Badania przeprowadzono w Katedrze Mikrobiologii AR w Krakowie w okresie od maja do października 2004 roku.
Próbki gleby do badań mikologicznych zostały pobrane z pięciu reprezentacyjnych miejsc w Krakowie i jego okolicach:
1) Poletka doświadczalne AR w Krakowie–Mydlnikach, gleba płowa użytkowana rolniczo. 2) Okolice cementowni w Krakowie–Pleszowie, gleba piaszczysta użytkowana rolniczo. 3) Ogródki działkowe w Krakowie – okolica Ronda A. Matecznego, gleba piaszczysta
utworzona z lessu.
4) Poletka doświadczalne AR w Prusach k.Krakowa, zdegradowany czarnoziem wy-tworzony z lessu.
5) Okolice Tynieckiego Parku Krajobrazowego, rędzina – obszar ten na mapie glebo-wo-rolniczej opisany jest jako nieużytek – kontrola.
Glebę do badań pobierano z wierzchniej warstwy gleby na głębokości 10–20 cm, w ilości 0,5 kg do wyjałowionych kolbek Erlenmayera, raz w miesiącu z zachowaniem zasad czystości mikrobiologicznej. Analizy mikologiczne przeprowadzono metodą
posiewu rozcieńczeń. Inkubację grzybów przeprowadzono na brzeczce w temp. 28 oC
Uzdolnienia do produkcji mikotoksyn ... 45 poddano szczegółowym studiom taksonomicznym zgodnie z wymogami diagnostyki mikroorganizmów [Gilman, 1947; Raper i wsp., 1968]. Badanie toksyczności dotyczyło metabolitów szczepów grzybów potencjalnie toksynotwórczych. Przeszczepiano je na płynne podłoże Eldrige`a. Hodowlę prowadzono w temperaturze pokojowej przez 14 dni.
W celu stwierdzenia zdolności do produkcji toksyn przez metabolity wyizolowa-nych szczepów wykonano test biologiczny wg Mirczink [1957]. Rośliną testową był groch łuskany o nasionach marszczonych „Nike” ST 93137/115/24G/C. Za toksyczne uznano te szczepy grzybów, których metabolity spowodowały zahamowanie energii kieł-kowania i zdolności kiełkieł-kowania nasion grochu powyżej 30% w stosunku do kontroli.
WYNIKI I DYSKUSJA
Mikologiczne badania gleb wykazały w nich znaczne zróżnicowanie liczebności grzybów mikroskopowych Micromycetes. Jak wynika z danych przedstawionych na rysunku 1, największą średnią arytmetyczną liczebność grzybów z całego okresu
trwa-nia doświadczetrwa-nia (234 x 103 j.t.k.g-1 gleby) wykazano w punkcie badawczym nr 3
(Rondo A. Matecznego), a najmniejszą (60,5 x 103 j.t.k.g-1 gleby) w Tynieckim Parku
Krajobrazowym (punkt badawczy nr 5). W pozostałych punktach badawczych wartości
średniej arytmetycznej kształtowały się w granicach 102-159 x 103 j.t.k.g-1 gleby.
Oprócz analizy ilościowej wykonano także badania taksonomiczne. Skład gatunkowy przedstawiono w tabeli 1. W badanych środowiskach glebowych stwierdzono obecność dziewiętnastu gatunków grzybów. Są to przedstawiciele przede wszystkim klasy Deute-romycetes.
W poszczególnych punktach badawczych, wśród wyizolowanych gatunków grzybów mikroskopowych, stwierdzono obecność gatunków potencjalnie toksynotwórczych.
Należały one do następujących rodzajów: Alternaria , Aspergillus, Fusarium i Peni-cillium.
Biorąc pod uwagę fakt, że gleba pobrana do badań pochodziła z terenów znajdują-cych się w obrębie Krakowa oraz bliskim jego sąsiedztwie, stąd liczba wyizolowanych gatunków potencjalnie toksynotwórczych była znaczna. Wśród 19 wyizolowanych gatunków grzybów 10 uznano za potencjalnie toksynotwórcze. Najwięcej ich było w glebie pobranej z ogródków działkowych w okolicy Ronda A. Matecznego (7 ków) oraz z gleby pobranej w okolicach cementowni w Krakowie–Pleszowie (6 gatun-ków). Z gleby pobranej z pól uprawnych położonych na terenach doświadczalnych AR w Krakowie–Mydlnikach wyizolowano 4 gatunki, w Prusach 5 gatunków, a najmniej z gleby pobranej na terenie Tynieckiego Parku Krajobrazowego – 2 gatunki. Kształtowa-nie się gatunków grzybów potencjalKształtowa-nie toksynotwórczych wyizolowanych z badanych środowisk glebowych przedstawiono w tabeli 2. Częstotliwość występowania gatunków grzybów potencjalnie toksynotwórczych była wyższa w glebie pobranej w okolicy bę-dącej pod wpływem silnych emisji przemysłowych (Rondo A. Matecznego, cementow-nia w Krakowie–Pleszowie) w porównaniu z glebą, znajdującą się w znacznej odległo-ści od źródeł emisji (Kraków–Mydlniki, Prusy k.Krakowa) bądź też nie objętą tymi emisjami (Tyniecki Park Krajobrazowy). Występowanie grzybów toksynotwórczych w środowiskach glebowych jest przede wszystkim nastepstwem antropogennej ingerencji człowieka w układy biocenotyczne [Barabasz, Vŏrisek, 2002].
