Struktura i właściwości mucyn śluzowych

(1)

A C T A U N I V E R S I T A T I S L O D Z I E N S I S FOLIA BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA 10, 1994

Grażyna Zaleśna, K rzy szto f Gwoździński

STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI MUCYN ŚLUZOWYCH

W artykule opisano funkcję oraz właściwości fizykochemiczne śluzu przewodu pokarmowego ze szczególnym uwzględnieniem roli mucyn. Przedstawiono również skład chemiczny i budowę mucyn oraz modele ich struktury. Omówiono biosyntezę mucyn oraz mechanizm tworzenia przez nie lepkoelastycznego żelu. Opisano także udział śluzu w chorobach wrzodowych i nowotworowych żołądka.

WSTĘP

M ucyny są wysokocząsteczkowymi glikoproteinam i wydzielanymi przez wyspecjalizowane kom órki nabłonka. Ich obecność determ inuje lepkoelastyczne właściwości śluzu, który pełni rolę nawilżającą i ochronną w układzie pokarm ow ym , oddechowym i moczowo-płciowym.

W ostatnich latach dokonano znacznego postępu w poznaniu biochemii glikoprotein typu mucynowego. Związki te charakteryzują się wysokim poziomem O-związanych oligosacharydów. Początkow o glikoproteiny były wyłącznie znane jak o główne składniki śluzu. Ostatnie badania wykazały, że m ucyny z przewodu pokarm owego, płuc, gruczołów ślinowych, gruczołów potowych oraz kom órek nowotworowych są strukturalnie spokrewnione z glikoproteinam i o wysokiej masie cząsteczkowej produkow anym i przez kom órki nabłonka jako białka błonowe. Podczas syntezy m ucyn, pow stają wielkie cząsteczki o masie cząsteczkowej 0,5 x 106—16 x 106, które są grom a dzone w śluzowych granulach aż do m om entu sekrecji. W ydzielane m ucyny tw orzą barierę, nie tylko w celu ochrony delikatnych kom órek nabłonka przed zewnętrznym środowiskiem, ale także w celu selekcji substancji budujących i pobieranych przez nabłonek.

Celem niniejszego artykułu jest przybliżenie polskiemu czytelnikowi p ro b lematyki związanej z biosyntezą, budową oraz właściwościami m ucyn oraz ich

(2)

roli w tworzeniu śluzu. Om ówiono w nim koncepcje m onomerycznej i oligomerycznej struktury mucyny na podstawie modeli opisanych przez zespo ły: A l l e n a [1], C a r l s t e d t a [2] i S ł o m i a n e g o [3]. A rtykuł ten w znacznym stopniu oparty jest na pracach przeglądowych wymienionych autorów oraz najnowszych pracach S t r o u s a i D e k k e r a [4] oraz L a - b o i s s e ’ a [5].

FUNKCJE ŚLUZU

W szystkie żywe kom órki k ontaktują się z ich środowiskiem poprzez błonę, selektywną barierę oddzielającą wnętrze kom órki od zewnętrznego środow is ka. W zajemne oddziaływania zachodzą przez błonę plazm atyczną, składającą się z lipidów zorganizowanych w dwuwarstwę i integralnych glikoprotein błonowych, które są osadzone w dwuwarstwie lipidowej. Część z tych białek błonowych osiąga rozm iary kilkudziesięciu nanom etrów i zawiera znaczną ilość węglowodanów zorganizowanych w oligosacharydy. D la większości typów kom órek zwierzęcych ta bariera jest wystarczająca dla podtrzym ania integralności komórkowej.

Wiele rodzajów nabłonków kontaktuje się ze środowiskam i, przed którym i wym agana jest dodatkow a ochrona. Dlatego są one pokryte ochronną wydzieliną, k tó ra jest także selektywną barierą pomiędzy wnętrzem chronio nego układu a powierzchnią kom órek nabłonka. T a wydzielina nazywana zwykle śluzem jest produkow ana przez specjalne kom órki nabłonka. Śluz jest wysoko uw odnionym , śliskim żelem składającym się z dużej liczby składników. Uw aża się, że za jego specyficzne, ochronne właściwości odpowiedzialna jest m ucyna. Zdolność m ucyn do ochrony powierzchni nabłonka zależy w dużym stopniu od wysokiej zawartości oligosacharydów i ich zdolności do tworzenia lepkoelastycznego żelu. Dotychczasowa wiedza o funkcji tych złożonych cząstek ogranicza się do ogólnie akceptowanej idei, że cząstki te służą przede wszystkim do ochrony kom órek i nabłonka. Śluz jest również n aturaln ą barierą między nabłonkiem a czynnikami patogennym i, jak bakterie i wirusy [1]. Oprócz wymienionych funkcji śluz nawilża otaczający nabłonek i chroni go przed czynnikami mechanicznymi (przesuwający się pokarm w układzie pokarm owym ). Ostatnie badania na cD N A mucynowych przy użyciu technik klonow ania, pozwoliły na lepsze poznanie pierwotnej struktury mucyn. G likoproteiny śluzu definiuje się jak o podklasę glikoprotein, które są proteo- glikanami. Ich specyfikę charakteryzują dwie zasadnicze cechy. Pierwsza, wysoki procent ich m asy składa się z oligosacharydów, połączonych przez wiązanie O-glikozydowe z resztami seryny i treoniny w szkielecie białkowym. D ruga, szkielet białkowy zawiera liczne powtarzające się sekwencje, obej

(3)

m ujące właściwie wszystkie miejsca wiązania oligosacharydów przez wiązanie O-glikozydowe. T rudno jest precyzyjnie podać dokładną ilość O-związanych cukrów , ale ogólnie wynosi ona więcej niż 50%. Wszystkie dotychczasowe badania wykazują, że ten pogląd różni się od wcześniejszej koncepcji P i g - m a n a [6], który za główną cechę m ucyn uważał nieobecność oligosachary dów. G likoproteiny typu m ucyn zostały podzielone wg ważności ich funkcji. Istnieją glikoproteiny typu mucynowego sekrecyjne oraz typu mucynowego związane z błoną. M ucyny sekrecyjne tw orzą lepki żel, który pokryw a powierzchnię nabłonka przewodu układu pokarm owego, oddechowego i roz rodczego. Niezależnie od nabłonka wydzielany śluz pokryw a błonę plaz- m atyczną tylko wierzchnich kom órek. W nabłonkach żołądka i szyjki macicy warunki środow iska wymagają stosunkowo grubej warstwy śluzu, podczas gdy w przełyku czy woreczku żółciowym tworzy cienką warstwę, k tó ra zapewnia dostateczną ochronę przed środowiskiem. Niezależnie od rodzaju chronionego nabłonka inny może być skład okrywającego go śluzu. W żołądku, przy bardzo niskim pH i wysokim stężeniu pepsyny, m ucyny m uszą charak teryzować się wysoką odpornością na te czynniki, a warstw a śluzu musi ściśle przylegać do kom órek nabłonka. N atom iast w jelicie cienkim, z jego lekko alkalicznym odczynem i różnorodnością enzymów hydrolitycznych, warstw a śluzu musi pozwalać na łatwy dostęp substancji odżywczych do enterocytów. Pod wpływem sił mechanicznych oraz enzymów hydrolitycznych w arstw a uzu ulega ciągłej erozji, kom órki m uszą więc produkow ać wystarczającą zbę cząsteczek mucyny, by zapewnić stałą ochronę nabłonka. W przewodzie pokarm ow ym , gdzie grubość i funkcje warstwy śluzu zmieniają się znacznie w ciągu dnia, istnieje konieczność by mechanizm regulacyjny utrzym ywał syntezę m ucyn i jej wydzielanie na odpowiednim poziomie dostosow anym do aktualnych potrzeb. W rezultacie istnieje pewien rodzaj równowagi dynam icz nej między erozją śluzu a jego wydzielaniem. W przypadku żołądka występują

Ś lu z

Hcoj HC0~ HCO” HCO^ <_ w arstw a

) ₁ i 1 <r- n a b ło n e k

śluzów ka

(4)

trzy współdziałające ze sobą bariery ochronne, którym i są: śluz - „w arstw a” wodorowęglanowa, błony kom órkow e nabłonka oraz przepływ krwi w śluzów ce (rys. 1). Śluz okrywający nabłonek tworzy w żołądku ciągłą i nieprzepusz czalną warstwę dla dużych cząsteczek, takich jak pepsyna. Z drugiej strony, jony H + m ogą dyfundować przez warstwę śluzu. Kwas ze światła żołądka jest neutralizow any w obrębie stabilnej niemieszalnej warstwy przez jony IIC O 3 [7], Ten m odel został potwierdzony przez liczne badania nad wydzielaniem w odorowęglanu przez powierzchnię kom órek śluzowych i pom iary pH poprzez warstwę śluzu [8-11]. Oprócz m ucyn żel zawiera wodę, białka kom órkow e, elektrolity i pozostałości kom órek. Ochronne i zwilżające właściwości śluzu w znacznym stopniu zależą od lepkoelastycznych właściwości m ucyn. Niezbęd nym warunkiem do kształtow ania żelu jest zdolność m ucyn do tworzenia oligomerycznych struktur za pom ocą wewnątrzcząsteczkowych m ostków ditiolowych. M ucyny związane z m em braną są podobne do m ucyn sekrecyjnych, gdyż posiadają powtarzające się sekwencje aminokwasów zawierających wszy stkie O-związane oligosacharydy, ale różnią się od mucyn typu sekrecyjnego zawartością hydrofobow ych reszt aminokwasów zakotwiczających długie włókniste cząsteczki w błonie plazmatycznej. Ponadto praw dopodobnie nie występują w nich m ostki ditiolowe. Funkcja mucyn związanych z błoną lub zasocjowanych z kom órką nie jest dotychczas wyjaśniona. Ekspresja nie których z tych m ucyn wzrasta ogromnie w transform ow anych kom órkach. W przypadku nowotworów nabłonka, wysoki poziom tych m ucyn pojaw ia się w rozpuszczonej formie we krwi, pochodząc z cząsteczek proteolitycznie wyciętych z kom órek nowotworowych. Właściwości m ucyn związanych z bło ną zostały omówione w dalszej części artykułu.

