Vetrone wraz ze współpracownikami [135] pokazali obrazy pojedynczych komórek uzyskane po różnych czasach inkubacji komórek HeLa z nanocząstkami NaYF 4

Wyniki pokazały dynamiczne zachowanie nanocząstek wewnątrz komórki w wyniku aktywności wewnątrzkomórkowej. Dla krótkich czasów inkubacji, nanocząstki były równomiernie rozłożone we wnętrzu komórki. Po dłuższym czasie inkubacji, i w konsekwencji wewnątrzkomórkowego transportu substancji odżywczych z błony komórkowej do aparatu Golgiego, przestrzenna dystrybucja nanocząstek stała się bardzo niejednorodna. W przeciwieństwie do F. Vetrone i zespołu [135], inni autorzy J. Im z zespołem [136] i L. W. Zhang z zespołem [137] stwierdzili, że prawdopodobnie za przeniesienie nanocząstek z błony do cytoplazmy komórki, a następnie w pobliżu jąder, odpowiada transport za pośrednictwem endosomu.

W przedstawionej pracy po raz pierwszy zbadano wpływ czasu inkubacji i stężenia nanocząstek up-konwertujących na ich dystrybucję wewnątrz komórek. Opracowano wydajny proces wprowadzania nanocząstek do komórek HeLa. Zastosowano czynnik transfekcyjny

130 Lipofektaminę 2000 w celu zwiększenia wydajności wychwytu nanocząstek przez komórki.

Lipofektamina 2000 jest powszechnym czynnikiem transfekcyjnym stosowanym w biologii molekularnej i komórkowej. Jest między innymi stosowana do wprowadzenia siRNA lub DNA do komórek przez lipofekcję. Lipofektamina 2000 składa się z podjednostek lipidowych tworzących liposomy w środowisku wodnym, co umożliwia transfekcję materiałów. Liposomy zawierające DNA oddziałują na błonę komórkową i przenikają do cytoplazmy przez endocytozę, co umożliwia replikację i/lub ekspresję wprowadzonego DNA. Systematycznie, po raz pierwszy, przeanalizowałam rozkład nanocząstek wewnątrz komórek HeLa w funkcji czasu inkubacji, stężenia nanocząstek w obecności i pod nieobecność transportera. Wyniki opublikowano w publikacji autorstwa Sikory i współpracowników [121].

5.5.3.1. Wpływ czasu inkubacji i obecności Lipofektaminy 2000 na wprowadzanie nanocząstek NaYF

: Er

, Yb

/PVP do wnętrza komórek HeLa

Obrazy konfokalne komórek HeLa po 3 h, 6 h, 12 h i 24 h inkubacji w roztworze z 2,0 µM nanocząstek i w roztworze 2,0 µM nanocząstek z Lipofektaminą 2000 przedstawiono na rys. 83. Dokładna procedura obrazowania została opisana w rozdziale 6.

Materiały i Metody, podrozdział 6.2.7. Mikroskop konfokalny, str. 181. Autofluorescencja komórkowa została uzyskana przy pobudzeniu laserem 488 nm (CW) i detekcji w przedziale 508-585 nm - oznaczono ją kolorem zielonym. Klastery NaYF₄: 2% Er³⁺, 30% Yb³⁺/PVP zostały zaznaczone kolorem czerwonym (pobudzenie laserem femtosekundowym 980 nm i detekcja 515-671 nm). Po 3 godzinach inkubacji, w przypadku braku liposomów nie zaobserwowano luminescencji nanocząstek (rys.83). Po 6 godzinach inkubacji były widoczne małe ilości nanocząstek we wnętrzu komórek. Nanocząstki gromadziły się w cytoplazmie a niektóre można było zaobserwować na błonie komórkowej.

Przy dłuższych czasach inkubacji, obserwowano zwiększone ilości nanocząstek w komórkach HeLa (rys. 84).

W obecności liposomów zaobserwowano znaczne ilości nanocząstek wewnątrz komórek już po 3 godzinach inkubacji (rys. 83). Ilość nanocząstek wewnątrz komórek wzrastała wraz z wydłużeniem się czasu inkubacji i była znacznie wyższa niż w przypadku inkubacji bez Lipofektaminy 2000. Nanocząstki koncentrowały się głównie w cytoplazmie w pobliżu jądra komórkowego. Jako dowód zarejestrowano widma luminescencji wewnątrz

131 komórek i w jądrze (brak luminescencji pochodzącej od cząstek) po 24 godzinach inkubacji (rys. 83). Uzyskane wyniki wykazały znaczną poprawę wprowadzania nanocząstek do komórek HeLa w obecności Lipofektaminy 2000. Interesujące jest to, że liposomy powodują akumulację nanocząstek NaYF4: Er³⁺, Yb³⁺/PVP wokół jąder komórkowych.

