Stoffweehselprodukte des M ikroorganism us Phyeom yees B lakes- leeanus in glu co seh a ltig er Nährlösung und Untersuchungen über das

W achstum dieses Schim m elpilzes bei verschiedenen Stiekstoffquellen3)

von K arl B ern h ard und Hans A lb reeh t.

(11. II. 47.)

N a c h U n t e r s u c h u n g e n v o n Schöpfer4) g e h ö r t d e r S c h im m e lp i lz P h y e o m y e e s B l a k e s l e e a n u s z u d e n a u x o - h e t e r o t r o p h e n O r g a ­ n is m e n : e r b e n ö t i g t a ls w i c h t i g s t e n W u c h s s t o f f d a s A n e u r i n o d e r a n d e s s e n S t e l l e ä q u i m o l e k u l a r e M e n g e n T h i a z o l u n d P y r i m i d i n .

W i r z ü c h t e t e n d ie s e n M i k r o o r g a n i s m u s i n e in e r N ä h r l ö s u n g , e n t h a l t e n d 50 g G lu c o s e , 2 g Z - A s p a r a g in , 1 g H e f e e x t r a k t , 0 ,5 g M g S 04- 7 H20 , 1 , 5 g K H2P O ,i u n d 50 y A n e u r i n p r o 1 L i t e r W a s s e r , u n d v e r s u c h t e n , in d e r K u l t u r f l ü s s i g k e i t a u f t r e t e n d e S t o f f w e c h s e l ­ p r o d u k t e n a c h z u w e i s e n .

U

H. Waldmann,

-)

C. Wermann

E.

F. Bergmann,

3) Teilweise vorgetragen an der 27. Tagung des Schweiz. Vereins der Physiologen und Pharmakologen am 30. Juni 1945 in Bern.

*)

H. Schöpfer,

628 H E L V E T IC A C H IM IC A ACTA.

N a c h b e e n d i g t e m W a c h s t u m t r e n n t e n w i r d ie P i l z e v o n d e r N ä h r l ö s u n g . L e t z t e r e w a r g e l b b is b r a u n - g e l b , w u r d e m i t E i s e n ( I I I ) - c h l o r i d b l a u - v i o l e t t u n d s c h li e s s li c h s c h w a r z . B e i m S c h ü t t e l n m i t v e r d ü n n t e r L a u g e f ä r b t e s ie s ic h r o t b r a u n . W i r h a b e n e in e n T e i l n a c h A n s ä u e r n a u s g e ä t h e r t . D i e e i n g e e n g t e n E x t r a k t e e r g a b e n e in e n d u n k e l b r a u n e n R ü c k s t a n d . D u r c h B e h a n d l u n g m i t H y d r o g e n c a r b o ­ n a t l ö s u n g d a r a u s a b g e t r e n n t e s a u r e A n t e i l e w u r d e n i n ä t h e r i s c h e r L ö s u n g m i t D i a z o m e t h a n v e r s e t z t . E s b i l d e t e s ic h e in e z ä h f l ü s s i g e , s c h w a c h g e l b l i c h e V e r b i n d u n g , w e l c h e w i r v o r s i c h t i g m i t K a l i l a u g e e r w ä r m t e n . D a s V e r s e i f u n g s p r o d u k t r e i n i g t e n w i r d u r c h S u b l i m a t i o n u n d m e h r m a li g e s U m k r y s t a l l i s i e r e n a u s a b s o lu t e m A l k o h o l . E s s c h m o lz b e i 2 4 7 ° u n d e r w ie s s i c h i d e n t i s c h m i t 3 - O x y - 4 - m e t h o x y - b e n z o e s ä u r e . D i e I s o l i e r u n g r e i n e r P r o t o c a t e c l i u s ä u r e o d e r 3 , 4 - D i o x y - b e n z o e s ä u r e g e l a n g n u r i n s e h r k le i n e n M e n g e n .