FIZYKOCHEMICZNA CHARAKTERYSTYKA MUCYN

M ucyny sekrecyjne są podstawowym i składnikami żelu śluzowego. Śluz składa się w 95% z wody, 1% soli oraz glikoprotein śluzowych i dużej ilości innych związków, takich jak: elektrolity, różne białka kom órkow e i surowicze, lipidy i kwasy nukleinowe [12, 13]. Zgodnie z licznymi pracami A 11 e n a i wsp. [1, 13] najważniejsze fizykochemiczne właściwości żelu śluzowego są związane z obecnością natywnych mucyn. A utorzy ci wykazali, że w fizjologicznych stężeniach (ok. 50 m g/m l) oczyszczone mucyny m ogą być przywrócone w żel o właściwościach fizykochemicznych identycznych do natywnego żelu śluzowe go. Specyficzna zdolność m ucyn do tworzenia żelu jest przypisywana od powiedniej kom binacji cech strukturalnych ich cząsteczek, które będą przed staw ione w następnym rozdziale. Oczy, układ pokarm owy, oskrzela, płuca,

(5)

pęcherz, przewód trzustkow y, pęcherzyk żółciowy, układ rozrodczy chronią swoje nabłonki przez wytwarzanie mucyn sekrecyjnych [13, 14]. Te m ucyny stanow ią znaczącą grupę glikoprotein, różniących się strukturalnie od glikoprotein surowicy i proteoglikanów. Większość oligosacharydów jest przyłączo n a do polipeptydu przez wiązanie O-glikozydowe pomiędzy resztami N -acetylogalaktozoam iny (G aN A c) a hydroksylowymi grupam i reszt seryny i treoniny. D odatkow o wykazano, że wiele m ucyn zawiera niewielką liczbę N-związanych glikanów [15, 16]. M ucyny odróżniają się od proteoglikanów tym, że nie posiadają reszty kwasu D-glukuronow ego i L-iduronowego [17]. N atyw ne cząsteczki m ucyn sekrecyjnych m ają oligomeryczną strukturę zawie rającą kilka monomerycznych glikoprotein. Te m onom ery różnią się m asą cząsteczkową od 2,5 x 105 do 1 x 106. Więcej niż 50% ich suchej m asy przypada na węglowodany zorganizowane w oligosacharydy związane wiąza niem O-glikozydowym z seryną czy treoniną. Łańcuchy węglowodanowe zawierają od 1 do 20 cukrów prostych. Oligomery połączone są przez m ostki ditiolowe. Białka rdzeniowe zawierają regiony bogate w reszty seryny i treoni ny zgrom adzone w centralnej części polipeptydu. Zasadniczo wszystkie hydroksyam inokw asy w tym centralnym regionie są O-glikozylowane. W m u- cynach szyjki macicy i tchawiczo-oskrzelowych, bogato O-glikozylowana część jest podzielona na sekwencje o ok. 600-1200 aminokwasów, które są oddzielone krótkim i nieglikozylowanymi dom enam i [18, 19]. Bogato glikozylowany region jest naładow any ujemnie, spowodowane jest to obecnością reszt kwasu sialowego i częstą, ale nie powszechną, obecnością reszt siarczanowych związanych estrowo z węglowodanami. Te glikozylowane regiony są bardzo odporne n a proteolizę. Końcowe części białek rdzeniowych zawierają „norm al ny” rozdział reszt aminokwasowych. W tych częściach reszty cysteinowe są rozmieszczone w ten sposób, że m ogą tworzyć wewnątrz- i międzycząstecz- kowe m ostki ditiolowe. Jeśli w cząsteczce mucyny występują N-związane oligosacharydy, to są one zlokalizowane również w tych regionach. S truktura oligomeryczną jest konieczna dla zachowania reologicznych właściwości m ucyn. Czynniki redukujące i proteazy prowadzą do u traty żelotwórczych właściwości mucyn. Odpowiednia liczba związanych m onom erów, w połącze niu z różnorodnością O-związanych oligosacharydów, powoduje nadzwyczaj ną heterogenność oligomerycznych mucyn. M ucyny związane z błoną m ają wspólną pulę oligosacharydów z m ucynam i sekrecyjnymi. W tej klasie m ucyn oligomeryzacja nie wydaje się być regułą.

Reologiczne właściwości m ucyn są rezultatem obecności m ostków ditiolowych pomiędzy m onom eram i, jak i niekowalencyjnych wewnątrzcząstecz- kowych interakcji pomiędzy łańcuchami węglowodanów. Cząsteczki m ucyny tw orzą lepkoelastyczny żel ze specyficznymi właściwościami Teologicznymi. Unieruchom iony śluz przylegający do nabłonka tworzy niemieszalną warstwę n a powierzchni błony plazmatycznej kom órek nabłonka.

(6)

ROZMIARY I SKŁAD CZĄSTECZEK MUCYNY

Szczegóły dotyczące struktury molekularnej i rozm iarów m ucyn są odm ien ne i trudne do pogodzenia ze sobą. Istnieje wiele danych na tem at rozm iarów cząsteczek glikoproteiny śluzu w formie monomerycznej lub w form ie natyw- nej (tab. 1). Różnice te wynikają z różnorodnych m etod izolowania mucyn. Badania na tym polu są utrudnione, bowiem m asa cząsteczkowa oligomerycznych m ucyn nie może być dokładnie wyznaczona ani przez regularną elektroforezę na żelu poliakryloamidowym z SDS (siarczan sodowo-dodecylo- wy), ani przez filtrację żelową. Analiza monomerycznych cząstek m ucyny, m im o że m ogą one wchodzić w niskoprocentowy żel poliakryloam idowy, jest skom plikow ana przez ich niezwykłą heterogenność.

T a b e l a ł Masa cząsteczkowa mucyn typu glikoproteinowego

w zależności od stopnia agregacji

Mucyny Monomer (x 106) Oligomer (x 10*) Z żołądka człowieka 2,0 4,0-6,0 Z żołądka szczura 0,9 1,9-3,6 Z układu tchawiczo- 0,5-0,6 9,0-16,0

-oskrzel owego

Z szyjki macicy zwią 2,0-2,5 10-15 zane z błoną- MUC1 0,45-0,65

-M ało jest informacji dotyczących rozm iarów nienaruszonego rdzenia białkowego mucyny. Większość obliczeń procentu węglowodanów na m ono- m eryczną jednostkę jest za wysoka. D ane dotyczące liczby reszt aminokwasowych mucyny, otrzymanej przez wirowanie w gradiencie stężeń CsCl w nieobecności inhibitorów proteaz, są zaniżone. D la przykładu, m ucyna z żołądka szczura izolowana bez inhibitora proteaz zawiera ok. 10% białka, podczas gdy ta sama m ucyna izolowana w obecności chlorku guanidyny i PM SF (fenylometylosulfonylofluorek) zawiera ok. 50% białka [20]. R oz szerzając te kalkulacje z założeniem, że rdzeń białkowy posiada m asę 300 000 i zawiera wszystkie N-związane oligosacharydy [21, 22], że wszystkie seryny i treoniny są O-glikozylowane i że 3% m onom eru składa się z siarczanów, m ożna obliczyć, że 1 m onom er m ucyny żołądka zawiera ok. 800 O-związanych łańcuchów o średniej długości 5 reszt cukru i 1 siarczan na 3 O-związane łańcuchy.

Skład m onosacharydow y wyizolowanych m ucyn wykazuje dużą ilość fukozy, galaktozy, N-acetylogalaktozoam iny, N-acetyloglukozoam iny i małe

(7)

ilości kwasu sialowego oraz często reszty m annozy. Obecność m annozy jest charakterystyczna dla pojawienia się N-związanych glikanów, jak o że ten m onosacharyd jest nieobecny w O-związanych oligosacharydach. M ucyny są ujemnie naładowanym i cząsteczkami. Spowodowane to jest obecnością kwasu sialowego i reszt siarczanowych w oligosacharydach. W składzie am inokwasowym przeważa seryna, treonina, prolina, glicyna i reszty alaniny. Prawie całą serynę i treoninę zawierają O-związane glikany [13, 23, 24]. O-związane glikany w mucynach są bardzo heterogenne i różnią się w długości łańcuchów (1—20 reszt) [13, 25]. D uża ilość ściśle upakowanych O-związanych glikanów chroni znaczną część polipeptydu mucyny przed proteazam i. Jak już wykaza no, ta ochrona nie jest doskonała, jako że oligomery mucyny m ogą być degradow ane przez enzymy proteolityczne na fragm enty, które nie posiadają zdolności do tworzenia wiskoelastycznego żelu [26, 27],

