Widok Liniowe plazmidy bakteryjne

M

£

Zak³ad Biochemii Drobnoustrojów Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Pawiñskiego 5A, 02-106 Warszawa e-mail: lobocka@ibb.waw.pl

LINIOWE PLAZMIDY BAKTERYJNE

WPROWADZENIE

Problem replikacji 3’ koñców liniowych cz¹steczek DNA wynika z w³aœciwoœci po-wszechnie wystêpuj¹cych polimeraz replika-cyjnych. Zapocz¹tkowanie przez nie syntezy nowego ³añcucha DNA na starej matrycy nie odbywa siê samoistnie, a poprzez do³¹czenie deoksyrybonukleotydu do grupy OH na 3’ ko-ñcu tzw. primera, najczêœciej krótkiego RNA komplementarnego do poprzedzaj¹cego start replikacji rejonu matrycy. Dlatego replikacja li-niowego DNA przez polimerazê prowadzi do skracania koñców 5’ nowo syntetyzowanych nici w ka¿dej rundzie. W chromosomach orga-nizmów eukariotycznych problem replikacji koñców zosta³ rozwi¹zany przez ich wyd³u¿anie o setki kopii identycznych frag-mentów DNA, z udzia³em enzymu telomerazy. W wiêkszoœci chromosomów i plazmidów bak-teryjnych prostym ominiêciem tego problemu okaza³a siê cyrkularyzacja cz¹steczek DNA. Jeszcze do niedawna koliste cz¹steczki DNA uznawano za atrybut organizmów prokario-tycznych. Dopiero badania ostatnich kilkuna-stu lat doprowadzi³y do wykrycia liniowych form DNA u bakterii.

Liniowe plazmidy zidentyfikowano u bak-terii Gram-dodatnich z rodzaju Streptomyces, Rhodococcus, Mycobacterium, Clavibacter, Lactobacillus oraz u bakterii Gram-ujemnych z rodzaju Borrelia, Xantobacter, Klebsiella (ROUSSEL i wspó³aut. 1993, NETOLITZKY i wspó³aut. 1995, PICARDEAU i VINCENT 1997, BERGERON i wspó³aut. 1998, PALMER i

wspó³aut. 2000, UZ i wspó³aut. 2000, RAVEL i wspó³aut. 2000, KRUM i ENSIGN 2001, GOETHALS i wspó³aut. 2001, SHIMIZU i wspó³aut. 2001, BROWNK i wspó³aut. 2002, PANGi wspó³aut. 2002). Czêsto warunkuj¹ one lekoopornoœæ lub infekcyjnoœæ patogennych szczepów bakteryjnych (MEINHARDT i wspó³aut. 1997, RAVELi wspó³aut. 1998). Wiele z nich to megaplazmidy, koduj¹ce enzymy ca³ych szlaków metabolicznych zwi¹zanych z wykorzystaniem okreœlonych zwi¹zków (SVEKI i wspó³aut. 1999). Niektóre oprócz funkcji plazmidowych koduj¹ funkcje fagowe. Profag bakteriofaga N15 Escherichia coli, po-pularnej pa³eczki okrê¿nicy, wystêpuje w ko-mórkach tej bakterii w formie liniowego pla-zmidu (RYBCHIN i SVARCHEVSKY 1999).

Z ponad piêædziesiêciu zsekwencjonowa-nych do tej pory chromosomów bakteryjzsekwencjonowa-nych kilka ma strukturê liniowych cz¹steczek DNA. Liniowe chromosomy s¹ charakterystyczne dla bakterii z rodzaju Saccharopolyspora, Strepto-myces, Borrelia i prawdopodobnie Coxiella (VOLFF i ALTENBUCHNER 2000, WILLEMS i wspó³aut. 1998). U patogennego dla roœlin szczepu C58 Agrobacterium tumefaciens je-den liniowy i jeden kolisty chromosom sk³adaj¹ siê na ca³oœæ genomu (GOODNER i wspó³aut. 2001). Przypuszczalnie liniowe chromosomy bakteryjne powsta³y z kolistych chromosomów na skutek ich rekombinacji z li-niowymi plazmidami. U bakterii z rodzaju Streptomyces i Borrelia liniowe chromosomy

Numer 3

(256)

wspó³istniej¹ z liniowymi plazmidami o struk-turze i, czêsto, sekwencji koñców podobnej do struktury i sekwencji koñców chromosomów

ich bakteryjnego gospodarza (CASJENS i wspó³aut. 1997, BEYi wspó³aut. 2000, CASJENSi wspó³aut. 2000, SPATZ i wspó³aut. 2002). Wewn¹trz komórki liniowe replikony drog¹ rekombinacji mog¹ wymieniaæ siê koñcami (PIZA i wspó³aut. 1998).

Zaobserwowano dwa typy liniowych pla-zmidów i chromosomów bakteryjnych ró¿-ni¹ce siê struktur¹ koñców, zwanych

proka-riotycznymi telomerami (Ryc. 1; KOBRYN i CHACONAS 2001). Bardziej liczny tworz¹ cz¹steczki o koñcach 5’ zwi¹zanych z

bia³kiem, mniej liczny — cz¹steczki o kowalen-cyjnie zamkniêtych koñcach, przypomi-naj¹cych strukturê szpilki do w³osów. W obu typach cz¹steczek sekwencja jednego koñca powtarza siê w odwrotnej orientacji na prze-ciwleg³ym koñcu, a utworzone w ten sposób rejony koñcowych odwróconych powtórzeñ (ang. terminal inverted repeat, TIR), mog¹ byæ ró¿nej d³ugoœci.

WYSTÊPOWANIE I ZNACZENIE LINIOWYCH PLAZMIDÓW

Badania nad liniowymi plazmidami prowa-dzone s¹ g³ównie w zwi¹zku z ich mechani-zmem replikacji, wystêpowaniem w szczepach bakterii o szczególnym znaczeniu dla cz³owie-ka, a tak¿e u¿ytecznymi lub zwi¹zanymi z pato-gennoœci¹ cechami fenotypu. U bakterii Gram-dodatnich najwiêcej liniowych plazmidów wy-izolowano z bakterii rodzaju Streptomyces, Rhodococus i Mycobacterium. Wszystkie one nale¿¹ do rzêdu promieniowców, Actinomyce-tes, obejmuj¹cego szereg wolno¿yj¹cych bakte-rii glebowych i liczne patogeny.

Szczególnie u¿yteczne dla cz³owieka s¹ bak-terie rodzaju Streptomyces, kojarzone z ziemi-stym zapachem lasów. Wytwarzaj¹ one ponad 60% antybiotyków produkowanych przez przemys³ farmaceutyczny. Nosicielami niektó-rych genów zwi¹zanych z syntez¹ antybioty-ków przez szczepy Streptomyces s¹ liniowe plazmidy. Na przyk³ad, synteza metylomycyny przez S. coelicolor, aktynomycyny D przez

S. parvulus i chloramfenikolu przez S. venezu-elae zale¿y od obecnoœci w komórkach tych szczepów olbrzymich, licz¹cych odpowiednio 350, 520 i 130 tysiêcy par zasad (tpz) d³ugoœci liniowych plazmidów (MEINHARDTi wspó³aut. 1997).

Rodzaj Rhodococcus skupia szereg bakterii patogennych dla roœlin, a tak¿e bakterie zdolne do degradacji ksenobiotyków (ang. xenobio-tics) — zwi¹zków typu pestycydów, sk³adni-ków zanieczyszczeñ przemys³owych czy le-ków, nie wystêpuj¹cych normalnie w naturze, ale obecnych w naszym œrodowisku. R. fa-scians infekuje najró¿niejsze gatunki roœlin za-pocz¹tkowuj¹c tworzenie siê tzw. galasów, charakterystycznych wyroœli na liœciach. Gala-sy tworz¹ w roœlinie centra o specyficznych w³aœciwoœciach metabolicznych, szczególnie korzystnych dla ¿ycia R. fascians. Geny zwi¹zane z tworzeniem galasów znajduj¹ siê na du¿ym, licz¹cym 200 tpz d³ugoœci, liniowym

A

TIR

TP

B

TIR

Ryc. 1. Struktura liniowych plazmidów bakteryjnych.