Helena Bis 46 159,0 138,5 234,0 102,0 60,5 0 50 100 150 200 250 1 2 3 4 5
Obiekty badawcze Experimental objects
Li cz ebn ość gr zy bó w w 1 g gl eb y [ w t ys .] N um ber o f fung i i n 1 g so il [ in th aus an ds ]
Lokalizacja stanowisk badawczych – Location study site:
1. Pole doświadczalne Kraków – Mydlniki – Experimental field at Cracow – Mydlniki 2. Cementownia w Krakowie–Pleszowie – Cement mill in Cracow – Pleszów 3. Rondo A. Matecznego – Mateczny`s roundabourt
4. Pole doświadczalne w Prusach – Experimental field at Prusy
5. Tyniecki Park Krajobrazowy– kontrola – Tyniec Landscape Park – control Dane stanowią średnią arytmetyczną z okresu doświadczalnego.
Data are the arithmetic mean from experimental period.
Rys. 1. Liczebności j.t.k. grzybów w badanych środowiskach glebowych Fig. 1. The number of c.f.u. fungi occurring in soil environments
Tabela 1 Table 1 Kształtowanie się składu gatunkowego grzybów mikroskopowych Micromycetes wyizolowanych
z badanych środowisk glebowych
Qualitative composition of microscopic fungi Micromycetes isolated from soil environments Punkty badawcze – Study sites Lp. Gatunki grzybów – Fungi species 1 2 3 4 5
1. Absidia glauca Hagem + + + + 2. Alternaria alternata (Fr.) Keissl. + + +
3. Alternaria geophila Daszewska + + + + + 4. Aspergillus flavus Link. + +
5. Aspergillus fumigatus Fresenius +
6. Aspergillus niger van Thieghem + + + + 7. Fusarium graminearum Schwabe + + +
8. Mucor hiemalis Wehmer + + + + + 9. Penicillium chermesinum Biourge + + +
10. Penicillium citreo-viride Biourge +
11. Penicillium digitatum Saccardo + + 12. Penicillium implicatum Biourge + + + + 13. Penicillium meleagrinum Biourge + + 14. Penicillium natatum Westling + + +
15. Penicillium rubum Stoll + + +
16. Rhizopus migricans Ehrenberg + + + + + 17. Rhodotorula graminis Di Menna + + + + + 18. Verticillium cellulasae Daszewska + + + +
Uzdolnienia do produkcji mikotoksyn ... 47 Tabela 2 Table 2 Gatunki grzybów potencjalnie toksynotwórcze stwierdzone w badanych środowiskach glebowych
Species composition of fungi potentially toxin-producing in study soil environments Punkty badawcze – Study sites Lp. Gatunki grzybów – Fungi species 1 2 3 4 5
1. Alternaria alternata (Fr.) Keissl. + + + 2. Aspergillus flavus Link. + +
3. Aspergillus fumigatus Fresenius + 4. Fusarium graminearum Schwabe + + +
5. Penicillium chermesinum Biourge + + +
6. Penicillium citreo-viride Biourge + 7. Penicillium digitatum Saccardo + + 8. Penicillium implicatum Biourge + + + + 9. Penicillium meleagrinum Biourge + +
10. Penicillium rubum Stoll + + +
W chwili obecnej największe niebezpieczeństwo zagrażające homeostazie środowi-ska glebowego i bioróżnorodności mikroorganizmów glebowych to zanieczyszczenia chemiczne. Niewłaściwe lub nadmierne stosowanie pestycydów oraz mineralnych na-wozów szczególnie azotowych, a także skażenie środowiska przez liczne związki che-miczne dostające się do gleby z emisji przemysłowych, powodują zmiany morfologicz-ne i biochemiczmorfologicz-ne grzybów saprofitycznych, zwiększając ich zdolność do syntezy mi-kotoksyn [Czachor, 1985; Marska, Głowacz, 1987]. Z badanych gleb wyizolowano 104 szczepy gatunków grzybów potencjalnie toksynotwórczych. Wszystkie przebadano w teście biologicznym. Tylko 60% z nich można uznać za toksyczne. Przebadane szczepy hamowały energię kiełkowania nasion rośliny testowej w granicach od 33 do 72%, a zdolność kiełkowania od 40 do 86% w stosunku do kontroli. Metabolity pozostałych szczepów nie wykazały właściwości toksycznych.