Podstaw ow ą cechą reologicznej charakterystyki m ucyn jest ich oligo- m eryczna struktura [1, 13]. Obecność podjednostek powiązanych m ostkam i ditiolowymi po raz pierwszy przedstaw iona przez S n a r y i wsp. [28], Redukcja m ostków ditiolowych pomiędzy resztami cysteiny pow oduje utratę lepkości żelu mucynowego [1, 26, 27], W 1981 r. A l l e n [1] zaproponow ał m odel dla oligomerycznej struktury mucyny z żołądka świni. W tzw. m odelu „w iatrak a” cztery identyczne m onom ery m ucyny są przyłączone do jednego centralnie związanego białka przez m ostki ditiolowe. Uważa się, że oprócz m ucyny żołądka, białka wiążące występują w m ucynach śliny i m ucynach jelit [28, 29], T e polipeptydy ujaw niają się, kiedy oczyszczona oligomeryczna m ucyna jest zredukow ana i analizow ana na żelu poliakryloamidowym z SDS. Znaleziono polipeptydy o masie cząsteczkowej 70 000 dla m ucyny żołądka [30], 90 000 dla jelita cienkiego świni [31], 118 000 dla jelita człowieka i szczura oraz dla m ucyny człowieka z układu oddechowego [32]. Brakuje jednak solidnego dow odu dla m odelu „w iatraka” . Dość częste występowanie glikoproteiny o masie cząsteczkowej 118 000 w licznych preparatach m ucyn badanych przez R o b e r t s o n a i wsp. [33] wskazuje, że m ogą to być niemucynowe białka, które są zasocjowane z natywnym oligomerem mucyny. S ł o m i a n y i wsp. [34] dem onstrują ścisłe powiązania pomiędzy ludzkim i szczurzym białkiem wiążącym o masie cząsteczkowej 118 000 a fragmentem fibronektyny. Nowsze badania, przy użyciu m ikroskopii elektronowej, przemawiają n a korzyść innej ogólnej struktury m ucyny [35, 36, 37]. Ten m odel po raz pierwszy za proponow any przez C a r l s t d t a i S h e e h a n a [2], którzy badali m ucyny szyjki macicy zaprzecza istnieniu białka wiążącego. Chociaż rola tych białek w oligomeryzacji niektórych m ucyn nie może być wykluczona, m onom ery mucyny są najpraw dopodobniej połączone razem, bezpośrednio przez m ostki ditiolowe bez białka łączącego obecnego w oligomerze.

K ontrow ersje istnieją na tem at ilości cząsteczek lipidów zasocjowanych z m ucynami. S 1 o m i a n y i wsp. [25, 38] znaleźli dużą ilość lipidów w

(8)

prepara-tach, w których śluz był usuwany ze śluzówki za pom ocą szpatułki. A utorzy ci znaleźli następujący skład śluzu: 70% białka, 15% węglowodanów i 15% lipidów. Lipidy zawierały fosfolipidy, glikolipidy, m ono-, di- i triglicerydy, kwasy tłuszczowe, cholesterol i estry cholesterylu. Skład lipidowy wykazany w preparatach śluzu był podobny do całkowitego składu lipidowego kom órek, wskazując, że te lipidy praw dopodobnie pochodzą z kom órek nabłonka, uszkodzonych w trakcie izolowania śluzu. W skazuje na to również bardzo wysoka ilość białka znaleziona przez tych autorów [39], Jeśli się przyjmie, że wszystkie węglowodany w ich preparatach śluzu pochodzą z m ucyny, wtedy m ucyna będzie stanow iła tylko 20% wszystkich składników śluzu. Jakkolw iek jest powszechnie zaakceptowane, że m ucyna jest głównym składnikiem śluzu [1, 13]. W ydaje się, że powyższe badania zawyżają zarów no zaw artość białka, ja k i lipidów w śluzie. W prowadzonych przez nas badaniach, dotyczących zawartości lipidów obliczyliśmy, że stanow ią one ok. 7% całkowitej m asy suchego śluzu pochodzącego z żołądka świni [40].

W badaniach m ucyn trzustkowych wykazano, że mucyny nie zawierają reszt cysteiny w polipeptydzie związanym z powierzchnią błony kom órkow ej; wszystkie reszty cysteiny są obecne w regionie białka spinającego dwuwarstwę lipidową [41, 42]. Te reszty są potencjalnymi miejscami w iązania kwasów tłuszczowych, jak sugerowano dla innych białek transm em branow ych [43],

Znaczenie niemucynowych składników w żelu śluzowym jest stosunkow o m ało poznane. W ykazano, że część tych składników wpływa in vitro na reologiczne właściwości żelu śluzowego. N iektóre składniki, takie jak: białka kom órkow e i kwasy nukleinowe, przechodzą do żelu z obum arłych kom órek jak o zanieczyszczenia i praw dopodobnie nie m ają określonej funkcji. Przed

stawiony w dalszej części tzw. m odel dynamiczny budowy śluzu zakłada udział tych składników w jego strukturze. Pewne białka, jak lizozym i wydzielające IgA, są dozowane do śluzu jako składniki m echanizm u obronnego przeciw wirusom i bakteriom [44]. W ykazano, że album ina i kationy, takie jak wapń wpływają in vitro na reologiczne właściwości wyizolowanego śluzu [45, 46, 47]; jed nak rola tych składników in vivo w funkcji śluzu pozostaje nie wyjaśniona.

STRUKTURA SZKIELETU BIAŁKOWEGO

Określenie rozm iarów białkowego szkieletu jest bardzo skom plikowane. Większość danych dotyczących jego rozm iarów otrzym ano po chemicznej deglikozylacji białka przy użyciu fluorow odoru, kwasu trifluorom etanosul- fonowego lub mieszaniny hydrolaz. M asa cząsteczkowa szkieletu białkowego m ucyn z gruczołów podszczękowych owcy i wołu jest w zakresie 58 300-96 500 [48, 49], Jednak w tych m etodach występuje wysoki stopień

(9)

degradacji wiązań peptydowych lub enzymatyczna proteoliza. M a r i a n n ę i wsp. [50], używając przeciwciał określili rozm iar szkieletu białkowego m ucyny z ludzkich oskrzeli na ok. 400 000. Przeciwciała wytworzone przeciw szkieleto wi białkowemu różnych typów glikoprotein śluzu m ają wielkie znaczenie dla identyfikacji mucyn. Przeciwciała przeciwko N- czy C- końcowej (nieglikozylo- wanej) części szkieletu są najbardziej przydatne dla badań biochemicznych i m orfologicznych, jak o że rozpoznają zarów no prekursor, jak i dojrzałą cząsteczkę mucyny.

Ostatnie badania przy użyciu technik biologii m olekularnej dostarczyły nowych informacji dotyczących struktury szkieletu polipeptydowego gliko protein śluzu. Badania potwierdziły wcześniejszą koncepcję budowy białka szkieletowego, że zawiera ono wysoki procent seryny, treoniny, alaniny, glicyny i proliny. Te pięć am inokwasów stanowi więcej niż 50% wszystkich obecnych aminokwasów. Reszty seryny i treoniny dom inują w składzie am inokwasowym , stanow iąc razem od 25-40% wszystkich aminokwasów. O-połączone glikany są przyłączone do reszt seryny i treoniny, które są oddalone od siebie o jedną lub dwie reszty, czasem są nawet przyłączone do reszt przyległych [13, 15, 23, 51]. Aminokwasy leżące między O-glikozylowany- mi regionami to zazwyczaj prolina, glicyna i alanina. Ponieważ reszta proliny m oże indukow ać fi- „skręt” konform acji, jest praw dopodobne, że wysoki procent aminokwasów pozwala na ścisłe upakow anie O-powiązanych oligo- sacharydów. P i g m a n i wsp. [52] wysunęli hipotezę, że białkowy szkielet m ucyny gruczołów pod szczękowych wołu składa się z licznych pow tarzających się sekwencji aminokwasów. T a koncepcja została potw ierdzona ostatnio dla wszystkich znanych do tej pory glikoprotein śluzu. Pow tarzające się sekwencje są zlokalizowane w centralnej części łańcucha polipeptydowego i zawierają wszystkie miejsca wiążące dla O-związanych oligosacharydów. A naliza D N A m ucyny z gruczołów pod szczękowych świni potwierdziła, że ta m ucyna zawiera kolejno pow tarzające się, identyczne sekwenq’e 81 reszt am ino- kwasowych z wysokim procentem seryny, treoniny i glicyny [53].

STRUKTURA WĘGLOWODANÓW

Około 50% suchej m asy m ucyn stanow ią węglowodany, O-związane z seryną lub treoniną w środkowej części szkieletu białkowego. O-związane oligosacharydy m ogą być łatwo usunięte z peptydu przez łagodne p o trak to w a nie zasadą. Jeśli reakcja zachodzi w obecności borow odorku (reakcja elim ina cji), to O-glikozydowo związane oligosacharydy otrzym uje się w stanie nieuszkodzonym [54].

(10)

Jest to ważne dla poznania struktury i składu O-związanych cukrów. Oligosacharydy zawierają następujące m onosacharydy: N -acetylogalaktozoa- minę, N-acetyloglukozoaminę, galaktozę, fukozę. Oprócz tych cukrów w cząs teczce występuje kwas N-acetyloneuraminowy, kwas N-glikoliloneuram inowy oraz kwas sialowy. Wszystkie te cukry nadają ujemny ładunek oligosachary- dom . D odatkow o O-związane oligosacharydy m ogą zawierać związane estrowo reszty siarczanowe. W zależności od posiadanego ładunku oligosachary dy dzieli się na obojętne i kwaśne glikany. W O-związanych glikanach m ożna wyróżnić trzy domeny: rdzeń, szkielet i region peryferyczny. Każdy z nich posiada specyficzne miejsca antygenowe i determ inanty związane z now o tworem.