F e r n e r f ä l l t e n w i r z u r P h y c o m y c e s - Z ü c h t u n g b e n ü t z t e N ä h r ­ l ö s u n g m i t B l e i a c e t a t u n d e r h i e l t e n n a c h A u s ä t h e r n d e s m i t S ä u r e z e r s e t z t e n N i e d e r s c h la g e s e in e n b r a u n e n R ü c k s t a n d , d e n w i r in w ä s s r i g e r L ö s u n g m i t T i e r k o h l e b e h a n d e l t e n . E s e r g a b e n s i c h b r a u n e K r y s t a l l e , d ie a u s A l k o h o l , d a n n a u s a b s o lu t e m M e t h a n o l u n d C h l o r o ­ f o r m u m k r y s t a l l i s i e r t , r e i n e G a l l u s s ä u r e d a r s t e l lt e n . E i n e n T e i l f ü h r t e n w i r z u r I d e n t i f i z i e r u n g i n 3 , 4 , 5 - T r i m e t h o x y - b e n z o e s ä u r e u n d e in e k l e i n e M e n g e i n d e n p - P h e n y l - p h e n a c y l e s t e r d e r 3 , 4 , 5 - T r i o x y - b e n z o e s ä u r e ü b e r .

K e t o s ä u r e n k o n n t e n m i t 2 , 4 - D i n i t r o - p h e n y l h y d r a z i n a u s d e r N ä h r l ö s u n g n i c h t i s o l i e r t w e r d e n . E b e n s o w e n i g lie s s s i c h C it r o n e n - s ä u r e n a c h d e r M e t h o d e v o n Stahre1) n a c h w e i s e n .

P r o t o c a t e c l i u s ä u r e u n d G a ll u s s ä u r e s in d s o m i t G l u c o s e - S t o f f ­ w e c h s e lp r o d u k t e d e s S c h im m e lp i lz e s P h y c o m y c e s B l a k e s l e e a n u s . W e i t e r e O x y b e n z o e s ä u r e n j d ie G e n t i s i n s ä u r e u n d d i e 2 - 0 x y - 6 - m e t h y l - b e n z o e s ä u r e , h a b e n B a i s tr i c k u n d S im o n a r t2) a u s d e r Gzapek-D ox- N ä h r l ö s u n g n a c h Z ü c h t u n g v o n P e n i c i l l i u m g r i s e o - f u l v u m D i e r c k x i s o l i e r t .

E s s c h i e n u n s i n t e r e s s a n t , d a s P i l z w a c h s t u m in s e in e r A b h ä n g i g ­ k e i t v o n v e r s c h i e d e n e n S t i c k s t o f f q u e l l e n z u v e r f o l g e n . V o n S ch öpfer3) l i e g e n B e f u n d e ü b e r d ie A u s n ü t z u n g v o n P e p t o n , H a r n s t o f f , A m m o ­ n i a k , A m m o n i u m s u l f a t , G l y k o k o l l , A l a n i n u n d V a l i n a ls N - D o n a t o r e n v o r . U r a e i l , A l l o x a n u n d A l l o x a n t h i n w e r d e n a ls u n g e e i g n e t , P u r i n e a ls t e i l w e i s e s e h r g u t g e e i g n e t b e z e i c h n e t 4). L e o n ia n u n d L i l l y 5) b e o b a c h t e t e n u n t e r V e r w e n d u n g v o n A r g i n i n s c h le c h t e s , v o n

cl,l-ł )

Stahre,

H. Meyer,

gen, Berlin 1933, Eussnote S. 162.

2)

II. Raistrick

P. Simonart,

W. K. Anslow

H.

Raistrick.

3)

W. H. Schöpfer,

J) IE.

H. Schöpfer,

5)

L. H. Leonian

V. G. Lilly,

Volumen x x x , Fasciculus n (1947). 629

630 H E L V E T IC A C H IM IC A ACTA.

s ä u r e n d a s Z - A s p a r a g in z u e r s e t z e n v e r m ö g e n , u n d h a b e n d a h e r a n s e in e r S t e l l e j e 2 g e in e r i n d e r T a b e l l e g e n a n n t e n V e r b i n d u n g e n d e r e i n g a n g s e r w ä h n t e n N ä h r l ö s u n g z u g e f ü g t . V o n d ie s e n v e r s c h i e d e n e n N ä h r l ö s u n g e n i m p f t e n w i r j e 1 0 P r o b e n n a c h v o r a n g e g a n g e n e r S t e r i l i s a t i o n m i t f r is c h e n S p o r e n . D a s W a c h s t u m d e r 1 9 0 K u l t u r e n d e r e r s t e n V e r s u c h s r e i h e e r f o l g t e w ä h r e n d 6 T a g e n b e i 1 9 — 2 1 ° u n d a n s c h li e s s e n d w ä h r e n d 5 T a g e n b e i 1 1 — 1 6 ° . F ü r d ie 2 2 0 K u l t u r e n d e s z w e i t e n V e r s u c h e s b e t r u g d ie K a u m t e m p e r a t u r 1 0 T a g e e i n h e i t l i c h 2 0 °. D i e p H- W e r t e h i e l t e n s ic h i m Z e i t p u n k t d e r I m p f u n g i n d e n G r e n z e n v o n 1 , 8 — 5 , 1 ; n a c h b e e n d e t e m P i l z w a c h s t u m w a r e n a lle N ä h r l ö s u n g e n s t ä r k e r s a u e r ( v g l . T a b e ll e ) .