Najsilniejszym działaniem fitotoksycznym odznaczały się metabolity następujących szczepów: Alernaria alternata – szczep wyizolowany z Prus oznaczony symbolem P 5 (hamował on energię kiełkowania w 65%, a zdolność kiełkowania nasion w 73% w stosunku do kontroli), Aspergillus flavus – szczep oznaczony symbolem RM 6 wyizo-lowany z gleb ogródków działkowych znajdujących się przy Rondzie Matecznego (hamował energię kiełkowania nasion w 72%, a zdolność kiełkowania nasion w 81% w stosunku do kontroli), Penicillium rubrum – szczep oznaczony symbolem RM 7, wyizo-lowany z gleb ogródków działkowych znajdujących się przy Rondzie Matecznego (ha-mował energię kiełkowania nasion w 70%, a zdolność kiełkowania w 86% w stosunku do kontroli) oraz Fusarium gramineareum – szczep wyizolowany z gleby w Krakowie– Pleszowie z okolicy cementowni, oznaczony symbolem C 5 (hamował energię kiełko-wania nasion w 70%, a zdolność kiełkokiełko-wania w 83% w stosunku do kontroli).
Najsłabsze okazały się metabolity szczepów Penicillium implicatum (symbol TPK 13) i Penicillium rubrum (TPK 27) wyizolowane z Tynieckiego Parku Krajobrazowego. Hamowały one energię kiełkowania w 32% i 40%, a zdolność kiełkowania nasion w 40% i 47% w stosunku do kontroli.
Helena Bis 48
Metabolity pozostałych przebadanych szczepów grzybów potencjalnie toksynotwór-czych wyizolowanych z badanych gleb okazały się średniotoksyczne.
Produkowane przez badane szczepy grzybów mikotoksyny są substancjami odzna-czającymi się silną biologiczną aktywnością. Na uwagę zasługuje fakt, że w wielu przypadkach szczepy grzybów, które wykazały bardzo silną toksyczność, nie opóźniały, lecz całkowicie niszczyły żywotność nasion grochu. Powstające w środowisku glebo-wym mikotoksyny wykazują również działanie grzybobójcze, mogły więc stanowić dodatkową przyczynę regresji innych gatunków znajdujących się w glebie. Uzyskane wyniki świadczą o silnym toksycznym wpływie metabolitów grzybów toksynotwór-czych na nasiona rośliny testowej. Ich właściwości fitotoksyczne stanowią również poważny problem w żywieniu zwierząt gospodarczych. Rośliny porażone przez grzyby patogenne wchodzące w skład pasz gromadzą w swoich tkankach metabolity toksyczne dla zwierząt, [Chełkowski, 1985; Paul, Clark, 2000].
12 15 13 10 11 4 6 7 5 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 1 2 3 4 5
Obiekty badawcze Experimental objects
Ilo ść gat un kó w gr zy bów T he n um ber of s pec ie s of fungi Liczba gatunków grzybów mikroskopowych The number of species of microscopic fungi Liczba gatunków grzybów potencjalnie toksynotwórczych The number of species of potentially toxin-producing fungi
Objaśnienia jak na rys. 1 Explanation see Fig. 1
Rys. 2. Ilości gatunków grzybów Micromycetes i ilości gatunków potencjalnie toksynotwórczych wyizolowanych z badanych środowisk glebowych
Fig. 2. The number of species of fungi Micromycetes and the number of species of potentially toxin-producing fungi isolated from soil environments
WNIOSKI
1. W badanych środowiskach glebowych stwierdzono występowanie grzybów mi-kroskopowych Micromycetes o zróżnicowanej liczebności i składzie gatunkowym.
2. W badanych glebach stwierdzono 19 gatunków grzybów należących przede wszystkim do klasy Deuteromycetes, z których 10 należało do potencjalnie toksyno-twórczych gatunków: Alternaria alternata, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Fusarium gramineareum, Penicillium meleagrinum, Penicillium chermesinum, Penicil-lium implicatum, PenicilPenicil-lium rubrum, PenicilPenicil-lium citreo-vinide, PenicilPenicil-lium digitatum.
Uzdolnienia do produkcji mikotoksyn ... 49 3. Z przebadanych w teście biologicznym szczepów gatunków potencjalnie toksyno-twórczych 60% okazało się szczepami toksycznymi. Ich metabolity hamowały energię kiełkowania nasion zielonego grochu od 33 do 72%, a zdolność kiełkowania nasion od 40 do 86 % w stosunku do kontroli.