Budowa rdzenia. Reszta N-acetylogalaktozoam iny związana z grupą hydro

ksylową seryny czy treoniny szkieletu białkowego oraz reszty cukrowe przyłączone do niej są zdefiniowane jako struktury rdzenia. O-glikozydowo związany oligosacharyd może zawierać N-acetylogalaktozoam inę jak o jedyny cukier albo być zakończony resztą kwasu sialowego, znalezionego w mucynie gruczołów podszczękowych owcy [55].

Istnieje przynajmniej sześć typów rdzeni. Najprostsze struktury (G alN A c i G alB (l-3 )-G alN A c) tworzą antygeny T dla grup krwi T n i T [47]. T a stru k tu ra jest rozpoznaw ana przez aglutyninę z orzeszków ziemnych. Najczęściej występują następujące struktury rdzenia: G alB (l-3}-G alN A c (l-0 )-S e r/T h r, G a l B ( l- 3 ) [ G lc N A c B ( l- 6 ) ] - G a lN A c ( l - 0 ) - S e r / T h r , G l c N A c B ( l - 3 ) - - G a l N A c a ( l - 0 ) - S e r / T h r , G l c N A c B ( l - 3 ) - [ G l c N A c B ( l - 6 ) ] - G a l N A c (l-0 )-S e r/T h r. W większości przypadków te czynniki decydują o przynależno ści krwi do odpowiednich grup.

Regiony szkieletu. Ten obszar składa się z serii jednostek G a lB (l-3 )

i G lcN A cB (l-4); budują one antygeny I i M a. Dw om a najczęściej spotyka nymi szkieletami są: G a lB (l-3)-G lcN A c (typ 1) i G a lB (l-4 )-G lc N A c B (l-3 ) (typ 2, grupa krwi I) [57], Struktura typu 2 jest często pow tarzana, podczas gdy typ 1 nigdy się nie pow tarza [58]. S truktura typu 1 i 2 może być rozgałęziona w punktach rozgałęzień B (l-ó ), B (l-3 ) galaktozy; ta struktura jest zasocjowa- na z aktyw nością antygenową I. W m ucynach człowieka antygeny szkieletu są m askow ane przez antygeny grup krwi A, B czy H.

Obszary peryferyczne. Łańcuchy szkieletu są zwykle zakończone przez

a-glikozydowo związaną galaktozę, G alN A c, fukozę, kwas sialowy czy resztę siarczanową. Te peryferyczne cukry determ inują większość cech charakterys tycznych m ucyn jako całości. U dorosłych ekspresja antygenów ABH i Lewisa

(11)

występuje tylko w m ucynach sekrecyjnych. Stwierdzono, że aktyw ność grup krwi H jest także określona przez sekretor (gen-Se) [59], O statnio zasugerow a no, że gen ten także koduje aktywność różną od aktywności H [60], W ostatnich badaniach opisano nowe antygeny związane ze stru ktu rą węg lowodanów. N iektóre z nich są określane w specyficznych stadiach w czasie rozwoju embrionalnego [61, 62]. W kancerogenezie stru k tu ra O-związanych oligosacharydów w obszarach peryferycznych zmienia się; w większości przypadków aktywność grup krwi obecna podczas rozwoju płodowego jest nieobecna w dojrzałych nabłonkach, powraca natom iast podczas kancerogene- zy [63],

M ucyny m ogą zawierać różne ilości siarczanów. Są one w większości przypadków przyłączone do galaktozy, N-acetylogalaktozoam iny i N-acetyloglukozoam iny. Stopień sulfatacji jest ustalony lokalnie: w gruczołach żołądka kom órki wydzielające śluz tracą ich zdolność przyłączania siarczanu do m ucyny podczas w ędrowania z głębszych obszarów zagłębień w kierunku powierzchni [64]. Rola reszt siarczanowych nie jest dotychczas w pełni poznana. Są przesłanki, że sulfonowane mucyny inhibują aktywność peptyczną w żołądku przez wiązanie substratu pepsyny oraz, że reszty siarczanowe decydują o silniejszym przyleganiu mucyn do powierzchni kom órki [65, 66], Inną możliwą rolą reszt siarczanowych w m ucynach może być indukowanie kondensacji w granulach sekrecyjnych [67, 68]. Przez długi czas w ątpiono w obecność N-związanych oligosacharydów w mucynach. Uw ażano również, że nie występuje w nich m annoza. Okazało się, że glikoproteiny żołąd- kowo-jelitowe zawierają śladowe ilości m annozy i glukozy [69], Znaleziono także m annozę w m ucynach gruczołów podszczękowych [70, 71]. O statnio H i l k e n s i B u i j s [72] jasno wykazali, że w nowotworze piersi, M UC1 zawiera kilka N-związanych oligosacharydów. W sekwencji klonowanego genu m ożna znaleźć pięć potencjalnych miejsc wiążących oligosacharydy [42], D e k k e r i wsp. [16, 36], badając biosyntezę m ucyn, wykazali istnienie N-związanych oligosacharydów.

Łańcuchy węglowodanowe m ają swój udział nie tylko w lepkości śluzu, ale również w wewnątrzcząsteczkowych oddziaływaniach, które ułatw iają tw orze nie żelu [73]. Badania konform acji desialowanej i deglikozylowanej m ucyny z gruczołów podszczękowych owcy wykazały, że sztywność łańcucha, będąca efektem glikozylacji, jest spowodow ana oddziaływaniami sterycznymi pom ię dzy peptydow o związanymi resztami N-acetylogalaktozoam iny a przyległymi am inokwasam i [51, 74],

„Sieć” utw orzona z łańcuchów węglowodanów zapewnia doskonałą ochro nę wrażliwym na proteazy obszarom , które są „schow ane” wewnątrz „sieci” i przez to niedostępne dla proteaz. Jedynie końce peptydów „w ystające” z tej sieci m ogą być traw ione przez enzymy proteolityczne.

(12)

STRUKTURA MUCYN I ICH PODJEDNOSTEK

Podstaw ow ą jednostką wydzielanej mucyny (oznaczonej w tym artykule jak o m ucyna oligomeryczna) jest pojedynczy łańcuch polipeptydowy, który składa się z trzech regionów: gęsto glikozylowanego środkowego regionu i dwóch rozciągniętych (N i C końcowych) peptydów. Środkowy region jest bogaty w serynę i treoninę i nie zawiera cysteiny. Najważniejszą cechą funkcjonującej m ucyny jest konieczna relacja pomiędzy tworzeniem żelu i nienaruszeniem m ostków ditiolowych [75]. M akrocząsteczki m ające udział w tych m ostkach były spraw ą dyskusyjną. Jak już w spom niano, A 11 e n i wsp. [1] zaproponow ali model, w którym 4 podjednostki m ucyny są połączone razem przez centralne niemucynowe białko za pom ocą m ostków tiolowych; jest to tzw. m odel w iatraka (rys. 2). Stechiometria dla takiej heterooligome- rycznej struktury nigdy nie była określona. N atom iast obserwacje przy użyciu m ikroskopu elektronowego w preparatach m ucyn oskrzelowych cieniowanych platyną, wykazują, że mucyny zorganizowane są w szyk liniowy. Badania te były potwierdzone dla innych m ucyn sekrecyjnych, takich jak: m ucyny śluzu szyjki macicy i mucyny ze śluzu tchawiczo-oskrzelowego człowieka oraz m ucyny ze śluzu żołądka szczura [22, 76, 77], C a r l s t e d t i S h e e h a n [2] oraz T h o r n t o n i wsp. [26] obszernie badali mucyny z szyjki macicy i tchawiczo-oskrzelowe po kilkukrotnym ich oczyszczeniu oraz po m

odyfika-miejsca wrażliwe na proteolizę

miejsca wrażliwe na redukcję

Rys. 2. Struktura mucyny śluzu żołądkowego (tzw. model „wiatraka”) zaproponowany przez A l l e n a [1] (zmodyfikowany)

(13)

cjach chemicznych przy użyciu m ikroskopii elektronowej. Obecnie uważa się, że większość (jeśli nie wszystkie) wydzielanych m ucyn zorganizow ana jest jak o liniowe hom ooligomery (rys. 3). W przypadku mucyn ze śluzu szyjki macicy i śluzu tchawiczo-oskrzelowego, centralna część mucynowej podjednostki

