1Zakład Mikrobiologii Rolniczej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie
1Department of Agricultural Microbiology, Warsaw Agricultural University
2Zakład Chemii Rolniczej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie
2Department of Agricultural Chemistry,Warsaw Agricultural University
Celem pracy była charakterystyka izolowanych wcześniej z gleby bakterii zdolnych do utle-niania siarki, występujących w glebach o różnym systemie nawożenia: mineralnym (NPK) i organicznym (obornik). Próbki gleby pochodziły z trwałego doświadczenia nawozowo--płodozmiennego w Łyczynie oraz statycznego doświadczenia nawozowego w Stacji Doświad-czalnej w Skierniewicach (SGGW). Do hodowli i izolacji tlenowych bakterii zdolnych do utle-niania związków siarki stosowano m.in. podłoże wg Czaban i Kobus [2000]. Do hodowli użyto metody płytek lanych i wysiewu powierzchniowego. Wykonano badania makroskopowe i mikro-skopowe izolowanych kolonii. Preparaty bakterii barwione m.in. metodą Grama, oglądane w mikroskopie świetlnym, porównywano z preparatami uzyskanymi z hodowli oraz bezpośrednio z próbek gleby (in situ) – z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego Nikon. Do badań zastosowano komputerową metodę analizy obrazu z kamery mikroskopu. Identyfikację uzyskanych izolatów oparto o klasyfikację wg Bergey’a [Buchanan i Gibbons, 1974]. Zidentyfikowane bakterie nale-żały m.in. do rodzajów: Thiobacillus oraz Thiovulum i występowały w glebach obu systemów nawozowych.
SŁOWA KLUCZOWE: bakterie siarkowe, gleba, nawożenie, Thiobacillus, Thiovulum
WSTĘP
Siarka jest pierwiastkiem szeroko rozpowszechnionym w przyrodzie oraz składni-kiem niezbędnym do życia roślin i zwierząt. W warunkach naturalnej homeostazy
śro-Julitta Gajewska i wsp. 66
dowiska glebowego o zaopatrzeniu roślin w siarkę decyduje stan dynamicznej równo-wagi między mineralizacją materii organicznej a biologicznym unieruchomieniem tego składnika. W procesie tym ogromną rolę odgrywają bakterie siarkowe, głównie z rodzaju Thiobacillus, a także grzyby żyjące w glebie. Procesy utleniania nieorganicznych związków siarki przeprowadzane przez tę grupę bakterii stanowią ważne ogniwo w obiegu siarki w przyrodzie [Kurek, 1984]. Według Barrowa [1980], jeżeli zawartość siarki w rozkładanym materiale jest mniejsza od 0,13%, to cała uwalniana siarka jest zużywana przez bakterie siarkowe, a rośliny cierpią z powodu niedoboru tego składni-ka. Na zawartość siarki dostępnej dla roślin wpływa również odczyn gleby. Odczyn zasadowy przyspiesza rozkład materii organicznej i uwalnianie siarki, natomiast przy niższym pH zwiększa się adsorpcja siarczanów przez uwodnione tlenki żelaza i glinu oraz kaolinit [Johnson, 1984]. Podobnie jak niedobór – może być również groźny nad-miar tego pierwiastka w glebach. Przyczyną tego zjawiska jest zanieczyszczenie gleb związkami siarki wskutek antropopresji [Motowicka-Terelak i Terelak, 2000]. Siarka i produkty jej przemian wprowadzane do gleby w nadmiarze – mogą niekorzystnie wpływać na środowisko glebowe powodując obniżenie odczynu gleby, co może powo-dować uruchomienie znacznych ilości glinu [Drożdż-Hara, 1978; Gądor i Motowicka-Terelak, 1980; Nilsson i wsp., 1983].
Celem pracy była charakterystyka morfologiczna i fizjologiczna oraz dokumentacja zdjęciowa izolowanych wcześniej [Gajewska i wsp., 2005] z gleby bakterii zdolnych do utleniania siarki, występujących w glebach o różnym systemie nawożenia: mineralnym (NPK) i organicznym (obornik). Próbki gleby pochodziły z trwałego doświadczenia nawozowo-płodozmiennego w Łyczynie oraz statycznego doświadczenia nawozowego w Stacji Doświadczalnej w Skierniewicach (SGGW).
