Badaniu poddano 101 szczepów bakterii metylotroficznych wyizolowanych z gleby rizosferowej i pozarizosferowej jęczmienia jarego, na polu doświadczalnym w Złotni-kach k. Poznania. Izolację szczepów wykonano na podłożu sporządzonym wg Urakami i Kamagata [1978] z dodatkiem metanolu jako jedynego źródła węgla. Spośród ogólnej liczby szczepów 51 szczepów wyodrębniono ze strefy rizosferowej jęczmienia jarego. Należały one do następujących grup morfologicznych: ziarniaki (3 szczepy), pałeczki (13 szczepów) pałeczki rozpadające się na ziarniaki (7 szczepów) i ziarniako-pałeczki (28 szczepów). Pozostałe 50 szczepów wyodrębniono z gleby pozarizosferowej. Były to szczepy należące do grupy morfologicznej ziarniaków (35 szczepów) i pałeczek (15 szczepów).
Określenie wpływu Cu oraz Zn na bakterie metylotroficzne przeprowadzono w wa-runkach laboratoryjnych na podłożu NB wg Ohty i Hattoriego [1980]. Badania prze-prowadzono metodą dyfuzji agarowej wg Ore i Grennberg [2003], rozprowadzając na powierzchni zestalonej pożywki agarowej po 0,1 ml zawiesiny określonego szczepu bakterii metylotroficznych. Po czym za pomocą mikropipety na powierzchnię 3 krąż-ków, rozmieszczonych na płytce nanoszono odpowiednie stężenie metalu ciężkiego (0,5 µg, 1,0 µg, 1,5 µg, 2,0 µg, 2,5 µg) w postaci siarczanu miedzi (CuSO4 · 5 H2O) oraz siarczanu cynku (ZnSO4·2 H2O), w ilości 0,02 ml. Przygotowane płytki inkubowa-no w termostacie w temperaturze 28 oC przez 24 godziny. Po upływie okresu inkubacji obserwowano zahamowanie wzrostubakterii metylotroficznych na pożywce agarowej
Wpływ miedzi i cynku na wzrost bakterii metylotroficznych ... 59
potraktowanej poszczególnymi stężeniami Cu oraz Zn, poprzez określenie średnicy stref zahamowania wzrostu w mm..
Wyniki przedstawiono w postaci średnich uzyskanych dla poszczególnych grup morfologicznych pochodzących ze strefy rizosferowej i pozarizosferowej jęczmienia. Następnie poddano je analizie wariancji za pomocą programu komputerowego Statisti-ca, a różnice między średnimi oceniano testem Tukeya.
WYNIKI I DYSKUSJA
Dane literaturowe wskazują na zróżnicowaną reakcję mikroorganizmów na metale ciężkie. Różna reakcja drobnoustrojów na metale ciężkie wynika z różnic gatunkowych, odmiennych układów enzymatycznych i z możliwości lub braku wykorzystania alter-natywnych dróg omijających zablokowany układ enzymatyczny [Insam, 1996; Nies 1999, Słaba i Długoński, 2002]. Toksyczny wpływ metali ciężkich na drobnoustroje polega najczęściej na zahamowaniu wzrostu lub spadku liczebności i biomasy drobno-ustrojów, a nasilenie tych procesów związane jest z wartościowością metali, ich formą, rozpuszczalnością, stężeniem oraz czynnikami środowiska [Maliszewska i wsp., 1985; Anyama i Nagumo, 1997, Wyszkowska i Zaborowska, 2002].
Przeprowadzone badania nad wpływem miedzi i cynku na wzrost bakterii metylotro-ficznych, wyodrębnionych z gleby rizosferowej i pozarizosferowej jęczmienia jarego wykazały, że wszystkie izolaty bakterii metylotroficznych niezależnie od ich pochodze-nia (strefa rizosferowa, strefa pozarizosferowa) czy przynależności do określonej grupy morfologicznej, w warunkach laboratoryjnych reagowały zahamowaniem wzrostu pro-porcjonalnie do stężenia metalu (tab. 1–3). Przeprowadzona analiza wariancji na po-ziomie ufności P=0,05 wykazała istotny wpływ stężenia miedzi i cynku na wzrost bak-terii metylotroficznych, wyodrębnionych z gleby rizosferowej i pozarizosferowej jęcz-mienia jarego. Strefa zahamowania wzrostu bakterii metylotroficznych pod wpływem Cu i Zn wynosiła odpowiednio 16,1 i 16,8 mm przy najmniejszym stężeniu metalu 0,5 µg·krążek-1, a 34,3 i 30 mm przy stężeniu – 2,5 µg · krążek-1. Zarówno Cu, jak i Zn hamowały wzrost badanych szczepów w podobnym zakresie.