Rys. 3. Model liniowy oligomerycznej mucyny z szyjki macicy zaproponowany przez C a r l s t e d t a i S h e e h e n a [2] (zmodyfikowany)

składa się z odpornych na proteazy i czułych na proteazy prostych odcinków. W rezultacie trawienia proteolitycznego jednej podjednostki powstaje 3 do 5 tzw. T-dom en odpornych na proteazę. Przy użyciu m ikroskopii elektro nowej, wykazano, że podjednostka m a średnią długość 490 nm, podczas gdy dla dom en T długość ta wynosi 160 nm [19]. Konsekwencją takiej budowy jest występowanie w centralnym obszarze m ucyn tchawiczo-oskrzelowych szyjki macicy sekwencji aminokwasów, w której na przem ian występują odcinki bogate w serynę i treoninę i odcinki „nagiego” peptydu o „norm alnej” sekwencji aminokwasów. M asa cząsteczkowa dla T-dom en wynosi od 0,3 do 0,4 x 106, a dla podjednostek od 2 do 2,5 x 106. Innym ważnym wnioskiem wyciągniętym z tych badań jest to, że podjednostki mucyny są połączone „koniec do końca” tworząc liniową, giętką makrocząsteczkę. Rezultaty D e k k e r a i wsp. [22, 76, 77], którzy badali długość i skład podjednostki m ucyny z żołądka człowieka i szczura są zgodne z danym i C a r l s t e d t a i wsp. [18]; donieśli oni o liniowej podjednostkowej organizacji m ucyn oligomerycznych (rys. 3). Badane oligomery o długości aż do 1000 nm składały się głównie z 3 podjednostek, których średnie długości były podobne do jednej, dwóch czy trzech wielokrotności długości monomerycznej podjednostki. Te rezultaty wskazują, że m onom er jest najmniejszą jednostką w oligomerze mucyny, bowiem długość oligomeru jest wielokrotnością długości m onom eru. W dodatku, oligomery szczura wykazują małe globularne struktury (o średnicy ok. 15 nm) pow tarzające się w regularnych odstępach, które były nieobecne w monomerycznej podjednostce. Średnia odległość pomiędzy globularnymi dom enam i w oligomerze (350 nm) była porównywalna ze średnią długością redukow anego m onom eru (280 nm). Ten rezultat wykazuje strukturę

(14)

globula-rną miejsc wiązania dwóch podjednostek w oligomerach szczura. Z arejestro wane przy użyciu m ikroskopii elektronowej natywne oligomery mucyny żołądka człowieka oraz m onomeryczne podjednostki, otrzym ane po redukcji, wykazują włóknistą strukturę cząsteczek podobną do mucyny szczura, chociaż nie stwierdzono istnienia struktur globularnych w oligomerach człowieka [3, 77]. Obecność więcej niż dwóch m onom erów mucyny w oligomerze wskazuje, że podjednostka zawiera wiążące sekwencje zarów no na N, jak i na C- term inalnych końcach. Ponieważ żadne inne (niemucynowe) białka nie były wykryte w oczyszczonej oligomerycznej mucynie, globularna dom ena w oligo m erach żołądka szczura najpraw dopodobniej reprezentuje strukturę w cząs teczce, k tó ra jest usunięta podczas redukcji. W yraźną różnicą w m ucynie szyjki macicy była nieobecność cząsteczek z dom eną T charakterystyczną zarówno dla m ucyny z żołądka człowieka, jak i szczura. W tych m ucynach w central nym obszarze brak jest degradujących się fragmentów. Obserwacje dokonane przy użyciu m ikroskopu elektronowego są zgodne z badaniam i biosyntezy, które wskazują, że oligomeryczna struktura jest najpraw dopodobniej ukształ tow ana w bardzo wczesnym stadium podczas biosyntezy mucyny. Oprócz m odeli struktury m ucyn przedstawionych przez A l l e n a [1], C a r l s t e d t a i S h e e h a n a [2] istnieje jeszcze jedn a koncepcja struktury śluzu - tzw.

estry cholesterolu

Rys. 4. Model dynamiczny struktury śluzu zaproponowany przez S ł o m i a n e g o i wsp. [3] (zmodyfikowany)

(15)

„model dynamiczny” zaproponow any przez S l o m i a n e g o i wsp. [3] (rys. 4). W m odelu tym podobnie jak w „m odelu w iatraka” przyjmuje się istnienie białka rdzeniowego, do którego przyłączone są za pom ocą m ostków - S - S - podjednostki mucyny. Generalnie ani „model w iatraka” , ani model liniowy nie uwzględniają istnienia lipidów i innych składników obecnych w śluzie.

„M odel dynam iczny” zakłada jednak współdziałanie podjednostek mucyny z innymi kom ponentam i pochodzącymi z obum arłych lub złuszczających się kom órek nabłonka, wydzielin z gruczołów oraz składników z osocza krwi. Te ostatnie dostają się do śluzu w wyniku dyfuzji przez ściany naczyń krw ionoś nych. Należą do nich albuminy, glikoproteiny, lipoproteiny oraz lipidy osocza. W tab. 2 przedstawiono ww. składniki oraz ich pochodzenie.

T a b e l a 2 Składniki śluzu żołądkowego

oraz źródło ich pochodzenia [3]

Źródło pochodzenia Składniki

Gruczoły mucyna

glukoglicerolipidy sekrecyjne IgA

białka wiążące witaminę B ]2 pepsyna

Osocze albumina

glikoproteiny surowicy lipoproteiny surowicy lipidy

Złuszczone komórki glikoproteiny błonowe glikosfingolipidy fosfolipidy proteoglikany

M odel jest interesujący, bowiem uwzględnia obecność i oddziaływania innych składników, które są obecne w śluzie i wg innych koncepcji nie posiadają żadnych określonych funkcji. Śluz wyizolowany z żołądków świni przy użyciu chlorku sodowego (0,155 m ol/L i 2 m ol/L) zawiera stosunkow o dużą zaw artość białek i glikoprotein w porów naniu z ilością czystej m ucyny [78], Nowa koncepcja uwzględnia istnienie licznycn obszarów hydrofilowych i hydrofobowych, z którym i m ogą oddziaływać inne kom ponenty, takie jak białka, a szczególnie lipidy. Rozróżnia się dwa typy oddziaływań między lipidami i glikoproteinam i (mucynami) śluzu: 1) w którym lipidy pozostają

(16)

zasocjowane z glikoproteiną przez siły hydrofobow e i 2) obejmujący kwasy tłuszczowe związane z glikoproteiną wiązaniem kowalencyjnym.

D ane eksperym entalne na tem at topografii lipidów zasocjowanych z poli merem glikoproteiny śluzowej wskazują, że fosfolipidy oddziałują z gliko proteiną przez nieglikozylowane regiony. Oddziaływanie z glikolipidami, neutralnym i lipidami, takimi jak: triglicerydy, cholesterol, estry cholesterylu, obejm uje peryferyczne regiony cząsteczki polimeru glikoproteiny śluzu.

O bszar, w którym zasocjowane lipidy oddziałują z glikoproteiną śluzu jest określony przez ilość oraz rozmieszczenie kowalencyjnie związanych kwasów tłuszczowych. D ane eksperym entalne wskazują, że przynajmniej cztery kow a lencyjnie związane kwasy tłuszczowe są obecne w nieglikozylowanym regionie polim eru glikoproteiny i jeden w pobliżu aminowego końca każdej podjednostki glikoproteiny [1, 79], Wymienione dowody sugerują, że oba typy lipidów odgrywają ważną rolę w utrzym aniu integralności żelu śluzowego żołądka ( 1, 79-81]. W efekcie polimer glikoproteiny śluzu przez jego różnorodne hydrofo bowe i hydrofilowe regiony tworzy dynam iczną ciągłość z innymi składnikam i śluzu (rys. 4). Koncepcja dynamicznej organizacji śluzu żołądka pociąga za sobą integralność i spójność żelu śluzowego. Lepkoelastyczne właściwości m ogą być zakłócone nie tylko przez degradację mucyny, ale także przez zmiany w składzie lipidowym żelu śluzowego. T o jest ważne stwierdzenie, ponieważ do tej pory przeważał pogląd, że inne składniki śluzu niż m ucyna traktow ano jak o zanieczyszczenia, które w małym stopniu brały udział w funkcji żelu śluzowego. N atom iast doniesienia na tem at roli lipidów i białek w funkcjonow aniu śluzu były często kontrowersyjne [1],

BIOSYNTEZA MUCYN

Biogeneza m ucyn zależy od N - i O-glikozylacji. W mucynie żołądka, N-glikozylacja pojaw ia się wcześnie w biogenezie glikoprotein i jest praw dopodobnie niezbędna dla oligomeryzacji i dalszego transportu wzdłuż drogi wydzielania. O-związane glikany są odpowiedzialne za specyficzne oddziaływa nia pomiędzy oligomerami mucyny wewnątrz granul sekrecyjnych i w obrębie żelu na zewnątrz kom órki. Ich obecność warunkuje mucynie odporność na proteazy. W d odatku m ają one znaczący wpływ na konform ację białek. Zarów no N-, jak i O-związane glikany są niezbędne dla tworzenia końcowej funkcjonalnej konform acji oligomerycznych mucyn.

W ydzielane mucyny są wytwarzane przez wyspecjalizowane kom órki nabłonka w śluzówce [82, 83]. K om órki te charakteryzują się obfitym wytwarzaniem glikoprotein śluzu. Szorstkie retikulum endoplazm atyczne jest ogólnie skoncentrowane w podstawowej cytoplazmie kom órek. A p arat

(17)

Gol-giego jest dobrze rozwinięty i charakteryzuje się wysoką aktyw nością glikozylacji potrzebnej do syntezy mucyn. Chociaż morfologiczne cechy kom órek wytwarzających śluz są oczywiste, biosynteza mucyn nie jest częstym przed m iotem badań. Jest to spowodowane brakiem właściwych surowic przeciw m ucynom , potrzebnych do zidentyfikowania licznych biosyntetycznych związ ków pośrednich. Biogeneza mucyn jest złożona, ponieważ obejmuje zarów no N- i O-glikozylację, oligomeryzację białek, wewnątrzkom órkowe gromadzenie oraz nieregulowane, jak i stymulowane wydzielanie.