(A) Struktura plazmidów o koñcach 5’ kowalencyjnie zwi¹zanych z bia³kiem. Rejony koñcowych odwróconyh powtórzeñ podobnych sekwencji (TIR) oznaczono strza³kami. Bia³ka kowalencyjnie zwi¹zane z koñcami 5’ nici DNA (TP) oznaczono czarnymi kropkami. (B) Struktura plazmidów o kowalencyjnie zamkniêtych koñcach (wg HINNEBUSHAi TILLY1993).

plazmidzie (MEINHARDT i wspó³aut. 1997, GOETHALSi wspó³aut. 2001). Wszystkie badane dot¹d wirulentne szczepy R. fascians zawiera³y podobne plazmidy.

Zdolnoœæ szczepu BD2 R. opacus do degra-dacji izopropylobenzenu i dichloroetenu zale-¿y od obecnoœci w jego komórkach licz¹cego 210 tpz d³ugoœci liniowego plazmidu (DABROCK i wspó³aut. 1994, KESSELER i wspó³aut. 1996). Szczep B-276 R. corallinus zdolny do utleniania trójchloroetenu (TCE) za-wiera a¿ cztery liniowe plazmidy (SVEKI i wspó³aut. 1999). Gen koduj¹cy enzym mono-oksygenazê alkenów, niezbêdny do utleniania TCE, znajduje siê na jednym z tych plazmidów. Inny szczep Rhodococus sp., RHA1, ma zdol-noœæ do degradacji polichlorodwufenyli, tzw. PCB (ang. polichlorynated biphenyl) stano-wi¹cych jedno z bardziej toksycznych zanie-czyszczeñ œrodowiska. Proces degradacji prze-biega przez szereg etapów poœrednich zwi¹za-nych z aktywnoœci¹ ponad dwudziestu enzy-mów. Z trzech liniowych plazmidów obecnych w komórkach RHA1 dwa najwiêksze, pRHL1 (1100 tpz ) i pRHL2 (390 tpz) koduj¹ po szeœæ enzymów uczestnicz¹cych w procesie degra-dacji (FUKUDA i wspó³aut. 1998, MASAI i wspó³aut. 1997).

Niektóre szczepy R. opacus s¹ chemolito-autotrofami. Mog¹ wykorzystywaæ dwutlenek wêgla i wodór w postaci gazowej jako jedyne Ÿród³o wêgla i energii. W³aœciwoœæ tê zawdziê-czaj¹ liniowym plazmidom obecnym w ich ko-mórkach. Dot¹d scharakteryzowano kilka ta-kich plazmidów, pHG201, pHG205 i pHG207, o d³ugoœci odpowiednio 270, 280 i 225 tpz (KALKUS i wspó³aut. 1993). Jeden z nich, pHG207, naby³ wysok¹ zdolnoœæ koniugacyj-nego transferu do innych szczepów R. opacus poprzez rekombinacjê swojego protoplasty, pHG205, z innym plazmidem koniugacyjnym.

Rodzaj Mycobacterium grupuje zarówno bakterie wolno¿yj¹ce, jak i patogenne. Z blisko spokrewnionych ze sob¹, powszechnie wystê-puj¹cych w œrodowisku szczepów M. avium i M. xenopi, M. brieri i M. celatum wyizolowano kilkanaœcie liniowych plazmidów o d³ugo-œciach od 20 do 320 tpz (PICARDEAUi VINCENT

1997, 1998). Okreœlenie funkcji kodowanych przez liniowe plazmidy rodzaju Mycobacte-rium okaza³o siê trudne ze wzglêdu na wysok¹ stabilnoœæ tych plazmidów. Nieliczne udane próby pozbycia siê ich z komórek wskazuj¹, ¿e ¿aden nie jest niezbêdny dla ¿ycia bakterii. Nie wiadomo czy posiadanie któregoœ z liniowych

plazmidów przez mykobakterie wi¹¿e siê z wi-rulencj¹ lub nabyciem innych korzystnych cech. Analiza kompletnej sekwencji nukleoty-dowej plazmidu pCLP M. celatum (23 tpz), po-zwoli³a na identyfikacjê genów zwi¹zanych z replikacj¹ i stabiln¹ segregacj¹ tego plazmidu oraz mobilnych elementów genetycznych (LE

DANTECi wspó³aut. 2001). Niektóre geny pla-zmidu pCLP s¹ homologami chromosomal-nych genów M. tuberculosis, co wskazuje na transfer informacji genetycznej pomiêdzy li-niowymi i kolistymi formami DNA w obrêbie rodzaju Mycobacterium. Potwierdzeniem tego typu transferu jest organizacja genetyczna pla-zmidu pCLP, która, z wyj¹tkiem liniowych ko-ñców, jest typowa dla kolistych plazmidów.

Powszechne wystêpowanie liniowych pla-zmidów u bakterii Gram-ujemnych wydaje siê byæ ograniczone do krêtków rodzaju Borrelia. Wielu przedstawicieli tego rodzaju to groŸne patogeny cz³owieka i zwierz¹t. Do najlepiej znanych nale¿¹ B. burgdorferi, powoduj¹ca chorobê zwan¹ borrelioz¹ (ang. Lyme disease), oraz B. hermsi i B. duttoni, powoduj¹ce gor¹czkê powrotn¹. Wszystkie gatunki Borre-lia, oprócz licz¹cego oko³o 0,9 –1 mln par za-sad liniowego chromosomu, posiadaj¹ liczne li-niowe i koliste plazmidy. U infekcyjnego dla cz³owieka szczepu B. burgdorferi wykryto a¿ dziewiêc kolistych i dwanaœcie liniowych pla-zmidów — najwiêksz¹ znan¹ liczbê pozachro-mosomalnych elementów genetycznych mog¹cych wspó³istnieæ w jednej bakterii (CASJENS i wspó³aut. 2000). Z infekcyjnego szczepy Ly B. duttoni równie¿ wyizolowano dwanaœcie liniowych plazmidów ró¿ni¹cych siê wielkoœci¹ od 11 do 200 tpz (TAKAHASHIi wspó³aut. 2000). Wszystkie wyizolowane z na-turalnych œrodowisk szczepy Borrelia charak-teryzuje obecnoœæ licznych liniowych plazmi-dów. Na ogó³ wystêpuj¹ one w liczbie kopii po-dobnej do liczby kopii chromosomu. Utrata wiêkszoœci z nich nie pogarsza zdolnoœci bakte-rii do wzrostu w po¿ywkach laboratoryjnych, czêsto natomiast idzie w parze z utrat¹ infek-cyjnoœci dla tych ssaków, dla których bakterie te s¹ normalnie patogenne. Niektórych plazmi-dów nie zdo³ano usun¹æ z komórek. Mo¿liwe, ¿e s¹ one mini-chromosomami koduj¹cymi wi-talne funkcje.