D i e e r h a lt e n e n P i l z e w u r d e n a u f d e r N u t s c h e a b g e s a u g t , m i t w e n i g W a s s e r g e w a s c h e n u n d i m E x s i k k a t o r b z w . im T r o c k e n s c h r a n k z u r G e w i c h t s k o n s t a n z g e b r a c h t . S ie w o g e n b e i d e n K o n t r o l l v e r s u c h e n m i t Z - A s p a r a g in d u r c h s c h n i t t l i c h 1 9 2 b z w . .19 1 m g . D i e s e W e r t e b e ­ n ü t z t e n w i r a ls V e r g l e i c h s b a s i s f ü r d a s P h y c o m y c e s - W a c h s t u m i n d e n ü b r i g e n N ä h r l ö s u n g e n . L e t z t e r e s i s t b e i V e r w e n d u n g v o n fZ ,Z -A sp ara- g i n o d e r d e s A m m o n i u m s a lz e s d e r A s p a r a g i n s ä u r e n u r w e n i g g e r in g e r . V o n w e i t e r e n A m i n o s ä u r e n z e i g e n tZ -A la n in u n d G l u t a m i n s ä u r e a ls A m m o n i u m s a lz g ü n s t i g e , < Z ,Z -P h e n y la la n in u n d (Z ,Z -L eu cin u n g ü n s t i g e W i r k u n g . B e i d e n A m m o n i u m s a lz e n d e r D i c a r b o n s ä u r e n e r z i e l t e n w i r m i t d e r B e r n s t e i n s ä u r e d ie b e s t e n E r f o l g e , d a n n f o l g e n G l u t a r - , A d i p i n - u n d M a lo n s ä u r e , w ä h r e n d C i t r a c o n - u n d O x a l s ä u r e u n g e e i g n e t s in d . O x y - d i c a r b o n s ä u r e n w i e W e i n s ä u r e u n d Ä p f e l s ä u r e v e r h a l t e n s ic h e t w a w i e d ie B e r n s t e i n s ä u r e , d e s g le ic h e n v o n d e n u n g e s ä t t i g t e n D i c a r b o n s ä u r e n d ie F u m a r s ä u r e , n i c h t a b e r d a s A m m o n i u m s a lz d e r M a l e i n s ä u r e . V o n d e n T r i c a r b o n s ä u r e n e r m ö g li c h t d ie C i t r o n e n s ä u r e e t w a s b e s s e r e s W a c h s t u m a ls d ie t r a n s - A c o n i t s ä u r e . D i e A m m o n i u m ­ s a l z e d e r E s s i g - u n d M i l c h s ä u r e v e r h a l t e n s ic h u n t e r e i n a n d e r e t w a g l e i c h , e b e n s o d i e j e n i g e n d e r P r o p i o n - u n d B r e n z t r a u b e n s ä u r e . N u r s c h l e c h t e s W a c h s t u m e r z i e l t e n w i r m i t A m m o n i u m c a r b o n a t u n d A m m o n i u m s u l f a t a ls S t i c k s t o f f q u e l l e n .

E x p e r i m e n t e l l e s .

Eine grössere Menge Nährlösung (70 1) wurde nach beendetem Pilzwachstum im Vakuum auf 3,5 1 eingeengt, mit Salzsäure angesäuert und erschöpfend mit Äther extra­

hiert. Letzterer hinterliess 9,64 g dunkelbraune, feste Masse. Zur Abtrennung saurer Anteile behandelten wir diesen wieder in Äther aufgenommenen Rückstand mit einer wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und schüttelten nach erfolgtem An­

säuern diese Auszüge mit Äther aus. Ein kleiner Teil dieses Extraktes wurde vom Lösungs­

mittel befreit und in Wasser aufgenommen. Nach Zugabe von Eisen(III)-chlorid trat grün-blaue, mit Soda blaue, dann violette und schliesslich rote Eärbung ein in Überein­

stimmung nüt dem Verhalten aus Chinasäure synthetisierter Protocatechusäure. Die Hauptmenge der ätherischen Lösung haben wir mit Natriumsulfat gut getrocknet und mit einer ätherischen Lösung von Diazomethan versetzt. Nach 20-stündigem Aufenthalt im Eisschrank und 4-stündigem Stehen bei 20° dampften wir das überschüssige Diazo­

methan ab. Das Methylderivat, welches mit Eisen(III)-chlorid keine charakteristische