MATERIAŁY I METODY
Badania zostały przeprowadzone w Stacji Doświadczalnej w Skierniewicach (SGGW) oraz na trwałym doświadczeniu nawozowo-płodozmiennym, założonym w Łyczynie k.Warszawy, na polu doświadczalnym (SGGW). Doświadczenie rozpoczęto w maju 2003 roku, a zakończono w czerwcu 2004 roku.
W Stacji Doświadczalnej w Skierniewicach występują gleby płowe. Na polu do-świadczalnym RZD w Łyczynie występują również gleby płowe, wytworzone z glin i piasków zwałowych. Wierzchnią warstwę pola stanowi piasek gliniasty, czasem słabo-gliniasty, zalegający na glinie zwałowej lekkiej. Na polu w Łyczynie uprawiano w pło-dozmianie następujące rośliny: żyto, ziemniaki, ryż, jęczmień jary, koniczyna czerwona i pszenica ozima. Badano obecność bakterii na poletkach z następującymi kombinacja-mi nawozowykombinacja-mi:
Doświadczenie w Łyczynie: kontrola (bez nawozu), NPK, obornik (12,5t ha-1), Ca, NPK + obornik, Ca NPK + obornik.
Doświadczenie w Skierniewicach:
Doświadczenie 1: kontrola (bez nawozu) i superfosfat pojedynczy, superfosfat potrójny (oba nawozy w dawce 26,2 kg P h-1);
Charakterystyka morfologiczna i fizjologiczna glebowych bakterii ... 67
Skład gatunkowy wyizolowanych mikroorganizmów występujących w próbkach gleb z Łyczyna i Skierniewic przedstawiono w pracy Gajewskiej i wsp. [2005]. W obecnej pracy przedstawiono charakterystykę i dokumentację zdjęciową wyizolowa-nych bakterii siarkowych z wybrawyizolowa-nych próbek gleby. Próby do analiz mikrobiologicz-nych pobrano wiosną, w kwietniu i maju 2003 roku. Na ich podstawie dokonano oceny wpływu różnych systemów nawożenia na wzrost i rozwój tlenowych bakterii siarko-wych. W pobranych próbach oznaczono ogólną liczbę: bakterii właściwych, promie-niowców, grzybów strzępkowych i drożdży. Próbkę reprezentacyjną gleby uzyskano przez pobranie z danego terenu trzech równoległych próbek gleby laską Egnera, z głę-bokości od 0 do 25 cm. Z próbek izolowano bakterie siarkowe na następujących podło-żach: wg Czaban i Kobus [2000], Bunta i Roviry z dodatkiem nystatyny. Hodowle in-kubowano przez 48 godzin w temperaturze 28 oC. Badania morfologiczne drobno-ustrojów objęły badania makroskopowe kolonii, które pozwoliły na wstępną klasyfika-cję ze względu na ich charakterystyczne cechy, dotyczące m.in. rozmiarów kolonii, kształtu, konsystencji czy wytwarzania barwnika. Do badań mikroskopowych zastoso-wano preparaty barwione metodą prostą (fuksyną), złożoną (met. wg Grama), barwione negatywnie nigrozyną, oraz preparaty przyżyciowe oglądane przy powiększeniu 1250 razy. Preparaty oglądano przy użyciu mikroskopu Nikon. Do badań zastosowano kom-puterową metodę analizy obrazu z kamery mikroskopu. Zastosowanie tego mikroskopu pozwoliło m.in. na obserwację inkluzji siarki wewnątrz komórek bakterii, co było jedną z ważniejszych cech morfologicznych tlenowych bakterii, zdolnych do utleniania związków siarki.