Znaczna poprawa endocytozy nanocząstek przez Lipofektaminę 2000 jest spowodowana prawdopodobnie przez zdolność Lipofektaminy do tworzenia liposomów, w których zamknięte są nanocząstki. Gdy nanocząstki są wprowadzone do komórek, ich rozkład przestrzenny może być zmieniony przez dynamikę wewnątrzkomórkową. Dla krótkiego czasu inkubacji (3h z Lipofektaminą 2000 i 6 godzin bez liposomów) czerwona emisja jest bardziej równomiernie rozłożona wewnątrz komórki. Kilka nanocząstek zostało zaobserwowanych w pobliżu błony komórkowej. W przypadku dłuższych czasów inkubacji (24 h z Lipofektaminą 2000 i 24 h bez Lipofektaminy 2000) nanocząstki były głównie zlokalizowane w sąsiedztwie jądra komórkowego. Prawdopodobnie jest to dowód na to, że przestrzenna redystrybucja nanocząstek spowodowana jest przez transport składników odżywczych (i pseudo-odżywczych, takich jak nanocząstki) z błony komórkowej w pobliże jądra komórkowego - prawdopodobnie za pośrednictwem endosomów [136,137]. Wyniki przedstawione na rys. 84 potwierdziły, że nanocząstki up-konwertujące mogą być użyte do monitorowania dynamiki wewnątrzkomórkowej wymagającej stosunkowo długich czasów pomiaru. Dowód internalizacji komórkowej nanocząstek, w oparciu o kolokalizację autofluorescencji i luminescencji nanocząstek na konfokalnej osi z, jest przedstawiony na rys. 85.

Widmo emisji up-konwersji otrzymano, kiedy impuls laserowy był skoncentrowany na nanocząstkach wewnątrz komórek, wewnątrz komórek bez nanocząstek i poza komórkami (punkty oznaczone jako A, B i C na rys. 86, odpowiednio). Czerwona i zielona emisja nanocząstek up-konwertujących jest obserwowana, gdy plamka lasera znajduje się na nanocząstkach wewnątrz komórek. Bardzo słaba autofluorescencja jest obserwowana, gdy plamka lasera znajduje się wewnątrz komórki bez nanocząstek. Nie zaobserwowano luminescencji (w tym autofluorescencji), gdy wiązka laserowa była zlokalizowana na zewnątrz komórki. Widma emisji zostały zarejestrowane dla wszystkich próbek dla wszystkich czasów inkubacji.

Rysunek 83. Obrazy konfokalne nanocząsteczek NaYF z Lipofektaminą 2000 488 nm - CW, NaYF₄: 2% Er³⁺, 30 laser femtosekundowy

pochodzą z mikroskopu konfokalnego.

komórek HeLa po 3 h, 6 h, 12 h i 24 h inkubacji A:

steczek NaYF₄: 2% Er³⁺, 30 % Yb³⁺ i B: w roztworze 2,0 µM nanocz ą 2000. Autofluorescencję komórek oznaczono kolorem zielonym

detekcja przy długościach fali 508-585 nm).

30% Yb³⁺/PVP zostały oznaczone kolorem czerwonym laser femtosekundowy i detekcja 515-671 nm). Obrazy wewnątrz: kanał

mikroskopu konfokalnego.

132

A: w roztworze 2,0 µM nanocząstek

kolorem zielonym (pobudzenie Klastery nanocząstek oznaczone kolorem czerwonym (pobudzenie 980 nm ątrz: kanał nanocząstek. Obrazy

Rysunek 84. Stosunki obszarów

w obecności i pod nieobecno CellProfiler [138]. Intensywno uzyskano dla kilku

wzmocnienia.

Rysunek 85. Z-stack autofluorescencji komórek i nanocząstek NaYF

Ostrość kanału nanoczą Obrazy uzyskano z i Lipofektaminy 2000

obszarów nanocząstek do obszarów komórek dla różnych czasów ci i pod nieobecność Lipofektaminy 2000 analizowane

Intensywność nanocząstek była podobna dla każdego czasu inkubacji dla kilku obrazów konfokalnych przy tej samej mocy

autofluorescencji komórek HeLa (pobudzenie 488 nm,

stek NaYF₄: 2% Er³⁺, 30% Yb³⁺/PVP (pobudzenie 980 nm, emisja nanocząstek wypada w tym samym miejscu, co ostrość wnę

mikroskopu konfokalnego po 24 h czasu inkubacji 2000 z komórkami HeLa.

133

żnych czasów inkubacji analizowane przez program czasu inkubacji. Wyniki lasera i ustawieniach

emisja 508-585 nm) , emisja 515-671 nm).

wnętrza komórek HeLa.

inkubacji 10^-3 µM nanocząstek

Rysunek 86. Widmo emisyjne na nanocząstkach wewn (punkty oznaczone pobudzeniu 980 nm

5.5.3.2. Wpływ stężenia nanocz Lipofektaminy

NaYF

: Er

, Yb

W ramach tej pracy zbadano wewnątrz komórek. W tym celu

0,4 μM; 2,0 μM; 4,0 μM; 20 μ w obecności lub przy braku obecno Dokładna procedura została omówiona w Wprowadzanie nanocząstek NaYF

HeLa, str. 173 i podrozdział nanocząstek 0,2 μM; 2,0 μM i 4,0 μM i 40 μM są pokazane na

up-konwersji otrzymane, kiedy impuls lasera był ąstkach wewnątrz komórek, wewnątrz komórek bez nanocząstek punkty oznaczone odpowiednio jako A, B i C na obrazie). Luminescencja

(tryb skanowania lambda mikroskopu konfokalnego).