Für-Volumen x x x , Fasciculus n (1947). 631 billig ergab, erwies sich als in Wasser unlöslich und gegen Luftsauerstoff beständig. Es liess sich im Vakuum (0,01 mm Hg) bei 100—120° destillieren, ohne fest zu werden. Nach Behandlung mit 3-proz. methanolischer Kalilauge zur Verseifung eventuell vorhandenen Methylesters wurde ein festes Produkt erhalten, das im Hochvakuum bei 100—130°

sublimierte, in Wasser löslich war und keine Eisen(III)-clilorid-Keaktion gab. Nach wieder­

holtem Umkrystallisieren aus absolutem Äther lag der Schmelzpunkt bei 246—247°.

3,763 mg Subst. gaben 7,80 mg C02 und 1,64 mg H20 C8Hs04 Ber. C 57,12 H 4,80% Äquiv.-Gew. 168,1

Gef. „ 57,19 „ 4,87% „ „ 167,4

Wir haben zum Vergleich aus Chinasäure hergestellte Protocatechusäure in analoger Weise mit Diazomethan methyliert. Die erhaltene 3-Oxy-4-methoxy-benzoesäure schmolz bei 245—247°.

4,274 mg Subst. gaben 8,97 mg C02 und 1,86 mg H20 Gef. C 57,25 H 4,86%

Im Mischschmelzpunkt trat mit der aus der Nährlösung erhaltenen Verbindung keine Erniedrigung ein. Das aufgearbeitete Kulturfiltrat mochte etwa 2 g Protocatechu­

säure enthalten.

Nach Zugabe von 75 cm3 konz. Bleiacetatlösung zu 16,5 1 von den Pilzen befreiter Nährlösung erhielten wir eine Fällung, die abfiltriert, in Wasser suspendiert mit Salz­

säure zersetzt wurde. Die saure Lösung haben wir zusammen mit dem ausgefallenen Blei­

chlorid in einem Extraktionsapparat während 30 Stunden mit Äther ausgezogen und nach Eindampfen des Lösungsmittels 2,67 g braunen, festen Rückstand bekommen.

Wir haben ihn in wässriger Lösung mit Tierkohle erwärmt und erzielten damit eine geringe Reinigung. Es ergaben sich braune Krystallo, die in Äthanol nochmals mit Kohle gereinigt und dann zweimal aus absolutem Methanol und Chloroform umkrystallisiert wurden. Vor der Analyse haben wir die Verbindung 5 Stunden in der Wasserpistole über Phosphorpentoxyd getrocknet. Feine Nüdelchen, Fliesspunkt 235—240° unter Zer­

setzung, im Mischschmelzpunkt mit Gallussäure keine Erniedrigung.

3,824 mg Subst. gaben 6,95 mg C02 und 1,27 mg H ,0 C;H0O. Ber. C 49,40 H 3,56%

Gef. „ 49,56 „ 3,71%

Ausbeute an Gallussäure ca. 2 g.

Methylderivat: 1,8 g Rohprodukt wurden in 16,4 cm3 10-proz. Natronlauge gelöst, mit 5,9 g Dimethylsulfat versetzt und auf dem Wasserbad im Stickstoffstrom 3 Stunden erhitzt. Zur Zersetzung überschüssigen Dimethylsulfates fügten wir nochmals Natron­

lauge zu und erwärmten während einer weiteren Stunde. Nach Abkühlen schüttelten vir die alkalische Lösung mit Äther aus, säuerten mit Schwefelsäure an und extrahierten erneut mit Äther. Diese ätherische Lösung wurde mit verdünnter Säure und dann mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Den erhaltenen braunen Rückstand krystallisierten wir aus Wasser um und sublimierten die braunen Krystalle bei 130—138° und 12 mm Hg. Schmelzpunkt des Sublimates (farblose, grosse Nadeln) 145—148°, nach Umkrystallisieren aus Wasser 160—163°, aus Äther 167—168°.