Wpływ Cu i Zn na metylotrofy wyodrębnione z gleby rizosferowej jęczmienia Toksyczność metali ciężkich dla bakterii metylotroficznych należących do różnych grup morfologicznych, wyodrębnionych ze strefy rizosferowej jęczmienia (tab.1) rosła wraz z wzrostem stężenia metali. Zaobserwowano jednak, że wzrost zahamowania rozwoju bakterii metylotroficznych należących do poszczególnych grup morfologicz-nych przebiegał w przypadku Cu w sposób bardziej wyrównany niż w przypadku Zn. Cynk wraz z wzrostem stężenia silniej oddziaływał na ziarniaki i pałeczki, a nieco sła-biej na pałeczki rozpadające się na ziarniaki i ziarniako-pałeczki. Największa zastoso-wana dawka Cu (2,5 µg·krążek-1) w porównaniu z najniższym ze stężeń (0,5 µg krążek-1) hamowała najmniej bo o 47% wzrost bakterii należących do grupy morfologicznej ziar-niaków, a następnie już o 56% wzrost pałeczek, o 63% wzrost ziarniako-pałeczek, a najwięcej bo aż o 66% wzrost bakterii należących do grupy morfologicznej – pałeczki rozpadające się na ziarniaki. Analogicznie cynk. hamował wzrost ziarniako-pałeczek o
Grażyna Durska 60
38%, pałeczek rozpadających się na ziarniaki o 45%, pałeczek o 46% i ziarniaków o 56%. Jednocześnie przy najwyższej z zastosowanych dawek różnice w reakcji poszcze-gólnych szczepów na metal były najmniejsze w przypadku Cu (2%) dla ziarniako-pałeczek, a w przypadku cynku (3,5%) dla ziarniaków. Dla pozostałych grup morfolo-gicznych były one już znacznie wyższe i dla miedzi dochodziły aż do 29%, a dla cynku do 17%.
Tabela 1 Table 1 Wpływ Cu i Zn na wzrost bakterii metylotroficznych
wyodrębnionych ze strefy rizosferowej jęczmienia Effect of Cu and Zn on the growth of methylotrophic bacteria
selected from the rhizospheric zone of barley
µg Cu·krążek-1 µg Zn·krążek-1
Grupa morfolo-giczna
bakterii 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Ziarniaki 19,9a* 22,6a* 26,3a* 27,8a* 29,2a* 18,7a* 21,7a* 26,0a* 27,5a* 29,2a*
Pałeczki 17,9a 22,3a 25,1a 26,5a 28,0a 19,7a 22,6a 25,6a 27,2a 28,7a Pałeczki
rozpadające się na ziarniaki
18,0a 22,8a 25,4a 28,0a 29,9a 19,2a 21,6a 24,2a 26,0b 27,8a
Ziarniako--pałeczki 18,1b 22,8a 27,0a 28,3a 29,5a 20,3a 22,4a 25,0a 26,6b 28,0a * Średnie oznaczone tymi samymi literami nie różnią się istotnie na poziomie prawdopodobieństwa P=0,05 * Means marked with the same letters did not differ significantly at the probability of P=0,05
Wpływ Cu i Zn na metylotrofy wyodrębnione z gleby pozarizosferowej jęczmienia Metylotrofy strefy pozarizosferowej jęczmienia, chociaż stanowiły tak samo liczną grupę szczepów, to były mniej zróżnicowane i obejmowały tylko dwie grupy morfolo-giczne, ziarniaki i pałeczki. Toksyczny wpływ rosnącego stężenia miedzi i cynku na te grupy morfologiczne bakterii był bardziej wyrównany niż w przypadku szczepów wy-odrębnionych ze strefy rizosferowej jęczmienia (tab. 2). Toksyczność miedzi dla ziar-niaków przy najwyższej dawce metalu wzrosła o 62%, a toksyczność cynku o 50%. Różnice w reakcji poszczególnych szczepów na najwyższą dawkę metalu w przypadku miedzi były większe (osiągały 36%) niż w przypadku cynku (18%). Natomiast zaha-mowanie wzrostu pałeczek pod wpływem miedzi doszło do 54%, a pod wpływem cyn-ku do 47%. Różnice pomiędzy szczepami w reakcji na najwyższą dawkę metalu osią-gały w przypadku miedzi 13,5%, a w przypadku cynku 20%.
Wyniki analizy statystycznej wykazały w większości przypadków brak istotnych różnic w reakcji na zastosowane w badaniach stężenia Cu i Zn pomiędzy poszczegól-nymi grupami morfologiczposzczegól-nymi metylotrofów strefy rizosferowej jak i pozarizosfero-wej (tab.1 i 2).