Znacz¹ca frakcja DNA liniowych plazmi-dów Borrelia jest w stanie intensywnych prze-mian ewolucyjnych (CASJENS i wspó³aut. 2000). Œwiadcz¹ o tym œlady licznych, czasami bardzo niedawnych procesów wymiany DNA

pomiêdzy poszczególnymi plazmidami. Na przyk³ad, liniowy plazmid lp56 B. burgdorferii zawiera kopiê plazmidu podobnego do koliste-go plazmidu cp32, co wskazuje, ¿e powsta³ on z integracji przodka cp32 do genomu liniowego plazmidu. Plazmid lp54 zawiera dziewiêæ d³ugich rejonów homologii z plazmidem cp32s. Jeszcze liczniejsze homologie wystê-puj¹ pomiêdzy cz¹steczkami DNA ró¿nych li-niowych plazmidów. Znacz¹ca liczba homolo-gii wskazuje na wielokrotn¹ reprezentacjê tych samych lub podobnych funkcji we wspó³ist-niej¹cych w komórce ró¿nych plazmidach. Zwielokrotnieniu kopii szeregu genów

towa-rzyszy zadziwiaj¹co du¿a liczba tzw. pseudoge-nów, sekwencji wysoce homologicznych do funkcjonalnych genów, lecz zawieraj¹cych mutacje, które znosz¹ ich zdolnoœci koduj¹ce. Mo¿liwe, ¿e liczne plazmidy Borrelia pe³ni¹ rolê magazynu dla wielu kopii genów podle-gaj¹cych niezale¿nym procesom ewolucyjnym. Zdolnoœæ do ekspresji podobnych, ale nie iden-tycznych genów z ró¿nych plazmidów praw-dopodobnie przyczynia siê do przyœpieszonej dynamiki zmian powierzchniowych antyge-nów komórkowych tej bakterii. To z kolei zwiêksza mo¿liwoœci ukrycia siê przed syste-mem immunologicznym gospodarzy Borrelia.

REPLIKACJA LINIOWYCH PLAZMIDÓW

Replikacja liniowych plazmidów i chromo-somów bakteryjnych rozpoczyna siê dwukie-runkowo wewn¹trz cz¹steczek ich DNA, a miej-sca inicjacji replikacji reprezentuj¹ ró¿ne typy replikonów (ZAKRZEWSKA-CZERWINSKA i SCHREMPF 1992, CALCUTT i SCHMIDT 1992, KIESERK i wspó³aut. 1992, SHIFFMAN i COHEN

1992, CHANG i COHEN 1994, Musia³owski i wspó³aut. 1994, CHANG i wspó³aut. 1996, FISCHER i wspó³aut. 1998, QINi COHEN, 1998, REDENBACH i wspó³aut. 1999, PICARDEAU i wspó³aut. 2000, HIRATSUi wspó³aut. 2000). Nie-które z nich przypominaj¹ replikony kolistych

plazmidów lub chromosomów bakteryjnych. Brak ró¿nic pomiêdzy replikonami liniowych i kolistych plazmidów potwierdza mo¿liwoœæ re-plikacji liniowych plazmidów pozbawionych rejonów telomerów jako kolistych cz¹steczek DNA (FERDOWSi wspó³aut. 1996). Informacja potrzebna dla odtworzenia struktury rów zawarta jest w sekwencji samych telome-rów i w genach dla rozpoznaj¹cych te sekwen-cje specyficznych bia³ek (BAO i COHEN 2001, YANGi wspó³aut. 2002, RAVINi wspó³aut. 2001, CHACONASi wspó³aut. 2001). Nie s¹ one specy-ficzne dla typu replikonu.

LINIOWE PLAZMIDY O KOÑCACH 5’ ZWI¥ZANYCH Z BIA£KIEM

Koñce zwi¹zane z bia³kiem wykryto w cz¹steczkach liniowych plazmidów bakterii Gram-dodatnich z rodzaju Streptomyces, Rho-dococcus i Mycobacterium, nale¿¹cych do rzê-du Actinomycetes, oraz w liniowych chromoso-mach bakterii z rodzaju Streptomyces i Saccha-ropolyspora (MEINHARDT i wspó³aut. 1997, VOLFF i ALTENBUCHNER 2000, HINNEBUSCH i TILLY 1993, PICARDEAU i VINCENT 1998, SHIMIZUi wspó³aut. 2001, KALKUS i wspó³aut. 1998). S¹ one wra¿liwe na trawienie egzonukle-az¹ III, która usuwa nukleotydy z koñca 3’ dwu-niciowego DNA. Obecnoœæ zwi¹zanego bia³ka sygnalizuje zmiana ruchliwoœci elektroforetycz-nej koñcowych fragmentów DNA po trawieniu enzymem proteolitycznym, proteinaz¹ K.

Dwukierunkowa replikacja z wewnêtrz-nych rejonów origin w cz¹steczkach tych pla-zmidów osi¹ga koniec 5’ ka¿dej matrycy przez do³¹czanie nuleotydów do koñca 3’-OH nowo syntetyzowanej nici. Replikacja w kierunku 3’

matrycy nie osi¹ga koñca. W badaniach nad plazmidem pSLA2-M S. rochei zaobserwowano powstawanie poœrednich form replikacyjnych — dwuniciowych cz¹steczek DNA o koñcach 5’ skróconych o oko³o 280 nukleotydów w sto-sunku do koñców 3’ (CHANGi COHEN 1994). Przypuszczalnie podobne formy poœrednie tworzone s¹ podczas replikacji innych plazmi-dów bakteryjnych o koñcach zwi¹zanych z bia³kiem. Dosyntetyzowywanie koñców 5’, za-le¿ne od bia³ek terminalnych i sekwencji telo-merowych, zachodzi na drodze nieznanego mechanizmu.

Badania nad liniowymi plazmidami i chro-mosomami Streptomyces wskazuj¹ na skompli-kowan¹ budowê ich rejonów telomerowych. D³ugoœæ odwróconych powtórzeñ (TIR) na koñcach cz¹steczek plazmidowego DNA waha siê od 44 par zasad w licz¹cym 50 tpz plazmi-dzie pSLP2 (CHENi wspó³aut. 1993 do 95 tpz w licz¹cym 387 tysiêcy par zasad plazmidzie

pPZG101 S. rimosus (GRAVIUS i wspó³aut. 1994). Rejony TIR chromosomu Streptomyces rimorus maj¹ a¿ 550 tysiêcy par zasad d³ugoœci (PIZA i wspó³aut. 1997). Mimo podobieñstwa, lewy i prawy rejon TIR mog¹ zawieraæ ró¿ni¹ce siê zasady lub fragmenty, co sugeruje zacho-dzenie niezale¿nych zmian w ich sekwencjach. Sekwencje koñcowych 168 nukleotydów wiê-kszoœci liniowych plazmidów i chromosomów Streptomyces okaza³y siê niemal identyczne (HUANGi wspó³aut. 1998, HIRATSUi wspó³aut. 2000, STOLL i wspó³aut. 2000). Wszystkie za-czynaj¹ siê od licz¹cego 13 nukleotydów rejo-nu o charakterze palindromu (5’-CCCGC-GGAGCGGG-3’) i zawieraj¹ oprócz jego po-wtórzeñ powtórzenia innych sekwencji palin-dromicznych w takiej kolejnoœci i orientacji, ¿e mog¹ one razem tworzyæ skomplikowane struktury drugorzêdowe (HUANG i wspó³aut. 1998, HIRATSUi wspó³aut. 2000). Sugerowano, ¿e struktury te s¹ istotne dla inicjacji replikacji telomerów. Jednak niemo¿noœæ ich tworzenia przez koñce chromosomu S. griseus i nielicz-nych liniowych plazmidów, których sekwen-cja odbiega od typowej lub zawiera tylko jej fragmenty, przecz¹ takiej hipotezie (GOSHI i wspó³aut. 2002). Ponadto koñce szeregu linio-wych plazmidów Mycobacterium i Rhodococ-cus nie mog¹ tworzyæ podobnych struktur (PICARDEAU i VINCENT, 1998, KALKUS i wspó³aut. 1998, SHIMIZU i wspó³aut. 2001).

Oprócz liniowych plazmidów Streptomy-ces, Rhodococcus i Mycobacterium koñce 5’ zwi¹zane z bia³kiem s¹ charakterystyczne dla li-niowych plazmidów wyizolowanych z cytopla-zmy, mitochondriów lub plastydów komórek grzybów, alg lub roœlin wy¿szych oraz dla cz¹steczek DNA adenowirusów i niektórych bakteriofagów. Podobieñstwo struktury ko-ñców oraz zdolnoœæ do replikacji z odtworze-niem liniowej formy DNA sta³y siê podstaw¹ do nadania tym elementom genetycznym wspólnej nazwy — inwertron (SAKAGUCHI

1990).

