2000 na wprowadzanie nanocząstek PVP do wnętrza komórek HeLa

na ich dystrybucję ąstek o stężeniach: 0,2 μM;

przeprowadzono przez 24 godziny Lipofektaminy 2000.

Materiały i Metody, podrozdział 6.1.9.

rek nowotworowych Wyniki dla stężeń Wyniki dla stężeń 0,4 μM;

e opublikowane [121].

Rysunek 87. Obrazy konfokalne komórek nanocząsteczek NaYF

nanocząsteczek z Lipofektamin zielonym, i uzyskana

nanocząstek NaYF₄ a otrzymane przy pobu wewnątrz przedstawiają

komórek HeLa po 24 h inkubacji A: w roztworze 0,2 NaYF₄: 2 % Er³⁺, 30 % Yb³⁺ i B: w roztworze 0,2 μM; 2,0

Lipofektaminą 2000. Autofluorescencja komórek została , i uzyskana przy pobudzeniu 488 nm (CW) oraz detekcji

4: 2 % Er³⁺, 30 % Yb³⁺/PVP zostały zaznaczone kolorem czerwonym pobudzeniu 980 nm (laser femtosekundowy) i detekcji

przedstawiają kanał nanocząstek. Obrazy otrzymano z mikroskopu

135

0,2 μM; 2,0 μM; i 20 μM 2,0 μM i 20 μM została oznaczona kolorem 508-585 nm. Klastery zaznaczone kolorem czerwonym i detekcji 515-671 nm. Obrazy mikroskopu konfokalnego.

Rysunek 88. Obrazy konfokalne komórek nanocząsteczek NaYF

nanocząsteczek z Lipofektamin zielonym, i uzyskana

nanocząstek NaYF₄ a otrzymane przy pobu wewnątrz przedstawiają

komórek HeLa po 24 h inkubacji A: w roztworze 0,4 steczek NaYF₄: 2 % Er³⁺, 30 % Yb³⁺ i B: w roztworze 0,4 μ

Lipofektaminą 2000. Autofluorescencja komórek została , i uzyskana przy pobudzeniu 488 nm (CW) oraz detekcji

4: 2 % Er³⁺, 30 % Yb³⁺/PVP zostały zaznaczone kolorem czerwonym pobudzeniu 980 nm (laser femtosekundowy) i detekcji

przedstawiają kanał nanocząstek. Obrazy otrzymano z mikroskopu konfokalnego.

136

0,4 μM; 4,0 μM; i 40 μM μM; 4,0 μM i 40 μM została oznaczona kolorem 508-585 nm. Klastery zaznaczone kolorem czerwonym i detekcji 515-671 nm. Obrazy mikroskopu konfokalnego.

Podając nanocząstki w st przy braku liposomów. Gdy

nanocząstki pojawiły się w cytoplazmie wewn stężeniu (20 μM), wiele czą

komórek inkubowanych z nanocz nanocząstek weszło do wnętrza 2000 (rys. 89). Przy stężeniu 0,2 niewielkie ilości nanocząstek

podkreślić, że przy tym samym st nie stwierdzono żadnych nanocz zwiększono 10 razy, zaobserwowano wi (inkubacja z liposomami). Nanocz jądra. Nanocząstek jest więcej 2000 niż w przypadku inkubacji

Podobną zależność można zaobserwowa 4,0 μM i 40 μM (rys. 88).

Rysunek 89. Stosunki obszarów w obecności i pod CellProfiler [138]. Intensywno Wyniki uzyskano dla kilku wzmocnienia.

ąstki w stężeniu 0,2 μM nie zaobserwowano ich zwiększono stężenie nanocząstek 10 razy w cytoplazmie wewnątrz komórek i na ich błonach wiele cząsteczek jest rozmieszczonych w cytoplazmie

nanocząstkami w obecności Lipofektaminy 2000 ętrza komórek, w porównaniu do inkubacji bez ężeniu 0,2 μM i przy obecności Lipofektaminy 2000 s

ąstek w cytoplazmie i w pobliżu błony komórkowej tym samym stężeniu nanocząstek bez obecnoś

nanocząstek w wnętrzu komórek. Gdy stęż obserwowano większą ilość klasterów nanocząstek

Nanocząstki mają wyraźną tendencję do akumulowania si ęcej wewnątrz komórek w przypadku inkubacji

w przypadku inkubacji bez pęcherzyków. Wyniki są przedstawione żna zaobserwować w odniesieniu do stężeń nanocz

nanocząstek do obszarów komórek dla różnych st ci i pod nieobecność Lipofektaminy 2000, analizowane

Intensywność nanocząstek była podobna dla każdego dla kilku obrazów konfokalnych przy tej samej mocy

137 wewnątrz komórek (2,0 μM), niektóre błonach. W wyższym cytoplazmie. W przypadku Lipofektaminy 2000 dużo więcej inkubacji bez Lipofektaminy ci Lipofektaminy 2000 są widoczne błony komórkowej. Warto obecności pęcherzyków Gdy stężenie nanocząstek wewnątrz komórek akumulowania się wokół inkubacji z Lipofektaminą przedstawione na rys. 89.

ęż ń nanocząstek: 0,4 μM;

żnych stężeń nanocząstek analizowane przez program żdego czasu inkubacji.

przy tej samej mocy lasera i ustawieniach

138

5.5.4. Podsumowanie

Zsyntetyzowano nanocząstki NaYF4 domieszkowane różnymi ilościami jonów metali ziem rzadkich Er³⁺ i Yb³⁺ stosując PVP jako środek chelatujący. Nanocząstki miały rozmiary około 30 nm i strukturę krystalograficzną czystej fazy regularnej (kubicznej).