Przeprowadzone badania wykazały większą toksyczność miedzi jak i cynku wzglę-dem bakterii strefy rizosferowej niż bakterii strefy pozarizosferyowej jęczmienia (tab. 3). Różnice te zaznaczały się niezależnie od dawki tych metali i malały wraz z wzrostem stężenia metalu. Tłumaczyć to należy większą odpornością na niesprzyjające
Wpływ miedzi i cynku na wzrost bakterii metylotroficznych ... 61
czynniki środowiska bakterii występujących poza strefą korzeniową rośliny. Wpływ poszczególnych stężeń Cu i Zn na wzrost bakterii metylotroficznych wyodrębnionych ze strefy rizosferowej i pozarizosferowej był istotny.
Tabela 2 Table 2 Wpływ Cu i Zn na wzrost bakterii metylotroficznych
wyodrębnionych ze strefy pozarizosferowej jęczmienia Effect of Cu and Zn on the growth of methylotrophic bacteria
selected from the non-rhizospheric zone of barley
µg Cu·krążek-1 µg Zn·krążek-1
Grupa morfologiczna
bakterii 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Ziarniaki 17,4a* 20,5a* 24,0a* 26,3a* 28,1a* 18,4a* 21,2a* 23,2a* 25,5a* 27,5a*
Pałeczki 18,1b 21,1a 23,1a 26,0a 27,9a 18,6a 21,1a 23,5a 25,4a 27,3a * Średnie oznaczone tymi samymi literami nie różnią się istotnie na poziomie prawdopodobieństwa P=0,05 * Means marked with the same letters did not differ significantly at the probability of P=0,05
Tabela 3 Table 3 Wpływ Cu i Zn na wzrost bakterii metylotroficznych wyodrębnionych ze strefy rizosferowej
i pozarizosferowej jęczmienia
Effect of Cu and Zn on the growth of methylotrophic bacteria selected from the rhizospheric and non-rhizospheric zone of barley
µg Cu·krążek-1 µg Zn·krążek-1
Bakterie
metylotro-ficzne 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Strefy
rizos-ferowej 18,5a* 22,4a* 25,6a* 27,6a* 29,2a* 19,5a* 22,8a* 25,5a* 27,2a* 28,4a* Strefy
poza-rizosferowej 17,7a 21,3b 23,5b 26,2b 28,0b 18,5b 21,2b 23,4b 25,5b 27,4b * Średnie oznaczone tymi samymi literami nie różnią się istotnie na poziomie prawdopodobieństwa P=0,05 * Means marked with the same letters did not differ significantly at the probability of P=0,05
Podsumowując należy stwierdzić, że metale ciężkie zastosowane w doświadczeniu wykazały niekorzystne oddziaływanie na wszystkie szczepy bakterii metylotroficznych wyodrębnione z gleby rizosferowej i pozarizosferowej jęczmienia. Natomiast stopień zahamowania wzrostu bakterii uwarunkowany był dawką metalu i jego rodzajem. Uzy-skane wyniki potwierdzają obserwacje innych autorów wskazujących na nieco słabszą toksyczność miedzi niż cynku przy niższych stężeniach tych pierwiastków w środowi-sku i na wzrost toksyczności miedzi i cynku wraz ze wzrostem ich stężenia [Wyszkow-ska i Zaborow[Wyszkow-ska, 2002; Nowak i wsp., 2004; Wael i wsp., 2000].
Grażyna Durska 62
WNIOSKI
1. Niezależnie od zastosowanego metalu – miedzi lub cynku – bakterie metylotro-ficzne wykazały zahamowanie wzrostu już przy najniższej wartości stężenia, tj. 0,5 µg metalu · krążek-1.
2. Zwiększone dawki miedzi i cynku powodowały wzrost ich toksyczności wzglę-dem bakterii metylotroficznych.
3. Bakterie metylotroficzne wyodrębnione ze strefy rizosferowej jęczmienia jarego wykazywały nieco większą wrażliwość na metale ciężkie niż bakterie strefy pozarizos-ferowej.
PIŚMIENNICTWO
Aoyama M., Nagumo T.: 1997. Comparison of the effect Cu, Pb and As on plant residue decom-position, microbial biomass and soil respiration. Soil Sci. Plant Nut. 43, 613–622. Baath E.: 1989. Effects of heavy metals in soil on microbial process and populations. Water, Air,
Soil Pollut. 47, 335–79.
Bratina B., Hanson R.S.: 1992. Methylotrophy. [W:] Encyclopedia of microbiology. Ed. J. Lederberg- Academic Press Inc. New York. 3, 121–27
Doelman P.: 1985. Resistance of soil microbial communities to heavy metals. W: Micronutrients in soil. Ed. Jensen A. K., Sorensen L.H. Elsevier Applied Science Publishers. London. 364–84.
Fritze H., Niani S., Mikkola K. 1989. Soil microbial effects of Cu-Zn smelter in southwestern Finland. Soil. Biol. Fertilis. 8, 87–4.