Zapocz¹tkowanie replikacji koñców ele-mentów typu inwertronu poznano na przyk³adzie bakteriofaga phi29 Bacillus subti-lis (SALAS1999, MEIJERi wspó³aut. 2001). Telo-mer s³u¿y tu jako miejsce startu replikacji, a bia³ko zwi¹zane do koñców 5’ DNA (ang. ter-minal protein TP) jako primer dla specyficznej polimerazy DNA phi29. W reakcji zapocz¹tko-wania replikacji polimeraza DNA tworzy kom-pleks z TP, a nastêpnie katalizuje powstanie wi¹zania kowalencyjnego pomiêdzy grup¹

hy-droksylow¹ (OH) reszty serynowej TP, a deok-syrybonukleotydem (dAMP). Zwi¹zane z bia³kiem dAMP staje siê pierwszym nukleoty-dem nowo syntetyzowanej nici DNA. Chocia¿ dAMP jest pocz¹tkowo przy³¹czane do TP w pozycji komplementarnej do drugiego T trycy powsta³y kompleks œlizga siê wstecz ma-trycy, do pozycji komplementarnej z jej pierw-szym T. Poœlizg mo¿liwy jest dziêki obecnoœci na koñcach DNA phi29 ci¹gu trzech T wchodz¹cych w sk³ad szeœcionukleotydowej sekwencji (5’-TTTCAT-3’). W ten sposób odzy-skiwana jest informacja zakodowana w skraj-nym nukleotydzie 3’ matrycy. Po poœlizgu wzd³u¿ matrycy polimeraza DNA pozostaje w kompleksie z TP podczas do³¹czania do nici DNA kilku dalszych nukleotydów. Zmiana kon-formacji kompleksu powoduje od³¹czenie TP od polimerazy kiedy nowa niæ DNA ma ju¿ wy-starczaj¹c¹ d³ugoœæ by sama mog³a s³u¿yæ jako primer.

Powtórzenia identycznych nukleotydów na koñcach cz¹steczek DNA s¹ typowe dla adenowirusa (KING i VAN DER VLIET1994) i bakteriofagów o strukturze inwertronów, a replikacja ich cz¹steczek DNA zachodzi na za-sadzie mechanizmu podobnego do replikacji bakteriofaga phi29. Nie jest jasne czy mimo podobieñstwa struktur koñce bakteryjnych plazmidów i chromosomów typu inwertronu, ulegaj¹ replikacji na zasadzie podobnego me-chanizmu. Wszystkie one, z wyj¹tkiem ko-ñców chromosomu S. griseus, zaczynaj¹ siê od przynajmniej dwóch identycznych nukleoty-dów (PICARDEAU i VINCENT 1998, HUANG i wspó³aut. 1998, SHIMIZU i wspó³aut. 2001, SPATZ i wspó³aut. 2002, GOSHI i wspó³aut. 2002). Jednak terminalne bia³ka liniowych plazmidów i chromosomów Streptomyces nie wykazuj¹ homologii z terminalnymi bia³kami innych elementów o strukturze inwertronu (BAOi COHEN2001, YANG i wspó³aut. 2002). Zamiast tego zawieraj¹ one fragment o s³abej homologii do enzymów typu odwrotnej tran-skryptazy, zdolnych do syntezy DNA na matry-cy RNA.

Najprawdopodobniej terminalne bia³ka zwi¹zane z przeciwleg³ymi koñcami plazmi-dów Streptomyces wchodz¹ ze sob¹ w interak-cjê, co prowadzi do powstania wewn¹trz ko-mórek pseudo-kolistych form DNA plazmido-wego. W przypadku chromosomów Strepto-myces uzyskano ju¿ dowody na interakcje po-miêdzy terminalnymi bia³kami tej samej cz¹steczki DNA (YANG i wspó³aut. 2002).

Terminalne bia³ka liniowych plazmidów in-nych bakterii Gram-dodatnich nie zosta³y dot¹d poznane. Plazmid pCLP M. celatum ko-duje bia³ko podobne do resolwaz, endonukle-az bior¹cych udzia³ w rozdzielaniu poœrednich

form rekombinacyjnych cz¹steczek DNA (LE

DANTECi wspó³aut. 2001). Zaproponowano, ¿e byæ mo¿e uczestniczy ono w odtwarzaniu li-niowych koñców tego plazmidu (QINi COHEN

1998).

LINIOWE PLAZMIDY O KOWALENCYJNIE ZAMKNIÊTYCH KOÑCACH

Liniowe plazmidy o kowalencyjnie za-mkniêtych koñcach wykryto wy³¹cznie u bak-terii Gram-ujemnych. Pojedyncze izolaty ta-kich plazmidów opisano u Klebsiella oocyta, Xantobacter, Yarsinia pestis i E. coli (Mein-hard i wspó³aut. 1997, RYBCHINi SVARCHEVSKY

1999, DENEKEi wspó³aut. 2002). Powszechnie plazmidy tego typu wystêpuj¹ jedynie u krêt-ków rodzaju Borrelia, których liniowe chro-mosomy maj¹ podobn¹ strukturê koñców (CASJENS 1999). Kowalencyjnie zamkniête ko-ñce plazmidów bakteryjnych przypominaj¹ struktur¹ koñce liniowych cz¹steczek DNA mi-tochondrialnego okreœlonych gatunków dro-¿d¿y oraz koñce niektórych du¿ych wirusów, takich jak pokswirusy i irydopokswirusy.

Najlepiej poznanym plazmidem o kowalen-cyjnie zamkniêtych koñcach liniowego DNA jest profag bakteriofaga N15 E. coli (RYBCHINi SVARCHEVSKY 1999). Bakteriofag N15 struk-tur¹ wirionu i d³ugoœci¹ genomu (46,4 tpz) przypomina bakteriofaga λ. Sekwencje geno-mów N15 iλ s¹ w du¿ej czêœci homologiczne (RAVINi wspó³aut. 2000). W odró¿nieniu odλ N15 nie ma zdolnoœci integracji do chromoso-mu lecz lizogenizuje bakterie jako niskokopio-wy plazmid. Po infekcji komórek liniowe DNA faga N15 ulega cyrkularyzacji poprzez ligacjê lepkich koñców cosL i cosR (Ryc. 2).

Zapocz¹tkowanie lizogenii wi¹¿e siê z prze-ciêciem kolistej formy DNA N15 w miejscu telL/R, które s³u¿y jako substrat do wytworze-nia kowalencyjnie zamkniêtych koñców linio-wego plazmidu-profaga. Bia³kiem katali-zuj¹cym przeciêcie telL/R i wytworzenie telo-merów jest produkt genu telN N15, jedynego genu niezbêdnego dla utrzymania profaga N15 w liniowej formie (DENEKE i wspó³aut. 2000, RAVIN i wspó³aut. 2001).

Rejony telomerowe N15 zawieraj¹ 28-mio nukleotydowe sekwencje o charakterze palin-dromu, zakoñczone czteronukleotydow¹ jed-noniciow¹ pêtl¹ utworzon¹ przez kowalencyj-nie zamkniête koñce (Ryc. 2). Sekwencje obu koñców s¹ prawie identyczne (26/28). Miej-sce, które stanowi substrat dla utworzenia

telo-merów w dwuniciowym DNA faga N15 (telL/R), obejmuje 56-cio nukleotydowy palin-drom, którego lewe i prawe ramiê ró¿ni¹ siê tylko w pozycji odleglej o –12 i +14 nukleoty-dów od centrum palindromu. Tworz¹cy ideal-ny palindrom 22 nukleotydowy rejon central-ny telL/R, zwacentral-ny telO, graniczy z obu stron z ci¹gami trzech odwróconych wzglêdem siebie powtórzeñ podobnej dziewiêcionukleotydo-wej sekwencji (taacAgaACA): tosL1-tosR1, tosL2-tosR2 i tosL3-tosR3.