Rozmiary nanocząstek można było zmieniać przez zmianę warunków syntezy.

Ponadto kryształy są monodyspersyjne w wodzie i kilku powszechnie stosowanych rozpuszczalnikach organicznych. Nanokryształy te mają wielki potencjał w aplikacjach biologicznych. W naszej pracy wykazaliśmy, że pokryte PVP, rozpuszczalne w wodzie, nanocząsteczki up-konwertujące NaYF4 mogą być łatwo wprowadzone do komórek przez endocytozę. Bardzo wydajna luminescencja z NIR do światła widzialnego po pobudzeniu nanocząstek laserem femtosekundowym 980 nm została zastosowana w celu uzyskania obrazu o doskonałym kontraście wewnątrzkomórkowym i dużej stabilności czasowej. Obrazy pojedynczych komórek uzyskane po różnych czasach inkubacji i w obecności lub przy braku obecności liposomów wykazują zachowanie dynamiczne nanocząstek wewnątrz komórek w wyniku aktywności wewnątrzkomórkowej. Dla krótkich czasów inkubacji i bez liposomów, nanocząstki nie są wchłaniane do komórek. Jednakże, przy krótkich czasach inkubacji i w obecności pęcherzyków, nanocząstki są endocytozowane.

Zatem można wnioskować, że inkubacja z liposomami powoduje zwiększenie wydajności wprowadzania nanocząstek do wnętrza komórek. Ostateczne wyniki przedstawiają dowody potencjalnych zastosowań nanocząstek NaYF₄ do statycznego i dynamicznego obrazowania biologicznego. Podobne obserwacje zostały uzyskane w zależności od użytego stężenia nanocząstek w obecności i pod nieobecność transportera. Stwierdzono tendencję do gromadzenia się nanocząstek w pobliżu jądra już przy małych stężeniach w wyniku transportu wewnątrzkomórkowego substancji odżywczych z błony komórkowej w pobliże jądra komórkowego prawdopodobnie przez transport, w którym pośredniczą endosomy.

Wybór optymalnego stężenia nanocząstek i czasu inkubacji jest ważny w badaniach dynamicznego obrazowania i ma decydujący wpływ na żywotności komórek oraz dostarcza strategii syntezy i rozwoju multimodalnych materiałów obrazujących.

139

5.6. Pokrywanie nanocząstek

NaYF

: Er

, Yb

/PVP warstwą tlenku krzemu SiO

Silanizacja powierzchni jest często stosowaną techniką kowalencyjnej modyfikacji różnych rodzajów powierzchni, w tym krzemionki, tlenków metali (np. cyny i żelaza), a także powierzchni grafitowych [139]. Proces silanizacji została opisany w podrozdziale 5.3.1. Funkcjonalizacja powierzchni i pokazany na rys. 68. Pokryte warstewką SiO2 kryształy mogą być biofunkcjonalizowane przez dołączenie do nich odpowiednich molekuł biologicznych, zgodnie z procedurami opisanymi w podrozdziale 5.3.2. Biokoniugacja.

Pokrywano nanocząstki NaYF₄ domieszkowane różnymi ilościami ziem rzadkich cienką warstwą SiO₂ w celu późniejszego dołączania do nich molekuł biologicznie aktywnych, modyfikacji ładunku na powierzchni oraz poprawieniu stabilności kompleksów.

Otoczone warstwą SiO₂ nanocząstki są hydrofilowe, mają lepszą fotostabilność i są biokompatybilne. Do powłok krzemionkowych możemy również przyłączać fotouczulacze i stosować tak skonstruowane nanokompleksy w terapii nowotworowej, opisanej w podrozdziale 5.4.3. Wielofunkcyjne nanocząstki up-konwertujące.

Metoda pokrywania nanocząstek NaYF4: Er, Yb/PVP warstwą SiO2 została opisana w rozdziale 6. Materiały i Metody, podrozdział 6.1.10. Pokrywanie nanocząstek NaYF4: Er³⁺, Yb³⁺/PVP warstwą SiO2, str. 174.

5.6.1. Charakteryzacja strukturalna nanocząstek NaYF

: Er

, Yb

/PVP/SiO

Na obrazie TEM pokazano, że grubość warstwy SiO₂ na nanocząstkach NaYF₄: 2 % Er³⁺, 30 % Yb³⁺ wynosi około 9 nm (rys. 90). Warstwa krzemionkowa, została naniesiona na nanocząstki, których własności opisano w poprzednim rozdziale. Analiza elektrogramu wskazuje na regularną (kubiczną) strukturę NaYF₄. Tło dyfuzyjne na elektrogramie pochodzi od amorficznej struktury związku SiO₂ (rys. 90). Metoda TEM została opisana w rozdziale 6. Materiały i Metody, podrozdział 6.2.1. Transmisyjny mikroskop elektronowy, str. 176.

Rysunek 90. Obraz TEM nanoczą

po prawej stronie przedstawiono elektronogram odpowiadaj po prawej przedstawione zostało zdj

5.6.2. Właściwości luminescencyjne nanocząstek NaYF

: Er

Pokrycie nanocząstek NaYF

intensywności zielonej i czerwonej luminescencji przy pobudzeniu 960 nm w koloidalnym roztworze wodnym

Rysunek 91. Widmo luminescencji przy pobudzeniu NIR (laser ci

TEM nanocząstek NaYF₄ : 2 % Er³⁺, 30 % Yb³⁺ pokrytych warstw prawej stronie przedstawiono elektronogram odpowiadający strukturze nanocz po prawej przedstawione zostało zdjęcie TEM nanocząstek w mniejszym powi