N- i O-glikozylacja. Rdzenie białkowe m ucyn są syntetyzowane na polirybosom ach w zewnętrznej (cytoplazmatycznej) części szorstkiego retikulum endoplazmatycznego i kotranslacyjnie przenoszone poprzez błonę do wnętrza retikulum endoplazmatycznego. M ucyny zasocjowane z błoną, takie jak: MUC1 i leukosialina, zawie.ają sekwencję am inokwasów hydrofobow ych, któ ra pełni funkcję k ontrolną w przemieszczaniu białek, współdziałając w ten sposób z białkami transbłonow ym i [42].

Większość polipeptydów mucynowych jest N-glikozylowana do glikoproteiny zawierającej duże ilości m annozy (Glc3 M a n g G lcN A c2). Reszty asparaginow e w glikoproteinach są tylko wtedy glikozylowane, jeśli są częścią sekwencji aminokwasowej Asn- X-Ser lub Asn-X- T hr, w której X m oże być każdym aminokwasem z wyjątkiem proliny i kwasu asparaginowego. N-glikozylację wykazano w M U C 1, mucynie żołądka szczura i w mucynie z gruczołów podszczękowych [16, 72, 84]. Po zakończeniu syntezy polipeptydu i N-glikozylacji, m ucyna jest transportow ana do ap aratu Golgiego poprzez transport pęcherzykowy.

Podczas przechodzenia przez pęcherzyki aparatu Golgiego, m ucyny p o d daw ane są ostatecznej glikozylacji. Ogólnie, N-związane glikany wytwarzane są w inny sposób niż mechanizm O-glikozylacji. W środkowych cysternach aparatu Golgiego N-związane glikany bogate w m annozę są przekształcane w „kom pleks” oligosacharydów, w którym zostają usunięte wszystkie trzy cząsteczki glukozy i cztery cząsteczki m annozy. Najpierw reszta (GlcNAc) N-acetyloglukuronow a przyłączona jest do glikanu, potem następuje usunięcie dwóch następnych cząsteczek mannozy. Cały „kom pleks” N-związanych glikanów charakteryzuje się obecnością trzech pozostających reszt m an- nozowych. Sześciosacharyd (G lcN A c3M an 3) jest akceptorem dużej ilości glikozylotransferaz w transcysternach aparatu Golgiego. N-związane glikany m ogą zawierać m onosacharydy związane jeden za drugim. Nie wyjaśnione jest czy wszystkie N-związane glikany w m ucynach wymagają złożonej k o n figuracji. Początek procesu O-glikozylacji glikoprotein jest jeszcze mniej zbadany. Nie wiadomo nic na tem at sekwencji aminokwasów, któ ra występuje w miejscach O-glikozylacji. Powtarzające się sekwencje aminokwasów w róż nych rdzeniach białkowych mucyn, które są miejscem dla O-glikozylacji, nie

(18)

wykazują homologii. Dlatego specyficzność G alN A c-transferaz wobec ich substratów białkowych jest do tej pory nie wyjaśniona.

Jednakże obecność reszt proliny w otoczeniu seryny i treoniny powoduje wystarczająco sztywną konform ację peptydu, k tó ra może zapewniać najlepszy dostęp do G alN A c-transferazy [85, 86]. Istnieją dowody, że przyłączenie G alN A c do seryny i treoniny m oże zachodzić kotranslacyjnie [87], chociaż większość przyłączeń G alN A c jest najpraw dopodobniej procesem posttrans- lacyjnym [88-90]. Większość inicjujących procesów O-glikozylacji mucyny z żołądka szczura zachodzi po oligomeryzacji białka i po opuszczeniu szorstkiego retikulum endoplazmatycznego przez oligomeryzujące prekursory [91]. Przyłączenie G alN A c do seryny i treoniny jest najpraw dopodobniej zlokalizowane w „elem entach przejściowych” retikulum endoplazmatycznego lub w cis-cysternach aparatu Golgiego [91, 88-90]. Początkow a O-glikozylacja m ucyny żołądków szczura nie zależy ani od N-glikozylacji, ani od oligo meryzacji białka [91]. Transferaza G alN A c zaangażow ana w początkow ą O-glikozylację przyłącza dużą liczbę ściśle upakow anych reszt G alN ac do centralnego obszaru białka. W rezultacie, centralny O-glikozylowany obszar polipeptydu w dojrzałej mucynie jest przekształcony w wydłużoną, rozciąg niętą konform ację [51, 74, 92], Po początkowym przyłączeniu reszt G alN A c do reszt am inokwasów hydroksylowych, O-glikozylacja postępuje dalej przez kolejne dodaw anie m onosacharydów przez specyficzną glikozylotransferazę. Prekursory m ucyny są transportow ane do trans-cystern ap aratu Golgiego, gdzie następuje zakończenie syntezy O-związanych glikanów. K olejność przy łączonych cukrów w O-glikozylacji następuje wg określonych reguł, jak donoszą H o u n s l l i F e i z i [93], F e i z i i wsp. [94] oraz S c h a c h t e r i W i 11 i a m s [95]. O-związane oligosacharydy wykazują heterogenność wyni kającą z kilku przyczyn: a) wydłużanie łańcucha jest zależne od ekspresji właściwych glikozylotransferaz, które są specyficzne dla tego typu kom órki; b) przyłączenie m onosacharydu do łańcucha oligosacharydu jest wewnętrznie określone przez właściwości dodanej ostatniej nieredukującej reszty; c) stopień rozgałęzienia, np. dodanie więcej niż jednego cukru do tego m onosacharydu w łańcuchu; d) niektóre glikozylotransferazy współzawodniczą o ten sam oligosacharydowy substrat, zwykle wzajemnie wykluczając swoje działania; e) przyłączenie odpowiedniego m onosacharydu do głównej niekońcowej reszty cukrowej w łańcuchu oligosacharydowym czasami zapobiega jego dalszemu wydłużaniu.

Powiązane ze sobą kom pleksowo zachodzące etapy m ogą kulminować w licznych, różnych oligosacharydach, składających się od 1-20 m o no sacharydów w jednej cząsteczce mucyny [13, 14, 57]. W końcowych etapach syntezy oligosacharydów, przyłączone są różne ilości kwasu sialowego i reszt siarczanowych, dając w efekcie cząsteczkę o dużej heterogenności i ładunku ujemnym [64, 66, 96-98],

(19)

Tworzenie oligomeru. Większość m ucyn sekrecyjnych, takich jak: m ucyny

żołądkowo-jelitowe czy z szyjki macicy, składają się z kowalencyjnie związa nych m onom erów. D la innych mucyn, np. mucyny z gruczołów podszczęko- wych nie jest pewnym czy tworzą one oligomery związane m ostkam i d o łowymi. Transm em branow e mucyny MUC1 i leukosialina nie tw orzą kow alen cyjnie związanych oligomerów [72, 99]. Kowalencyjna oligomeryzacja przez m ostki tiolowe, występująca podczas biosyntezy, została opisana dla m ucyny z żołądka szczura [36]. Dlatego w tej części opisana zostanie biosynteza tej m ucyny (rys. 3). W żołądku szczura są transkrybow ane dwa niezależne informacyjne RN A z dwóch współdominujących genów mucynowych, które ulegają translacji w szorstkim retikulum endoplazmatycznym [16]. D w a m -R N A najpraw dopodobniej jednocześnie ulegają translacji na poliryboso- m ach, ponieważ m onomeryczne prekursory o nieznacznie różnej masie cząs teczkowej są zmieszane podczas oligomeryzacji [36]. T a heterogenność w roz m iarze polipeptydu jest spowodow ana przez współdom inującą ekspresję dwóch genów m ucyny o różnorodnej liczbie powtarzających się sekwencji. Dlatego ta początkow a heterogenność w rozm iarze szkieletu białkowego jest powodem dalszej heterogenności w oligomerycznych m ucynach.

Oligomeryzacja mucyny żołądka szczura nie zaczyna się natychm iast po syntezie białka, ponieważ regiony polipeptydu N- i C-końcowe nie m ają właściwej konform acji do oddziaływań podjednostka-podjednostka. T a p o czątkow a konform acja jest praw dopodobnie stabilizowana przez wewnątrz- cząsteczkowe m ostki ditiolowe, co sugerowano dla innych białek, takich jak np. receptor antygenowy kom órek T, grupy H, A i białko VSV G [100, 101]. Właściwa konform acja białka jest powoli uzyskiwana przez „zaginanie” peryferycznych części polipeptydu. Podczas ponownego zaginania, m ostki ditiolowe są praw dopodobnie przeorganizowywane przez enzym - izomerazę tiolową, białko zatrzymywane w retikulum endoplazmatycznym.