WYNIKI I DYSKUSJA
Ze wszystkich badanych próbek gleby izolowano tlenowe bakterie siarkowe. Na podstawie obserwacji cech morfologicznych i fizjologicznych określono skład rodzajo-wy i gatunkorodzajo-wy bakterii, zgodnie z systematyką Bergey’a [Buchanan i Gibbons, 1974]. Niezależnie od rodzaju kombinacji nawozowej wyizolowano bakterie należące do róż-nych rodzajów, takich jak: Thiobacillus, Thiovulum, Macromonas, Achromatium (tab. 1).
Występowanie ich stwierdzono również w próbkach kontrolnych. Dominowały bakterie z rodzaju Thiobacillus, szczególnie liczne zarówno w próbkach kontrolnych w Łyczynie, jak i nawożonych NPK i NPK + obornik (Łyczyn). W próbkach doświadcze-nia w Skierniewicach bakterie te dominowały w próbkach nawożonych obornikiem. Stwierdzono dużą różnorodność gatunków z rodzaju Thiobacillus: T. intermedius, T. perometabolis, T. tepidarius, T. versutus, T. novellus, T. thioparus, T. thiooxidans, T. albertis, T. ferrooxidans. Na rysunkach 1A–F przedstawiono zdjęcia wybranych izolatów z próbek gleby nawożonych mineralnie i organicznie. Bakterie z rodzaju Thio-bacillus stwierdzono nawet w próbkach gleby nawożonych wysoką dawką obornika (60t ha-1). Jest to interesujące z uwagi na autotrofię badanych bakterii siarkowych, wy-trzymujących konkurencję z bakteriami alochtonicznymi, pochodzącymi z obornika.
Julitta Gajewska i wsp. 68
Rys. 1 A – F Bakterie siarkowe izolowane z badanych próbek gleby (1250x) A – Thiovulum sp. izolowane z gleby nawożonej superfosfatem (Skierniewice) B – Thiovulum sp. izolowane z gleby kontrolnej (Łyczyn)
C – Thiobacillus sp. w hodowli mieszanej, gleba nawożona NPK (Łyczyn)
D – Thiobacillus thiooxidans w hodowli mieszanej, z gleby nawożonej obornikiem 20t ha-1
(Skierniewice)
E, F – Thiobacillus sp. izolowane z gleby nawożonej NPK + obornik (12,5t ha-1) (Łyczyn) Rys. 1. A – F The sulphur bacteria isolated from the samples of soil (1250x)
A – Thiovulum sp. isolated from soil superphosphate fertilized (Skierniewice) B – Thiovulum sp. isolated from the control soil (Łyczyn)
C – Thiobacillus sp. in the mixed culture, soil NPK fertilized (Łyczyn)
D – Thiobacillus thiooxidans in the mixed culture, soil manure fertilized 20t ha-1 (Skierniewice) E, F – Thiobacillus sp. isolated from soil NPK fertilized + manure fertilized (12,5t ha-1) (Łyczyn)
Charakterystyka morfologiczna i fizjologiczna glebowych bakterii ... 69 Tabela 1 Table 1 Skład gatunkowy wyizolowanych bakterii zdolnych do utleniania związków siarki występujących
w próbkach gleby o różnym systemie nawozowym
The sulphur oxidizing bacteria isolated from the soil from the different fertilization combinations of the crops experiment
Rodzaj nawożenia Kind of fertilization Izolaty bakterii
Isolated bacteria Łyczyn Skierniewice
Macromonas sp. – superfosfat, kontrola (II), obornik (20t ha-1)
Thiobacillus albertis – obornik (40t ha-1) Thiobacillus intermedius – kontrola (II),
obornik (20,40,60 t ha-1)
Thiobacillus novellus Kontrola –
Thiobacillus perometabolis kontrola, NPK+obornik obornik (40 t ha-1) Thiobacillus tepidarius kontrola, obornik, NPK –
Thiobacillus thiooxidans NPK superfosfat pojedynczy, obornik (20 t ha-1) Thiobacillus thioparus kontrola, NPK,
NPK+obornik, Ca+NPK
kontrola (II), obornik (60 t ha-1) Thiobacillus versutus kontrola, NPK+obornik –
Thiovulum sp. kontrola, NPK superfosfat
WNIOSKI
1. Spośród izolowanych tlenowych bakterii siarkowych dominowały bakterie z ro-dzaju Thiobacillus i Thiovulum.
2. Do izolacji bakterii siarkowych z gleby bardzo przydatne może być podłoże stałe wg Czaban i Kobus [2000], o odczynie 7,2, gdyż na płynnym podłożu uzyskano słaby wzrost.