Vor der Analyse wurde die Verbindung aus Chloroform-Petroläther umkrystallisiert:

4,061 mg Subst. gaben 8,42 mg C02 und 2,02 mg H20 4,511 mg Subst. gaben 14,38 mg AgJ

8,94 mg Subst. in 7 cm3 heiss neutralisiertem Wasser gelöst und bei Siedehitze titriert, verbrauchten 0,426 cm³ 0,01-n. NaOH.

C10H12O5 Ber. C 56,57 H 5,70 OCH, 43,8% Äquiv.-Gew. 212,1 Gef. „ 56,54 „ 5,56 „ 42,1% „ „ 209,9 Schmelzpunkt der 3,4,5-Trimethoxy-benzoesäure: 169—170° *).

1) B e ilste in , Ergbd. 10, 240.

632 H E L V E T IC A C H IM IC A ACTA.

p-Plienyl-plienacylester der Gallussäure.

64 mg der erhaltenen Säure wurden mit 3,5 cm3 0,1-n. Natronlauge neutralisiert, eingedampft und im Vakuum bei 100° getrocknet. Wir fügten eine Lösung von 120 mg p-Phenyl-phenacylbromid in 15 cm³ 90-proz. Alkohol (das Natriumgallat ist in absolutem Alkohol unlöslich) hinzu und erwärmten 2 Stunden am Rückflusskühler. Das Reaktions­

gemisch wurde mit Tierkohle kurz aufgekocht und heiss filtriert. Zum Filtrat gaben wir bis zu leichter Trübung Wasser und liessen es im Eisschrank einige Stunden stehen.

Zuerst erhielten wir eine amorphe Fällung; nach weiterer Wasserzugabe und längerem Aufenthalt im Eisschrank bildete sich ein krystallischer Niederschlag. Er konnte von der amorphen Fällung getrennt werden. Schmelzpunkt 191—193°, unter Zersetzung. Aus 85-proz. Alkohol umkrystallisiert, schmolzen die Krystalle bei 192—194° (korr. 196—198°).

Drake

Sweeney1)

Der der Nährlösung zugefügte Hefetrockenextrakt enthielt pro 1 g rund 700 mg Wasserlösliches. Zugabe von Eisen(III)-chlorid oder Lauge zur gelben Lösung bewirkte keine Farbänderung, ebensowenig das Aufkochen mit 20-proz. Salzsäure und anschliessende Versetzen mit Lauge. Damit dürfte eine Herkunft der aufgefundenen Oxybenzoesäuren aus dem verwendeten Hefeextrakt auszuschliessen sein.

W ach stu m sversu ch e: Die Phycomyces-Reinkulturen wurden uns in liebens­

würdiger Weise vom Direktor des Botan. Gartens Bern, Herrn Prof. Dr.

W. H. Scliopjer,

Erlenmeyer-Kolbcn,

Der

Stiftung für wissenschaftliche Forschung

Z ü r i c h , P h y s i o l .- c h e m i s c h e s I n s t i t u t d e r U n i v e r s i t ä t .

81. Versuche zur Herstellung’ von 3 , 4 D iacetylJch in ovosan -a< l,2>ji< l,5>

von E. H ard e gg er und R. M. M ontavon.

(11. II. 47.)

V o r 2 5 J a h r e n b e s c h r i e b P e r c y B r i g l2) e i n a u s v e r s c h i e d e n e n G r ü n d e n i n t e r e s s a n t e s A n h y d r i d d e r d - G l u c o s e , d a s 3 , 4 , 6 - T r i a c e t y l - d - g l u c o s a n a < l,2 > /3 < 1,5 > ( V i l l a ) . D i e s e s s o g e n a n n t e „ U n i / Z - A n h y ­ d r i d “ ( V i l l a ) i s t e in e s d e r w e n i g e n Z u c k e r - a n h y d r i d e 3) m i t e in e m Ä t h y l e n o x y d - r i n g . B e m e r k e n s w e r t i s t d ie a u s s e r g e w ö h n li c h e L e i c h ­ t i g k e i t , m i t d e r d a s B r ig l-A n h y d r i d m i t p r i m ä r e n u n d s e k u n d ä r e n C a r b in o l e n u n t e r B i l d u n g v o n G lu c o s i d e n r e a g i e r t 2)4). D i e v o n B rig l

x)

N. L. Drake

J . P. Sweeney,

2) Z. physiol. Ch. 116, 1 (1921); 122, 245 (1922).