Obecność N-związanych oligosacharydów współtranslacyjnie dodaw anych do polipeptydu jest niezbędna dla wydajnej oligomeryzacji w retikulum endoplazmatycznym prekursorów mucyny z żołądka szczura [36]. Te glikany praw dopodobnie ułatwiają tworzenie trzeciorzędowej struktury peryferycz- nego regionu polipeptydu korzystnego dla oddziaływań wewnątrzcząstecz- kowych, jak było sugerowane dla innych białek [100, 101]. Po wytworzeniu tej struktury praw dopodobnie jest ustalone specyficzne rozpoznanie pomiędzy peryferycznymi regionami polipeptydu dwóch przyległych cząstek prekursora. N astępuje wtedy tworzenie wewnątrzcząsteczkowych m ostków ditiolowych. W nieobecności N-związanych glikanów ta trzeciorzędowa konform acja byłaby osiągana bardzo wolno, a oligomeryzacja prekursorów m ucyny żołąd ka szczura i ich następny transport do aparatu Golgiego byłby poważnie opóźniony [36]. W szorstkim retikulum endoplazmatycznym dimery nie są przekształcane w większe oligomery, a prekursory oligomerów są tran sp o r

(20)

tow ane do aparatu Golgicgo w identycznym stopniu [36], Proces oligomeryzacji poprzedza transport do aparatu Golgiego, ponieważ nie obser wowano transportu monomerycznych prekursorów do ap aratu Golgiego [22, 36, 76, 102]. Obecnie nie wiadomo, jakie istnieją różnice w funkcji pomiędzy dim eram i, trim eram i i wyższymi oligomerami. N atom iast w iadom o, że k o ń cowy rozm iar oligomerycznej mucyny jest określony w retikulum endoplaz- m atycznym przez odpowiednią liczbę m onom erów powiązanych koniec z k o ń cem. Obecność wewnątrzcząsteczkowych m ostków ditiolowych jest pierwszo planowym czynnikiem w tworzeniu żelu. Oczywistym jest, że proces ich ponownego rozpadu i tworzenia przez tiolowe białkowe izomerazy musi być w wysokim stopniu regulowany, aby zapewnić końcow ą jakość mucyny.

Wewnątrzkomórkowy rozdział i transport mucyn. Większość aspektów

w biosyntezie m ucyn, transport poprzez kom órkę podczas i po biosyntezie m ucyn jest ciągle szerokim i nie wyeksploatowanym polem badania. Ten transp o rt charakteryzuje się dwiema głównymi cechami: 1) mucyny są wydzielane w wierzchołkowej części kom órki i są transportow ane; 2) mucyny sekrecyjne tworzące żel są zbierane i przechowywane w granulach przed sekrecją. Po zakończeniu biosyntezy mucyny są dzielone w retikulum endoplazm atycznym aparatu Golgiego i kierowane do granul sekrecyjnych. N astęp nie są transportow ane w stronę powierzchniowej części kom órki i ostatecznie tw orzą fuzję z górną powierzchnią błony plazmatycznej [13]. M ucyny trans- m em branow e nie są przechowywane wewnątrz kom órki i są przypuszczalnie natychm iast po syntezie bezpośrednio transportow ane do powierzchni błony cytoplazm atycznej. Dlatego tran sp ort m ucyn przez kom órki jest częściowo identyczny z ogólną drogą transpo rtu wydzielanych białek i białek m em b ranow ych, a częściowo specyficzny dla mucyn. Sygnał dla transpo rtu mucyny żołądka szczura z retikulum endoplazmatycznego do ap aratu Golgiego jest umiejscowiony najpraw dopodobniej w konform acji właściwie zgiętego polipeptydu, a nie w strukturze cukru [36], Ponieważ konfiguracja N-związanych glikanów jest nieznacząca do transportu i O-glikozylacja jest rozpoczęta tylko po oligomeryzacji prekursora; glikany nie m ają udziału w sygnale dla transportu.

Ogólnie uważa się, że nowo syntetyzowane „niewłaściwie pozaginane” białka są zatrzymywane w retikulum endoplazmatycznym przez wiązanie do białka, które rozpoznaje jego konform ację. W ykazano, że to białko wiąże różnorodne „niewłaściwie zagięte” białka sekrecyjne oraz białka błonowe w retikulum endoplazmatycznym, natom iast nie obserwowano wiązania bia łek, które uzyskiwały konform ację funkcjonalną [103-106]. Z a pom ocą podobnego mechanizm u zatrzymywany jest w retikulum endoplazm atycznym prekursor mucyny z żołądka szczura. Po zakończeniu biosyntezy w aparacie Golgiego mucyny są kierowane do w akuol kondensujących, które są utw orzo

(21)

ne w cysternach Golgicgo. D uża liczba nagrom adzonych granul jest bardzo ściśle upakow ana przy powierzchni błony plazmatycznej. Uważa się, że m olekularny sygnał dla gromadzenia wydzielanych białek jest zakodow any wewnątrz pierwszorzędowej struktury białek. M ucyny posiadają dość znaczny ładunek ujemny. Panuje pogląd, że wiążą one dość dużą ilość w apnia, który znaleziono w granulach m ucyn [68, 107-109]. Stwierdzono, że sulfonowanie m ucyn praw dopodobnie nie m a wpływu n a przechowywanie i wydzielanie, bowiem niesulfonowana m ucyna z żołądka szczura jest grom adzona i wy dzielana in vitro w tym samym stopniu jak m ucyna sulfonowana [16]. Podział m ucyn związanych z błoną jest praw dopodobnie zaprogram ow any w biał kowej części obecnej w cytoplazmie. Cytoplazmatyczne sekwencje białek zawierają informację, k tó ra określa ich dystrybucję do pewnych organów lub do pewnych dom en błon plazmatycznych. Lizosomalne białka błon m ają układ Gly i T yr w ich ogonach, który jest ważny dla ich grom adzenia w lizosomach [29], Obecność jednej lub więcej reszt tyrozyny w receptorach powierzch niowych kom órki jest decydująca dla ich endocytozy. W edług tego poglądu aminokwasowe reszty zawierające tyrozynę są rozpoznawane przez wyspec jalizow any zbiór białek obecnych w specyficznych zagłębieniach w błonach

plazm atycznych i aparacie Golgiego. To rozpoznanie jest zasadnicze dla białek poddanych endocytozie.

Egzocytoza wydzielanych m ucyn tworzących żel zachodzi przez fuzję błony otaczającej przechowywaną w granulach mucynę z błoną plazm atyczną. Wydzielanie może być stymulowane bardzo szybko w w arunkach, kiedy nabłonek potrzebuje dodatkow ej ochrony. W ydzielanie śluzu jest praw dopo dobnie pod kontrolą zarów no nerwową, jak i horm onalną [13]. W w arunkach eksperym entalnych in vitro, podstawowe wydzielanie jest zasadniczo niskie [110-111]. Egzocytoza jest procesem zależnym od energii, występująca w spe cyficznych miejscach błony plazmatycznej. Błona ograniczająca granule śluzu jest przeniesiona w bardzo bliski kon takt z powierzchnią błony plazmatycznej, gdzie tw orzą się tzw. pory fuzji [112]. Pory składają się praw dopodobnie ze specyficznych białek obecnych w błonie granul [112]. Po uzyskaniu odpow ied niej informacji białka te reagują z błoną plazm atyczną tworząc pory przez obie błony do zewnątrzkomórkowej przestrzeni. Jednym z sygnałów włączonych w ten proces jest wzrost stężenia C a2+ w cytoplazmie. Zauw ażono, że uwalnianie C a2+ było obserwowane przed uwolnieniem m ucyn z granul śluzu u ślim aka Ariolimax columbianus [68]. Ponieważ granule śluzu zawierają zazwyczaj wysokie stężenia C a2 + , uwalnianie wapnia z granul mucynowych m oże urucham iać tworzenie por fuzyjnych. Po utworzeniu p or fuzyjnych dla egzocytozy, wysoko stężona m ucyna jest gwałtownie (w ciągu milisekund) uw alniana zajmując od 400 do 600 razy większą niż pierw otna objętość [68, 113], Ekspansja śluzu jest zainicjowana przez utratę jonów wapnia z granul, podczas gdy polianionow a m ucyna traci osłaniające kationy [113]. W zrost

(22)

objętości m ucyn podczas egzocytozy jest praw dopodobnie stym ulowany przez elektrostatyczną repulsację pomiędzy ujemnie naładow anym i cząsteczkami a hydrofilow ą n atu rą oligosacharydów [113]. Ujemny ładunek cząsteczek w połączeniu z niskim stężeniem kationów częściowo determ inuje lepkość zewnątrzkom órkowego żelu śluzowego. W obecności kationów , ujemnie naładow ane cząsteczki mucyny w żelu śluzowym ulegają kondensacji usuwając częściowo wodę, regulując w ten sposób wiskoelastyczne właściwości żelu. Zwiększona zawartość siarczanów i kwasu sialowego w m ucynach jest skorelow ana ze zwiększoną lepkością żelu mucynowego [114]. Ładunek ujemny, pochodzący od kwasu sialowego i reszt siarczanowyh, działa inicjują- co na kom pleksowanie m ucyn z wapniem podczas ich przechowywania. N astępnie podczas uwalniania wapnia w trakcie egzocytozy, ładunek jest odpowiedzialny za gwałtowną ekspansję m ucyn do tworzenia silnie uwodnio- • nego żelu. Ostatecznie, ładunek częściowo determinuje reologiczne właściwości żelu śluzowego przez elektrostatyczne interakcje z niskim stężeniem kationów.