Replikacja plazmidu N15 zale¿y od genu re-plikacyjnego repA i rozpoczyna siê dwukierun-kowo w rejonie inicjacji (ang. origin) znaj-duj¹cym siê wewn¹trz tego genu (Ryc. 2) Re-plikacja plazmidów pozbawionych telN prowa-dzi do powstania kolistych dimerów, w któ-rych poszczególne cz¹steczki granicz¹ ze sob¹ rejonami telL i telR (RAVIN i wspó³aut. 2001). Indukcja syntezy TelN w komórkach zawie-raj¹cych poœrednie formy dimeryczne powo-duje odtworzenie liniowych cz¹steczek N15. Funkcja TelN nie zale¿y od typu relikonu, a tyl-ko od sekwencji telomerowych N15. W obec-noœci bia³ka TelN pochodne kolistych plazmi-dów F i P1 ze sklonowanym rejonem telL/R by³y utrzymywane w komórkach jako liniowe plazmidy. Tworzenie kolistych dimerów pla-zmidowego DNA jako poœrednich form repli-kacyjnych doprowadzi³o do zrozumienia me-chanizmu odtwarzania liniowych telomerów w procesie replikacji N15 (Ryc. 3). Wyniki do-tychczasowych badañ wskazuj¹, ¿e jedyn¹ rol¹ TelN jest przecinanie zreplikowanych rejonów telomerowych kolistych dimerów lub wcze-œniejszych form replikacyjnych i tworzenie ko-walencyjnych wi¹zañ pomiêdzy koñcami kom-plementarnych nici DNA.

Mechanizm odtwarzania liniowej struktury plazmidów Borrelia w trakcie replikaji okaza³ siê podobny do zaobserwowanego u profaga N15. Wymaga on zakonserwowanej sekwencji telomerów plazmidowych. Sekwencje koñco-wych 25-ciu nukleotydów liniokoñco-wych plazmi-dów i chromosomów Borrelia oraz profaga N15 s¹ homologiczne (CASJENS i wspó³aut.

1997). Wszystkie one zawieraj¹ przy koñcu heksanukleotyd TATAAT. Identyczny heksanu-kleotyd wystêpuje przy koñcach cz¹steczek DNA wirusa œwiñskiej gor¹czki afrykañskiej (ASFV) i wirusa ospy, których liniowe genomy maj¹ kowalencyjnie zamkniête koñce.

Kolisty plazmid, który zawiera³ zrepliko-wany rejon telL (telLL) liniowego plazmidu lp17 B. burgdorferii po wprowadzeniu do komórek tej bakterii by³ stabilnie utrzymywa-ny w formie liniowego plazmidu o koñcach identycznych z telL lp17 (CHACONAS i wspó³aut. 2001). Jeden z kolistych

plazmi-telL repA cB telR parB parA cosR/L telN

najkrótszy kolisty plazmid mini-N15

najkrótszy stabilnie utrzymywany liniowy plazmid mini-N15

46375 par zasad

CB CB CB CB CB CB CB CB

ParB ParB ParB ParB telL/R telL telR telL/R cosL cosL/R cosL/R cosR DNA faga N15 DNA plazmidu-profaga N15

A

B

C

5-TATCAGCACACAATtGc CCATTATACGCGCGTATAATGG aCtATTGTGTGCTGATA-3' 3-ATAGTCGTGTGTTAaCg GGTAATATGCGCGCATATTACC tGaTAACACACGACTAT-5'

tosR3 telO tosL3

+10 +20 -20 -10 -1

-1

-20 -10 +1 +10 +20

telL/R

Ryc. 2. Struktura liniowego plazmidu profaga N15 i jego rejonów telomerowych.

(A) Wewn¹trzkomórkowa konwersja liniowego DNA faga N15 do liniowego plazmidu profaga. (B) Organizacja genomu profaga N15. Geny N15 niezbêdne dla stabilnego utrzymania profaga jako liniowego plazmidu zazna-czono na schemacie kolorem czarnym. Miejsca wi¹zania represora funkcji fagowych, produktu genu cB (CB), oznaczono strza³kami pod schematem genomu. Miejsca centromerowe wi¹¿¹ce bia³ko ParB i niezbêdne dla sta-bilnej segregacji plazmidu N15 oznaczono ostrzami skierowanych do do³u trójk¹tów. (C) Struktura telomerów profaga N15 (telL i telR) oraz rejonu telL/R w DNA faga N15. Rejon telL/R jest czêœci¹ d³u¿szego rejonu zwanego

tos (z ang. telomerase occupancy site), s³u¿¹cego jako substrat do wytworzenia telomerów i zawieraj¹cego dwie

dodatkowe (nie pokazane na rysunku) pary odwróconych powtórzeñ sekwencji taacAgaACA: tosL2-tosR2,

tosL1-tosR1 (objaœnienia w tekœcie) (wg RYBCHINA i SVARCHEVSKYEGO 1999, RAVINA i wspó³aut. 2001, GRIGORIEVAi £OBOCKIEJ2001).

dów B. burgdorferii zawiera gen (BBB03), którego produkt wykazuje homologie z bia³kiem TelN N15. Oczyszczony produkt tego genu, ResT, okaza³ siê wystarczaj¹cy do trawienia dwuniciowego fragmentu DNA za-wieraj¹cego telLL, z utworzeniem dwóch fragmentów DNA o kowalencyjnie zamkniê-tych koñcach powsta³ych w miejscu trawie-nia (KOBRYNi CHACONAS2002). Badania nad bia³kami TelN N15 (DENEKEi wspó³aut. 2000,

2002) i ResT Borrelia pozwoli³y zaszerego-waæ je do nowej grupy enzymów o wspólnym mechanizmie dzia³ania dla których zapropo-nowano nazwê protelomerazy lub resolwazy telomerów. Oba bia³ka katalizuj¹ rozdziela-nie telomerów in vitro w reakcji, w której naj-pierw dochodzi do przeciêcia dwóch wi¹zañ fosfodwuestrowych, ka¿dego w przeciw-leg³ej nici dwuniciowego DNA, a nastêpnie kowalencyjnego po³¹czenia

komplementar-nych koñców przeciwleg³ych nici tego same-go ³añcucha DNA (Ryc. 4). Minimalny frag-ment DNA wymagany dla wydajnego odtwo-rzenia telomerów N15 przez TelN pokrywa siê z rejonem telL/R (Ryc. 2C). Uda³o siê roz-dzieliæ aktywnoœci TelN zwi¹zane z jego zdol-noœci¹ do specyficznego rozpoznawania DNA telL/R oraz trawienia i ponownego ³¹czenia nici DNA. Specyficzne wi¹zanie TelN z DNA wymaga przynajmniej

centralne-go rejonu telL/R (telO) oraz dwóch s¹sia-duj¹cych z nim sekwencji tosL3 i tosL3. Reak-cja przecinania i ponownego ³¹czenia nici DNA zachodzi z nisk¹ wydajnoœci¹ nawet w obecnoœci samego rejonu telO. Reakcje roz-dzielania telomerów zarówno przez TelN, jak i ResT, nie wymagaj¹ obecnoœci ani jonów dwuwartoœciowych ani zwi¹zków wysoko-energetycznych, ani te¿ ¿adnych towa-rzysz¹cych bia³ek. ori ori ori ori ori ori ori ori ori ori ori inicjacja replikacji replikacja kolisty dimer replikacja dzialanie TelN dzialanie TelN dzialanie TelN replikacja telL telR telL telR telLL telR telL telL telR telLL telRR telRR telR telL telL telL telL telR A A A B B ori ori

Ryc. 3. Model replikacji plazmidu-profaga N15 uwzglêdniaj¹cy dzia³anie protelomerazy TelN przed (wariant A) i po (wariant B) zakoñczeniu procesów replikacyjnych zainicjowanych z umieszczonego niesymetrycznie w cz¹steczce rejonu origin (ori).