4. Najsilniejszym działaniem fitotoksycznym odznaczały się szczepy: Alternaria al-ternata (P5), Aspergillus flavus (RM6), Fusarium gramineareum (C5) i Penicillium rubrum (RM7).
5. Najsłabszym działaniem fitotoksycznym odznaczały się szczepy wyizolowane z gleb Tynieckiego Parku Krajobrazowego – Penicillium implicatum (TPK13) i Penicil-lium rubrum (TPK27) .
6. Na zróżnicowanie liczebności i składu gatunkowego grzybów mikroskopowych oraz liczbę szczepów grzybów toksynotwórczych wpłynęło przede wszystkim usytu-owanie punktów badawczych, narażonych na różny stopień emisji przemysłowych.
PIŚMIENNICTWO
Barabasz W. Vŏrisek K.: 2002. Bioróżnorodność mikroorganizmów w środowiskach glebowych. Aktywność drobnoustrojów w rożnych środowiskach, Katedra Mikrobiologii AR w Kra-kowie, 23–34.
Bis H.: 2002. Występowanie grzybów toksynotwórczych środowisku glebowym. Aktywność drobnoustrojów w różnych środowiskach, Katedra Mikrobiologii AR w Krakowie, 35–42.
Callen D. P.: 1982. Microbial Metabolism of Environmental Chemicals to Mutagen and Carcino-gen, Chemical Mutagens, 7, 163–188.
Chełkowski J: 1985. Mykotoksyny, wytwarzające je grzyby i mikotoksykozy, SGGW, Warszawa, 96 ss.
Czachor M.: 1985. Wpływ metabolitów wybranych grzybów toksynotwórczych na niektóre mi-kroorganizmy glebowe i rośliny uprawne. Acta Agr. et Silv., Ser. Agr., 24, 85–93. Gilman J.: 1947. A Manual of Soil Fungi, The Iowa State College, Pres, IOWA, USA, 450 ss. Kryński A., Rokicki E.,: 1983. Mikotoksyny i mikotoksykozy, Przegląd Hodowlany, Kraków, 2,
27–33.
Marska B., Głowacz J.: 1987. Występowanie grzybów toksynotwórczych w glebach uprawnych leżących w rejonie oddziaływania emisji przemysłowych z Zakładów Chemicznych „Po-lice”, Zesz. Nauk. AR Szczecin, 130, 93–101.
Mirczink T. G.,: 1957. O gribach obustwliwajuszczich toksicznost diernowo podzolistnoj poczwy rozlicznoj stiepieni okulturiennosti. Mikrobiołogia, 26, 78–86.
Muller E., Loeffler W.: 1987. Zarys mikologii, PWRiL, Warszawa, 432–445;
Paul E. A., Clark F.: 2000. Mikrobiologia I biochemia gleb, Wyd. UMCS, Lublin, 400 ss. Raper K. B., Thom C. H., Fennell D. J.: 1968. A Manual of the Penicillia. The Williams &
Wil-kins Comp., Baltimore, 875 ss.
Schlegel H.G.: 1996. Mikrobiologia ogólna, PWN, Warszawa, 737 ss. Tate R. L.: 2000. Soil Microbiology, John Wiley & Sons, Inc. N. Y., 235–244.
Helena Bis 50
ABILITY TO PRODUCE MYCOTOXINS BY FUNGI ISOLATED FROM SOILS IN CRACOW AND THE SURROUNDINGS
S u m m a r y
The paper presents the results of mycological studies upon the ability to produce mycotoxins by fungi isolated from soils in Cracow and the surroundings. Performed analyses revealed great differentiation of microscopic fungi (Micromycetes) population in studied soil environments. Their highest numberwas found in sampling site No 3 (mateczny`s roundabourt). Average number of fungi number for whole study period was 234.0 thousand c.f.u. of fungi per 1 gram of soil.
The least fungi (arithmetic mean for the whole study period was 60.5 thousand c.f.u. of fungi per 1 gram of soil) was found in soil taken from Tyniec Landscape Park. Values of arithmetic mean were within the range of 102.0 – 159.0 thousand c.f.u. of fungi per 1 gram of soil in other sampling sites.
Nineteen fungi species were isolated from studied soil environments. They are mainly from Deuteromycetes class. Ten of them were accepted as potentially toxin-forming. All isolated strains of potentially toxin-forming species were subjected to bioassay to find out which produced mycotoxins. Studies revealed that toxic strains comprised 60%: other appeared to be non-toxic. KEY WORDS: soil, fungi, mycotoxins