana Shaken 20 50 45 50 49 45
Adb El-Nesser i wsp. [1997] prowadzili badania nad biosyntezą enzymów hydroli-tycznych (ksylanaz i celulaz) w hodowli grzybów Phanerocheate chrysosporium i Co-riolus versicolor. Grzyby hodowano na odpadach przemysłu rolniczego, takich jak: słoma pszenna, rozdrobnione kolby kukurydzy, plewy ryżowe, łupiny orzechów ziem-nych. Optymalne warunki do produkcji enzymów celulolitycznych zapewnia pożywka z dodatkiem słomy pszenicznej o odczynie kwaśnym. Na produkcję ksylanazy w jedna-kowym stopniu wpływał rodzaj dodawanych do pożywki odpadów rolniczych. Najwyż-szą aktywność produkowanych enzymów celulolitycznych (rys. 2, rys. 3) przez T. ver-sicolor obserwowano w hodowli stacjonarnej po 20 dniach inkubacji. W tych warun-kach aktywność wytwarzanej FP-azy i CMC-azy wynosiła odpowiednio 50 mU·min-1 i 120 mU·min-1. W warunkach wytrząsania hodowli najwyższą produkcję FP-azy stwierdzono po 10 dniach inkubacji, natomiast w późniejszym czasie aktywność ta ulegała zmniejszeniu o 50%. Aktywność enzymów celulolitycznych określona w ho-dowlach badanego grzyba w pożywce ze słomą zmieloną była wyższa w warunkach wytrząsanych dla CMC-azy w ciągu całego trwania doświadczenia. Aktywność FP-azy po 10 dniach była zdecydowanie najwyższa w warunkach wytrząsania hodowli, nato-miast w późniejszym czasie ulegała zmniejszeniu o 50%.
Ewa B. Górska i wsp. 76
WNIOSKI
1. Trametes versicolor syntetyzuje lakkazę oraz enzymy rozkładające celulozę amorficzną i krystaliczną.
2. Biosynteza badanych enzymów zależy od substratu lignocelulozowego, czasu i warunków hodowli (stacjonarna, wytrzasana),
3. Zmielona słoma z pszenżyta wpływała niekorzystnie na wytwarzanie lakkazy w hodowli T. versicolor.
4. Najlepszym induktorem do produkcji lakkazy była pocięta słoma żytnia.
5. Stopień rozdrobnienia słomy pszenżyta nie wpłynął znacząco na produkcję enzy-mów celulolitycznych.
PIŚMIENNICTWO
Adb El-Nesser N.H., Helmy S., El-Gammal A.A.: 1997. Formation pf enzymes by biodegradation of agricultural wastes with white rot fungi. Polymer Degradation and Stability., nr 55, 249–255.
Bollag J. M., Leonowicz A.: 1984. Comperative studies of extracellular fungal laccase. App. Environ. Microbiol., nr 48, 849–854.
Breen A., Singleton F. L.: 1999. Fungi in lignocellulose breakdown and biopulping. Environ-mental Biotechnol., nr 10, 251–258.
Ghose T.K. :1987. Measurement of cellulose activities IUPAC, Pure Apl. Chem. Nr 59, 257. Jang M.Y., Ryu W.R., Cho M.H.: 2001. Laccase production from repeated batch cultures using
free mycelia of Enzymes Microbiol. Technol., nr 30, 741–746.
Krajewski A., Witomski P.: 2003. Ochrona Drewna. Wydawnictwo SGGW, Warszawa, s. 271. Leonowicz A., Grzywnowicz K.: 1981. Quantitative estimation of laccase forms in some
white-rot fungi using siringaldazineas as substrate. Enzyme. Microbiol. Technol., nr 3, 55–57. Masaphy S., Levanon D.: 1992. Appl. Microbiol. Biotechnol., nr 36, 828–832.
Morais H., Ramos C., Forgack E., Csershati T., Oliviera J.: 2001, Lignin modifying enzymes of Pleurotus ostreatus grown on agroresidues. Acta Alimentaria, nr 30, 363–372.
Pazarlioglu N. K., Sariisik M., Telefoncu A.: 2005. Laccase: production by Trametes versicolor and application to denim washing. Process Bichemistry, nr 40, 1673–1678.
Perez J., Munoz-Dorado J., De la Rubia T., Marinez J.: 2002. Biodegradation and treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: An overview. Int. Microbiol., nr 5, 53–63.
Rodriguez Couto S., Moldes D., Liebanas A., Sanroman A.: 2003. Investigation of several biore-actor configurations for laccase production by Trametes versicolor operating solid state conditions. Biochemical Engineering Journal, nr 15, 21–26.
Rogalski J., Hatakka A., Konga B., Leonowicz A.: 1993. Hemicellulolytic enzymes of the ligno-lytic white-rot fungus Phlebia radiata, determination of enzyme activities. Act. Biotech-nol., nr 13, 47–51.
Singh S., du Preez J. C., Pillay B., Prior B. A.: 2000. The production of hemicelluloses by Ther-momycetes lanuginosus strain SSBP. Appl. Microbiol. Biotechnol., nr 54, 698–704. Tekere M., Mswaka A. Y., Zvauya R., Read J. S.: 2001. Enzyme. Microbiol. Technol. nr 28,
420–426.
Toczko M., Grzelińska A.: 1997. Materiały do Ćwiczeń z Biochemii. Wydawnictwo SGGW, Warszawa, s. 133.
Wytwarzanie enzymów celulolitycznych i lignolitycznych ... 77
PRODUCTION OF CELULLOLYTIC AND LIGNOLYTIC ENZYMES BY TRAMETES VERSICOLOR IN CULTURE MEDIUM AMENDED
WITH DIFFERENTLY SHREDS CEREAL STRAWS S u m m a r y
The studies were performed with the strain of fungus Trametes versicolor obtained from Uni-versity of Alexandria culture collection. This strain was cultivated in medium amended with 1% of lignocelluloses at 25C by 30 days. Cultures were shaken or grown stationary. As the sources of lignin and cellulose the chopped or grounded cereal straws were applied. The lignoliytic and cellulolytic activity were measured after 10, 20, 30 days of incubation. The production of laccase by T. versicolor in the medium amended with grounded cereal straws was higher in shaken than in stationary cultures. The highest production of laccase in culture medium amended with grading wheat-rye straw was show after 30 days of incubation under shaking condition and 20 days under stationary conditions. In the case of culture amended with chopped cereal straws the higest cellu-lolytic and lignolytic production occur after 20 days of incubation in shaken cultures. The ob-tained results shows the effect of degree of fragmentation, time and condition of incubation on the production of investigated enzymes.
KEY WORDS: Trametes versicolor, cereal straws, laccase, cellulolytic enzymes