Hattori H.: 1992. Influence of heavy metals on microbial activities. Soil Sci. Plant Nutr.: 38, 93–00.
Insam H., Hutchinson T.C., Reber H.H.: 1996. Effects of heavy metal stress on the metabolic quotient of the soil microflora. Soil Biol. Biochem. 28, 691–94.
Kaszubiak H., Durska G.: 2000. Effect of Oxafun T seed dressing on bacteria in rhizosphere and non-rhizosphere soil. Pol. J. Environ. Stud. 9. (5), 397–01.
Leita L., De Nobili M., Muhlbachova G.: 1995. Bioavailability and effects of heavy metals on soil microbial biomass survival during laboratory incubation. Biol. Fertil. Soils. 19, 103–108. Maliszewska W., Dec Wierzbicka H., Woźniakowska A.: 1985. The influence of various heavy
metals compounds on the development and activity of soil microorganisms. Environ. Pollut. Seria A. 37, 195–215.
Nies D.H.: 1999. Microbial heavy-metal resistance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51,(6),730–750. Niklińska M., Chmiel M.: 1997. Porównanie oporności na metale ciężkie u mikroorganizmów
glebowych z rejonów silnie zanieczyszczonych miedzią lub cynkiem. [W:] Drobnoustroje w środowisku. Występowanie, aktywność i znaczenie. Red. Barabasz W. AR Kraków, 491–504.
Nowak A., Szopa E., Błaszak M.: 2004. Wpływ metali ciężkich (Cd, Cu, Pb, Hg) na ilość bioma-sy żywych mikroorganizmów w glebie. Acta Agraria et Silvestria. XLII, 335–339. Ohta H., Hattori T.: 1980. Bacteria sensitive to nutrient broth medium in terrestrial environments.
Soil Sci. Plant Nutr. 26, 97–101.
Ore S., Grennberg K.: 2003. The effect of metal pollutants leaching from the road constructed with bottom ash. 7th International Conference „The Biogeochemistry of Trace Elements”. Uppsala, Sweden, June 15–19.
Wpływ miedzi i cynku na wzrost bakterii metylotroficznych ... 63 Przybulewska K., Nowak A., Smolińska M.; 2002. Wpływ metali ciężkich na liczebność i aktyw-ność mikroorganizmów celulolitycznych w glebie. [W:] Rola drobnoustrojów w kształto-waniu środowiska. Red. Wyszkowska J., Jastrzębska E. UWM Olsztyn,
Słaba M., Długoński J.: 2002. Mikrobiologiczne usuwanie i odzyskiwanie metali ciężkich. Post. Mikrobiol. 41, (2), 167–183.
Urakami T., Kamagata K.: 1978. Cellular fatty amid composition an enzyme Q system In gram negative methane – utilizing bacteria. J. Gen. Apel. Microbiol. 25, 343–360.
Wael M., Huang Ch., Xie Z.: 2000. Comparison of the effects of copper and lead on soil micro-bial biomass carbon and nitrogen in red soil. J. Zhejiang University Sci. 1, (2), 196–201. White C., Saper J.A., Gadd.: 1997. Microbial solubilization and immobilization of toxic metals:
key biogeochemical process for treatment of contamination. FEMS Microbiol. Rev. 20, 503–516.
Wyszkowska J., Zaborowska M.: 2002. Aktywność enzymów w glebie zanieczyszczonej cyn-kiem. [W:] Rola drobnoustrojów w kształtowaniu środowiska. Red. Wyszkowska J., Jastrzębska E., UWM Olsztyn, s.125.
EFFECT OF COPPER AND ZINC ON THE GROWTH OF METHYLOTRO-PHIC BACTERIA SELECTED FROM THE RHIZOSPHERIC
AND NON-RHIZOSPHERIC SOIL OF BARLEY S u m m a r y
The methylotrophic bacteria play an important role in the global carbon cykle. These are mi-croorganisms present everywhere in nature. Thy occur in soil, water and in plant material. A characteristic distinguishing the group among others is the ability to utilize C1 compound such as methane, methanol, methylamines and others. The aim of the study was to estimate the effect of copper and zinc in different concentrations (0.5 µg; 1.0 µg; 1.5 µg; 2.0 µg; 2.5 µg filter paper-1) on the growth of the methylotrophic bacteria selected from the rhizosphere and non-rhizosphere zone of barley. The results indicated that already lowest dose of metal - 0,5µg filter٠ paper-1 had a deleterious effect on the growth of the methylotrophic bacteria. The growth of the methylotrophic bacteria was decreased consistently with increasing level Cu and Zn. However the heavy metals strongly decreased growth methylotrophic bacteria selected from rhizospheric soil than non-rhizospheric soil.
KEY WORDS: heavy metal, copper, zinc, methylotrophic bacteria, rhizosphere