(A) Protelomeraza TelN przecina zduplikowany rejon telL (telLL) i odtwarza strukturê lewego telomeru przed za-koñczeniem replikacji. Prowadzi to do powstania Y-kszta³tnych poœrednich form replikacyjnych. (B) Replikacja ca³ej cz¹steczki DNA koñczy siê przed przeciêciem zduplikowanego rejonu telL przez polimerazê, prowadz¹c do powstania jako form poœrednich kolistych dimerów. Ciêcie zduplikowanych rejonów telomerowych i odtworze-nie ich pierwotnej struktury koñczy cykl replikacyjny profaga (wg. RAVINAi wspó³aut. 2001).

PARTYCJA LINIOWYCH PLAZMIDÓW BAKTERYJNYCH

Mimo istotnych ró¿nic topologicznych po-miêdzy liniowymi i kolistymi cz¹steczkami DNA aktywna segregacja (partycja) liniowych i kolistych plazmidów zale¿y od podobnych me-chanizmów (patrz artyku³ M. £obockiej i wspó³aut. w tym numerze KOSMOSU). Najle-piej poznany zosta³ system partycyjny profaga N15 (Ryc. 2B; RAVINi Lane 1999; Grigoriew i £OBOCKA 2001). Sk³ada siê on z operonu ko-duj¹cego bia³ka partycyjne ParA i ParB tego pla-zmidu oraz czterech rozrzuconych po geno-mie sekwencji centromerowych, parS. Bia³ka

ParA i ParB N15 s¹ homologami bia³ek partycyj-nych kolistych plazmidów i chromosomów bakteryjnych. S¹ one zdolne do stabilizacji za-równo liniowych, jak i kolistych plazmidów nios¹cyh przynajmniej jedn¹ sekwencjê parS. Stabilnoœæ innych liniowych plazmidów rów-nie¿ wydaje siê zale¿eæ od homologów typo-wych bia³ek partycyjnych, niezale¿nie od struktury telomerów tych plazmidów (KIM i wspó³aut. 2000, PICARDEAU i wspó³aut. 2000, LE DANTEC i wspó³aut. 2001).

POCHODZENIE LINIOWYCH PLAZMIDÓW BAKTERYJNYCH

Liniowoœæ okreœlonych replikonów bakte-ryjnych wydaje siê byæ stosunkowo nowym na-bytkiem ewolucyjnym. Ograniczenie wystêpo-wania wiêkszoœci liniowych plazmidów i chro-mosomów do kilku rodzajów bakterii

wskazu-je na ich pojawienie siê u przedstawicieli tych rodzajów w wyniku transferu horyzontalnego lub rekombinacji z wirusowymi cz¹steczkami DNA (CASJENS 1999, VOLFF i ALTENBUCHNER

2000). Y Y Y OH _Y OH

ResT

_{telLL DNA}

trawienie DNA

kowalencyjne wiazanie koncow przeciwleglych nici

A

B

5'-TAATAAAAAATTATAT ATATAATTTTTTATTA-3' 3'-ATTATTTTTTAATATA TATATTAAAAAATAAT-5'

Ryc. 4. Mechanizm dzia³ania resolwazy telomerów ResT wyizolowanej z B. burgdorferii.

(A) Sekwencja zreplikowanego fragmentu lewego telomeru plazmidu lp17 (telLL) wchodz¹ca w interakcjê z re-solwas¹ telomerów ResT. Ciemne strza³ki wskazuj¹ miejsca trawienia DNA zreplikowanego telomeru przez ResT. (B) Proponowany mechanizm rozdzia³u telomerów przez ResT. Srodek symetrii zreplikowanej sekwencji telomeru zaznaczono przerywan¹ lini¹. Fosforany 5’ w miejscach ciêcia DNA przez ResT oznaczono czarnymi kropkami. Podczas procesu przecinania DNA reszta tyrozyny (Y) w centrum aktywnym ResT (zaznaczonym na bia³o) wi¹¿e siê kowalencyjnie z koñcem 5’ przeciêtej nici DNA (wg KOBRYNA i CHACONASA2002).

Liniowe plazmidy o koñcach typu inwertronu mog³y wyewoluowaæ z bakterio-fagów lub te¿ powstaæ drog¹ rekombinacji kolistych plazmidów z bakteriofagami (HINNEBUSCH i TILLY 1993). Poparciem takiej hipotezy s¹ podobieñstwa rejonów inicjacji replikacji liniowych plazmidów Streptomyces, pSLA2 i pSCL1 do rejonów inicjacji replikacji okreœlonych bakteriofagów (CHANGi wspó³aut. 1996). Równie¿ podobieñstwo produktu genu w rejonie inicjacji replikacji plazmidu pSCP1 S. coelicolor do okreœlonych enzymów replikacyjnych bakteriofagów Actinomycetes, mo¿e byæ œladem fagowego pochodzenia czêœci tego plazmidu (REDENBACHi wspó³aut. 1999). Ró¿norodnoœæ replikonów liniowych plazmidów Actinomycetes mo¿e œwiadczyæ o tym, ¿e nie powsta³y one ze wspólnego przodka, ale w wyniku niezale¿nych zdarzeñ rekombi-nacyjnych kolistych plazmidów z ró¿nymi bakteriofagami.

Chocia¿ homologie protelomerazy profaga N15 i resolwazy telomerów plazmidów rodza-ju Borrelia wskazuj¹ na wspólne pochodzenie liniowych replikonów bakteryjnych o kowa-lencyjnie zamkniêtych koñcach, punkt wyjœcia ich ewolucji jest trudny do ustalenia. Intry-guj¹ca jest zarówno nieliczna reprezentacja tego typu plazmidów i chromosomów u bakte-rii, jak i podobieñstwo ich koñców do koñców liniowych cz¹steczek DNA du¿ych wirusów eukariotycznych, takich jak poxwirusy i

irydo-poxwirusy (CASJENS 1999). Zaproponowano, ¿e liniowe plazmidy bakterii z rodzaju Borrelia mog³y powstaæ na drodze rekombinacji koli-stego plazmidu z DNA irydopoxwirusa (HINNEBUSCH i BARBOUR1991). Kontakt tych ró¿nych filogenetycznie cz¹steczek DNA móg³ nast¹piæ w organizmie wspólnego nosiciela. Bakterie rodzaju Borrelia i nale¿¹cy do irydo-poxwirusów wirus œwiñskiej gor¹czki afrykañ-skiej (ASFV) s¹ przenoszone przez ró¿ne pajê-czaki. Jeden z afrykañskich kleszczy, Ornitho-doros moubata, jest nosicielem zarówno B. duttoni, jak i wirusa ASFV.

Utworzone przez rekombinacjê liniowe plazmidy mog³y podlegaæ dalszej ewolucji drog¹ kolejnych procesów rekombinacyjnych z kolistymi plazmidami i z chromosomalnym DNA. Kluczow¹ rolê w ich rozprzestrzenianiu siê do innych gatunków tego samego rodzaju bakterii odegra³y zapewne procesy koniugacyj-ne. Wiêkszoœæ plazmidów o koñcach typu in-wertronu to du¿e plazmidy koniugacyjne. Sze-reg obserwacji wskazuje zarówno na miêdzy-gatunkowe przekazywanie liniowych plazmi-dów w obrêbie poszczególnych rodzajów Acti-nomycetales, jak i na ich przekazywanie pomiê-dzy przedstawicielami ró¿nych rodzajów tego rzêdu (WIENERi wspó³aut. 1998, LEDANTECi wspó³aut. 2001). Zaobserwowano równie¿ transfer plazmidów S. coelicolor i S. lividans do M. smegmatis drog¹ spontanicznej transforma-cji (BHATT i wspó³aut. 2002)

SPECYFIKA EWOLUCJI LINIOWYCH GENOMÓW PLAZMIDOWYCH

Powody stabilnego utrzymywania siê linio-wych form plazmidowego i chromosomalnego DNA u bakterii takich jak Borrelia i Streptomy-ces nie s¹ do koñca jasne. Szczególnie zadziwia fakt, ¿e mimo wysokiej czêstoœci spontanicz-nych konwersji liniowych form DNA do form kolistych, liniowoœæ chromosomów i okreœlo-nych plazmidów wydaje siê niezmienn¹ cech¹ u naturalnych izolatów tych bakterii (VOLFF

i

ALTENBUCHNER2000, CASJENS1999). Mo¿liwe, ¿e du¿e delecje towarzysz¹ce cyrkularyzacji w warunkach naturalnych powoduj¹ utratê ge-nów korzystnych dla wzrostu komórek.