3. Najwięcej szczepów tlenowych bakterii siarkowych izolowano z gleby kontrolnej w Łyczynie oraz gleby nawożonej NPK (Łyczyn). Mniej szczepów wyizolowano z gleby nawożonej superfosfatem potrójnym granulowanym oraz superfosfatem pojedyn-czym w Skierniewicach.
4. Zastosowanie mikroskopu fluorescencyjnego oraz analizy komputerowej pozwo-liło na obserwację inkluzji komórkowych (siarki) ważnych przy identyfikacji bakterii zarówno in situ, jak i w hodowlach.
Julitta Gajewska i wsp. 70
PIŚMIENNICTWO
Barrow N.J.: 1980. A comparison of the mineralization of nitrogen and sulphur from decompos-ing organic materials. Aust. J. Agric. Res., 11, 960–969.
Buchanan R.E., i Gibbons N.E. (Editor-in-Chief): 1974. Bergey's Manual of Systematic Bacteri-ology 8th ed. The Williams and Wilkins Co, Baltimore, 450–471.
Czaban J. Kobus J.: 2000. Oxidation of elementary sulfur by bacteria and fungi in soil. Acta Microbiol. Pol., 49 (2), 135–147.
Drożdż-Hara K.: 1978. Studia nad wpływem zanieczyszczenia siarką na przemiany gleb upraw-nych w sąsiedztwie kopalni siarki. Niektóre właściwości chemiczne gleby skażonej siarką – doświadczenie modelowe. Część I. Rocz. Glebozn., 29 (1), 141–162.
Gądor I., Motowicka-Terelak T.: 1980. Wpływ skażenia siarką na właściwości gleb, plonowanie i skład chemiczny roślin w doświadczeniu lizymetrycznym. Mat. Konf. Cz. II „Wpływ za-nieczyszczenia pierwiastkami śladowymi i siarką na przyrodnicze warunki rolnictwa” IUNG Puławy, 129–134.
Gajewska J., Olejnik K., Parzydeł M., Rastawicka M., Miszczyk A., Szulc W.: 2005. Wpływ różnych systemów nawozowych na mikroflorę glebową ze szczególnym uwzględnieniem tlenowych bakterii siarkowych. Fragmenta Agronomica, 1 (85), 62–73.
Johnson D. W.: 1984. Sulphur cycling in forest. Biogeochemistry, 1, 29–43.
Kurek E.: 1983. Utlenianie nieorganicznych związków siarki przez drobnoustroje. Post. Mikro-biol., 22 (34), 301–334.
Motowicka-Terelak T., Terelak H.: 2000. Siarka w glebach i roślinach Polski. Folia Univ. Agric. Stetin. 204 Agricultura, 81, 7–16.
Nilsson S. I., Wiklander G., Farell E. P.: 1983. Stress of exchangeable base cations and alumin-ium in lysimeters previously treated with sulphuric acid or NPK with or without irriga-tion. For. Ecol. Manag., 5 (2): 87–108.
MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTIC OF SULPHUR OXIDIZING SOIL BACTERIA
S u m m a r y
The aim of the work was to investigate the influence of the different fertilization systems on the occurrence of the aerobic oxidizing bacteria in a long-term fertilization-crop study in the Łyczyn and in the static fertilization study at the Experimental Station in the Skierniewice. In this paper, the qualitative investigation of the sulphur bacteria was presented. The obtained results indicate the significant influence of the fertilization on the number of microorganisms, but in all of the kind of fertilized soil were isolated different sulphur bacteria despite the present of raised quantity of the organic matter (in soil manure fertilized). Isolated strains of the sulfur bacteria first of all belong to the genera Thiobacillus and Thiovulum.
KEY WORDS: soil fertilization, sulfur bacteria, Thiobacillus, Thiovulum