FUNKCJE MUCYN ZWIĄZANYCH Z BŁONĄ KOMÓRKOWĄ

M ucyny związane z m em braną m ogą wykazywać ochronną rolę porów nywalną do m ucyn sekrecyjnych. Większość, jeśli nie wszystkie kom órki nabłonka m ają niskie stężenie glikoprotein podobnych do m ucyny, takich jak M UC1 w zewnętrznej części błony [115, 116]. M im o że nie są one kowalencyj nie powiązane w homooligomery, jak sekrecyjne mucyny, m ogą one służyć jak o ostatnia bariera ochronna przeciw czynnikom zewnętrznego środowiska, takim jak niskie pH czy enzymy hydrolityczne. Łańcuch polipeptydow y M UC1 posiada masę cząsteczkową pomiędzy 120 000 a 300 000, w którym ok. 25% wszystkich am inokwasów stanowi seryna i treonina [41]. Jeśli wszystkie hydroksyam inokw asy zawierają O-związane oligosacharydy, czego m ożna się spodziewać na podstawie m as cząsteczkowych dojrzałych m ucyn związanych z błoną, praw dopodobnie posiadają tak ą sam ą sztywność jak m ucyny sekrecyj ne. T ak a cząsteczka glikoproteiny m a długość ok. 150 nm i ustaw iona prostopadle do powierzchni błony zachowuje się jak sztywny pręt (rys. 5). Jeśli z błoną związana jest dostateczna ilość takich glikoprotein, będą one oczywiście osłaniać niektóre antygeny powierzchniowe kom órki lub/i miejsca wiążące receptorów dla ligandów o wysokiej masie cząsteczkowej. Ponieważ zewnętrzna powierzchnia większości kom órek nabłonka pełni funkcję absorp cyjną, m ożna przypuszczać, że w norm alnych kom órkach mucyny związane z błoną m ogą pełnić ważną funkcję osłaniającą kom órkę przed środowiskiem.

O statnio wykazano, że oczyszczona m ucyna MUC1 inhibuje cytotoksyczne działanie eozynofili na kom órki narażone na ich działanie [117], T a inhibicja

(23)

Bwieiswuwi)

aw o b ią iZ

enXfiT89ini; siiaid

Rys. 5. Model mucyny związanej z błonną wg S t r o u s a i D e k k e r a [4] (zmodyfikowany)

jest spow odow ana specyficznym oddziaływaniem między tą m ucyną a skład nikiem cytotoksycznej, eozynofilnej powierzchni. To może wyjaśniać niezdol ność cytotoksycznych kom órek do unieczynnianta nowotworowych kom órek nabłonka, ponieważ te ostatnie posiadają nadm ierną ilość m ucyn na ich powierzchni. Z drugiej strony, norm alna zawartość m ucyn M UC1 w błonie plazmatycznej nabłonka m oże służyć do ochrony tych kom órek przeciw uszkodzeniom spowodowanym przez kom órki zainfekowane.

Wiele kom órek nabłonka, np. jelita cienkiego lub jam y ustnej funkcjonuje nie tylko jak o linia obronna, ale również uczestniczy w procesach selektyw nego pobierania i wiązania. Cząsteczkami odpowiedzialnymi za te ostatnie procesy są enzymy związane z błoną lub receptoram i (jak w kubkach smakowych języka) z ich aktywnym centrum tuż przy błonie. M ożna przypuszczać, że na powierzchni kom órek nabłonka m ogą występować warstwy odpowiedzialne za różne procesy zachodzące w obrębie błony: 1) glikoproteiny zanurzone w błonie, fragmenty transm em branow e m ogą pełnić rolę kanałów transportow ych dla innych cząsteczek, np. substancji odżyw czych; 2) od 100-150

A

powyżej błony kom órkowej umieszczone są enzymy

(24)

i receptory; 3) powyżej 150

A

mucyny ochronne związane z błoną. Zdolność kom órek nabłonka do kontaktow ania się ze środowiskiem może być regulowa na przez ilość m ucyn związanych z błoną; przy dużej ilości m ucyn dostępność do receptorów i enzymów błony m oże być ograniczona lub ham ow ana.

ŚLUZ W STANACH CHOROBOWYCH

Wiele chorób m a wpływ na wydzielanie śluzu. W licznych przypadkach chorobow ych obserwuje się zmiany charakterystyki biochemicznej mucyn, w innych przypadkach różne m ogą być ilości i właściwości wydzielanego śluzu. Czasami oba efekty pojawiają się jednocześnie. Właściwości śluzu in vivo zostały szerzej opisane w poprzednich rozdziałach. Struktura wydzielonego śluzu zależy również od jonowego środowiska i obecności innych niemucynowych składników. Kiedy bada się śluz w powiązaniu z chorobą, określa się tylko kilka z wielu czynników charakterystycznych dla śluzu, m ucyny i niemucynowe składniki. Chociaż właściwości i ilość produkow anego śluzu jest oczywiście bardzo ważna, konsekwencją wielu chorób m ogą być często przyczyny pierwotne.

W przypadku chorób wrzodowych żołądka próbow ano określić stosunek węglowodanów w glikoproteinie i porów nać go z ich ilością u osób zdrowych [118, 19, 120]. Otrzym ane rezultaty były często sprzeczne ze sobą albo w ogóle nie wykazywano różnic w stosunku węglowodanów. Znaleziono natom iast mniejszą ilość kwasu sialowego w soku żołądkowym u pacjentów z chorobą wrzodową żołądka w porów naniu z grupą kontrolną [121]. Dość nieoczekiwa nym rezultatem było stwierdzenie większej zawartości glikoprotein w soku żołądkowym grupy kontrolnej w porów naniu z grupą pacjentów z chorobą w rzodową żołądka [122].

W wielu chorobach żołądka pojaw ia się dezintegracja żelu śluzowego, proces ten był przypisywany wzmożonej aktywności pepsyny [123]. Nowsze badania wykazały, że infekcja spow odow ana przez Helicobacter pylori m oże być odpowiedzialna za osłabienie spójności żelu śluzowego. O statnie rezultaty sugerują, że Helicobacter pylori „przyczepiona” do powierzchni śluzu wydziela na zewnątrz proteazy i lipazy zdolne do degradow ania lipidów i glikoprotein żelu śluzowego [124],

Wiele leków, takich jak: pochodne acetylocholiny czy karbacholu, pow o duje wzrost grubości żelu śluzowego w żołądku psa i szczura [125, 126], A tropina znosiła działanie karbacholu [127].

Jelitowe kom órki nabłonka, w tym kom órki kubkowe są wyraźnie wrażliwe na acetylocholinę i jej analogi. Przeciwnie, kom órki kubkowe kosm ka i kom órki z jelita grubego wytwarzające śluz nie są wrażliwe na pochodne acetylocholiny. N atom iast c-AM P indukuje wydzielanie śluzu

(25)

z kom órek w tchawicy. Prostaglandyny odgrywają istotną rolę w gwałtownym wzroście wydzielania śluzu. Podwyższone wydzielanie m ucyn obserwowano w tchawicy, żołądku i woreczku żółciowym po dodaniu P G E 2 (prostaglandy- na E 2). N atom iast indom etacyna czy aspiryna, które są związkami in- hibującymi cyklooksygenazę, enzym przekształcający kwas arachidonow y w odpowiednie nadtlenki, powodowały spadek wydzielania m ucyn [125, 128-131],

W zwłóknieniu torbielow atym (cystic fibrosis) występują obok charakterys tycznych zmian w budowie mucyny dodatkow o zmiany w Teologicznych właściwościach śluzu. Obserwuje się wzrost jego gęstości oraz wyższe stopnie całkowitej glikozylacji, której towarzyszy wyższa zawartość fukozy, galaktozy, N-acetylo-galaktozoam iny i reszt siarczanowych w cząsteczce m ucyny. Te zmiany występują stale w mucynach jelita i smółki (meconium) [132-134], O statnio doniesiono, że zwłóknienie torbielowate jest spowodowane defektem białka błonowego uczestniczącego w aktywnym transporcie jonów Cl- . W ydaje się, że najpoważniejszą konsekwencją w zwłóknieniu torbielow atym są reologiczne właściwości śluzu, spowodowane zmianami w jonowym środow is ku na powierzchni nabłonka. Zm iany w składzie cukrowym m ucyny są praw dopodobnie efektem wtórnym.

W nowotworach złośliwych, wydzielane mucyny żołądkowo-jelitowe czy oskrzelowe ulegają dużym zmianom w nieredukujących końcach O-związa- nych oligosacharydów. Te zmiany m ogą być łatwo wykryte przy użyciu lektyn lub m onoklonalnych przeciwciał. Znaczenie tych bardzo ważnych aspektów regulacji syntezy m ucyn jest opisane przez Z o t t e r a i wsp. [115]. W jelicie denkiem i grubym efekty licznych zmian patologicznych w składzie i jakości m ucyn nie są dotychczas poznane. W chorobach nowotworowych żołądka (adenocarcinoma), we wrzodowym zapaleniu okrężnicy i w chorobie C rohna wydzielane są mucyny o wyższej zawartości siarczanów i mniejszej zawartości kwasu sialowego [135]. Dotychczas nie jest poznane czy te efekty są bezpośred nio związane z uszkodzeniam i genomu, czy z przyczynami wtórnymi. Liczne doniesienia wykazują zmiany w histochemicznym barwieniu w chorobie C rohna i we wrzodziejącym zapaleniu okrężnicy [135], D odatkow o zmiany w składzie cukrowym są konsekwencją wzrostu sialomucyn w stosunku do sulfomucyn, zmieniona jest O-acylacja kwasu sialowego, obserwuje się o b niżenie zawartości fukozy i zwiększone „odsłonięcie” cząsteczek galaktozy [136, 137], Ponieważ przyczyny tych zmian są niejasne, trudno jest sklasyfiko wać te obserwacje. Praktycznie stan warstwy śluzu jest rezultatem dynamicznej równowagi pomiędzy syntezą a degradacją. Ilościowa analiza m ucyn wyizolo wanych z chorych tkanek jest tylko jednym z wielu param etrów . Szacowanie np. roli, jak ą odgrywają bakterie w składzie i jakości m ucyn jest tru d n a do ustalenia w takim środowisku. Istnieją pewne przesłanki, że m ucyny m ają również udział w tworzeniu kamieni żółciowych. Chociaż tworzenie kamieni