Zalet¹ liniowych genomów jest niew¹tpli-wie brak mo¿liwoœci multimeryzacji cz¹ste-czek DNA na skutek rekombinacji pomiêdzy ich homologicznymi fragmentami. Towarzyszy temu brak miejscowo-specyficznych syste-mów rekombinacyjnych zdolnych do

rozdzie-lania multimerów i typowych dla genomów wystêpuj¹cych w formie kolistych cz¹steczek DNA (patrz art. U. ZIELENKIEWICZi P. C EG£OW-SKIEGOw tym zeszycie KOSMOSU). Byæ mo¿e w³aœnie brak takich systemów decyduje o nie-stabilnoœci kolistych plazmidów i chromoso-mów powsta³ych spontanicznie z pierwotnych form liniowych.

Liniowoœæ u³atwia wymianê fragmentów pomiêdzy ró¿nymi cz¹steczkami DNA. Zarów-no u bakterii rodzaju Streptomyces, jak i Borre-lia zaobserwowano wymianê koñców pomiê-dzy liniowymi plazmidami lub liniowymi pla-zmidami i chromosomem na skutek pojedyn-czej rekombinacji DNA. Koniugacyjny transfer plazmidów zawieraj¹cych chromosomalne fragmenty DNA daje ³atw¹ mo¿liwoœæ przeno-szenia tych fragmentów do innych gatunków tego samego lub pokrewnych rodzajów

bakte-rii. Geny zlokalizowane blisko koñców linio-wych cz¹steczek DNA podlegaj¹ czêstszym wy-mianom ni¿ geny w pobli¿u centrum cz¹stecz-ki, prawdopodobnie ze wzglêdu na zwiêkszo-ne prawdopodobieñstwo zatrzymania w cz¹steczkach rekombinantów rejonów ko-duj¹cych niezbêdne funkcje. Dlatego uwa¿a siê, ¿e rejony telomerowe s¹ jednoczeœnie rejo-nami zwiêkszonej plastycznoœci genomowej. Pozwala to na ró¿ne tempo ewolucji genów w zale¿noœci od ich lokalizacji w liniowej cz¹steczce DNA. Konsekwentnie najbardziej niezbêdne i konserwatywne ewolucyjnie funk-cje liniowyh plazmidów i chromosomów

bak-teryjnych kodowane s¹ na ogó³ przez centralne fragmenty ich DNA. W rejonach blisko koñców zaobserwowano zadziwiaj¹co du¿o tzw. pseu-dogenów. Przyspieszone tempo ewolucji okre-œlonych rejonów liniowych cz¹steczek DNA ma znaczenie dla szybkiego przystosowywania Streptomyces i Borrelia do zmian warunków w naturalnych œrodowiskach ¿ycia tych bakterii. W przypadku Borrelia ma ono szczególn¹ war-toœæ dla tzw. zmiennoœci antygenowej (ang. an-tigenic variation), pozwalaj¹cej bakteriom na unikanie ataków ze strony systemu immunolo-gicznego ich zainfekowanego gospodarza.

LINEAR BACTERIAL PLASMIDS S u m m a r y

Completion of linear DNA replication requires a way to restore the original sequence and structure of linear DNA ends which can not be fully replicated by conventional DNA polymerases. In bacteria, the end replication problem has been circumvented through the use of circular plasmids and chromosomes. How-ever linear bacterial plasmids and chromosomes have also been isolated. Their ends, commonly known as prokaryotic telomers, differ in structure from the ends of eukaryotic chromosomes and, during replication, become restored to their original form by a different mechanism. Two kinds of linear plasmids have been isolated: plasmids with covalently closed hairpin ends, and plasmids with invertron ends, which contain pro-teins bound to their 5’ termini. The latter constitute the larger group and are commonly found in actinomycetous bacteria. They are usually conjugative and confer advantageous phenotypes. Plasmids with covalently closed ends are common in spirochetes of

the genus Borrelia. A model plasmid of this group is prophage N15 of Escherichia coli, which exists in lysogens as a linear DNA molecule. The major differ-ence between circular and linear plasmids is the pres-ence in the latter of linear ends and proteins that spe-cifically recognize those ends and are able to restore plasmid linearity during or after replication. Complete replication of invertron telomers depends on their 5’ end-associated proteins but its mechanism is still un-clear. Plasmids with covalently closed ends are com-pletely replicated from an internal origin to form cir-cular dimeric molecules that can be observed as repli-cation intermediates. Further processing of the inter-mediates depends on telomere resolution, a DNA breakage and reunion reaction, in which opposite strands of replicated telomeres are cleaved and re-joined to form covalently closed ends of two progeny molecules.

LITERATURA BAOK., COHENS. N., 2001. Terminal proteins essential

for the replication of linear plasmids and chromo-somes in Streptomyces. Genes Dev. 15, 1518–1527.

BERGERONH., LABBED., TURMELC., LAUP. C., 1998.

Clo-ning, sequence and expression of a linear pla-smid-based and a chromosomal homolog of chlo-roacetaldehyde dehydrogenase-encoding genes in Xanthobacter autotrophicus GJ10. Gene 207,

9–18.

BEYS. J., TSOUM. F., HUANGC. H., YANGC. C., CHENC. W., 2000. The homologous terminal sequence of the

Streptomyces lividans chromosome and SLP2 pla-smid. Microbiology 146, 911–922.

BHATTA., KIESERH. M., MELTONR. E., KIESERT., 2002.

Plasmid transfer from Streptomyces to Mycobac-terium smegmatis by spontaneous transforma-tion. Mol. Microbiol. 43, 135–146.

BROWNS. E., KNUDSOND. L., ISHIMARUC. A., 2002. Linear

plasmid in the genome of Clavibacter michiga-nensis subsp. sepedonicus. J. Bacteriol. 184,

2841–2844.

CALCUTTM. J., SCHMIDTF. J., 1992. Conserved gene

ar-rangement in the origin region of the Streptomy-ces coelicolor chromosome. J. Bacteriol. 174,

3220–3226.

CASJENSS., 1999. Evolution of the linear DNA replicons

of the Borrelia spirochetes. Curr. Opin. Microbiol.

2, 529–534.

CASJENS S., MURPHY M., DELANGEM., SAMPSON L., VAN

VUGTR., HUANGW. M., 1997. Telomeres of the

line-ar chromosomes of Lyme disease spirochaetes: nucleotide sequence and possible exchange with linear plasmid telomeres. Mol. Microbiol. 26,

581–596.

CASJENS S., PALMER N., VAN VUGT R., HUANG W. M., STEVENSON B., ROSA P., LATHIGRA R., SUTTON G.,

PETERSONJ., DODSONR. J., HAFTD., HICKEYE., GWINN

M., WHITEO., FRASERC. M., 2000. A bacterial

geno-me in flux: the twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorfe-ri. Mol. Microbiol. 35, 490–516.

CHACONASG., STEWARTP. E., TILLYK., BONOJ. L., ROSAP., 2001. Telomere resolution in the Lyme disease

spi-rochete. EMBO J. 20, 3229–3237.

CHANGP. C., COHENS. N., 1994. Bidirectional

replica-tion from an internal origin in a linear Strepto-myces plasmid. Science 265, 952–954.

CHANGP. C., KIME. S., COHENS. N., 1996. Streptomyces

linear plasmids that contain a phage-like, central-ly located, replication origin. Mol. Microbiol. 22,

789–800.

CHENC. W., YUT. W., LINY. S., KIESERH. M., HOPWOOD

D. A., 1993. The conjugative plasmid SLP2 of

Strep-tomyces lividans is a 50 kb linear molecule. Mol.

Microbiol. 7, 925–932.

DABROCKB., KESSELERM., AVERHOFFB. i GOTTSCHALKG. 1994. Identification i characterization of a

trans-missible linear plasmid from Rhodococcus ery-thropolis BD2 that encodes isopropylbenzene and trichloroethene catabolism. Appl. Environ.

Micro-biol. 60, 853–860.

DENEKEJ., ZIEGELING., LURZR., LANKAE., 2000. The

pro-telomerase of temperate Escherichia coli phage N15 has cleaving- joining activity. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 97, 7721–7726.

DENEKEJ., ZIEGELING., LURZR., LANKAE., 2002. Phage

N15 telomere resolution. Target requirements for recognition and processing by the protelomerase.

J. Biol. Chem. 277, 10410–10419.

FERDOWS M. S., SERWER P., GRIESS G. A., NORRIS S. J., BARBOURA. G., 1996. Conversion of a linear to a

circular plasmid in the relapsing fever agent Bor-relia hermsii. J. Bacteriol. 178, 793–800.

FISCHERG., HOLLA. C., VOLFFJ. N., VIEWIELED., DECARIS

B., LEBLONDP., 1998. Replication of the linear

chro-mosomal DNA from the centrally located oriC of Streptomyces ambofaciens revealed by PFGE gene dosage analysis. Res. Microbiol. 149, 203–210.

FUKUDAM., SHIMIZUS., OKITAN., SETOM., MASAIE., 1998.

Structural alteration of linear plasmids encoding the genes for polychlorinated biphenyl degrada-tion in Rhodococcus strain RHA1. Antonie Van

Le-euwenhoek, 74, 169–173.

GOETHALSK., VEREECKED., JAZIRIM., VANMONTAGUM. i

HOLSTERSM., 2001. Leafy gall formation by

Rhodo-coccus fascians. Annu. Rev. Phytopathol. 39,

27–52.

GOODNER B., HINKLE G., GATTUNG S., MILLER N.,

BLANCHARDM., QUROLLOB., GOLDMANB. S., CAOY., ASKENAZI M., HALLING C., MULLIN L., HOUMIEL K., GORDONJ., VAUDINM., IARTCHOUKO., EPPA., LIUF., WOLLAM C., ALLINGER M., DOUGHTY D., SCOTT C., LAPPAS C., MARKELZ B., FLANAGAN C., CROWELL C., GURSON J., LOMO C., SEAR C., STRUB G., CIELO C., SLATERS., 2001. Genome sequence of the plant

pa-thogen i biotechnology agent Agrobacterium tu-mefaciens C58. Science 294, 2323–2328.

GOSHIK., UCHIDAT., LEZHAVAA., YAMASAKIM., HIRATSU

K., SHINKAWA H., KINASHI H., 2002. Cloning and

analysis of the telomere i terminal inverted repeat of the linear chromosome of Streptomyces griseus.

J. Bacteriol. 184, 3411–3415.

GRAVIUSB., GLOCKERD., PIGACJ., PIZAK., HRANUELID.,

CULLUM J., 1994. The 387 kb linear plasmid

pPZG101 of Streptomyces rimosus and its interac-tions with the chromosome. Microbiology 140,

2271–2277.

GRIGORIEVP., £OBOCKAM. B., 2001. Determinants of

se-gregational stability of the linear plasmid propha-ge N15 of Escherichia coli. Mol. Microbiology 42,

355–368.

HINNEBUSCHJ., BARBOURA. G., 1991. Linear plasmids of

Borrelia burgdorferi have a telomeric structure and sequence similar to those of a eukaryotic vi-rus. J. Bacteriol. 173, 7233–7239.

HINNEBUSCH J., TILLY K., 1993. Linear plasmids and

chromosomes in bacteria. Mol. Microbiol. 10,

917–922.

HIRATSUK., MOCHIZUKIS., KINASHIH., 2000. Cloning i

analysis of the replication origin and the telome-res of the large linear plasmid pSLA2-L in Strepto-myces rochei. Mol. Gen. Genet. 263, 1015–1021.

HUANGC. H., LINY. S., YANGY. L., HUANGS. W., CHENC. W., 1998. The telomeres of Streptomyces

chromo-somes contain conserved palindromic sequences with potential to form complex secondary structu-res. Mol. Microbiol. 28, 905–916.

KALKUSJ., DORRIEC., FISCHERD., REHM., SCHLEGELH. G., 1993. The giant linear plasmid pHG207 from

Rho-dococcus sp. encoding hydrogen autotrophy: cha-racterization of the plasmid and its termini. J.

Gen. Microbiol. 139, 2055–2065.

KALKUSJ., MENNER., REHM., SCHLEGELH. G., 1998. The

terminal structures of linear plasmids from Rho-dococcus opacus. Microbiology 144, 1271–1279.

KESSELERM., DABBSE. R., AVERHOFFB., GOTTSCHALKG., 1996. Studies on the isopropylbenzene

2,3-dioxyg-enase and the 3- isopropylcatechol 2,3-dioxygen-ase genes encoded by the linear plasmid of Rhodo-coccus erythropolis BD2. Microbiology 142, 3241–3251.

KIESERK H. M., KIESERK T., HOPWOODD. A., 1992. A

com-bined genetic and physical map of the Streptomy-ces coelicolor A3(2) chromosome. J. Bacteriol.

174, 5496–5507.

KINGA. J., VANDERVLIETP. C., 1994. A precursor

termi-nal protein-trinucleotide intermediate during ini-tiation of adenovirus DNA replication: regenera-tion of molecular ends in vitro by a jumping back mechanism. EMBO J. 13, 5786–5792.

KOBRYNK., CHACONASG., 2001. The circle is broken:

te-lomere resolution in linear replicons. Curr. Opin.

Microbiol. 4, 558–564.

KOBRYNK., CHACONAS G., 2002. ResT, a telomere

re-solvase encoded by the Lyme disease spirochete.

Mol. Cell 9, 195–201.

KRUMJ. G., ENSIGNS. A., 2001. Evidence that a linear

megaplasmid encodes enzymes of aliphatic alke-ne and epoxide metabolism i coenzyme M 2-me-rcaptoethanesulfonate) biosynthesis in Xanth-obacter strain Py2. J. Bacteriol. 183, 2172–2177.

LE DANTEC C., WINTER N., GICQUEL B., VINCENT V.,

trans-criptional analysis of a 23-kilobase mycobacte-rial linear plasmid: evidence for horizontal trans-fer and identification of plasmid maintenance systems. J. Bacteriol. 183, 2157–2164.

MASAI E., SUGIYAMA K., IWASHITA N., SHIMIZU S., HAUSCHILD J. E., HATTA T., KIMBARA K., YANO K., FUKUDAM., 1997. The bphDEF meta-cleavage

pa-thway genes involved in biphenyl/polychlorina-ted biphenyl degradation are locabiphenyl/polychlorina-ted on a linear plasmid and separated from the initial bphACB genes in Rhodococcus sp. strain RHA1. Gene 187,

141–149.

MEIJERW. J., HORCAJADASJ. A., SALASM., 2001. Phi29

fa-mily of phages. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65,

261–287.

MEINHARDTF., SCHAFFRATHR., LARSENM., 1997.

Micro-bial linear plasmids. Appl. Microbiol. Biotechnol.

47, 329–336.

MUSIALOWSKIM. S., FLETTF., SCOTTG. B., HOBBSG., SMITH

C. P., OLIVERS. G., 1994. Functional evidence that

the principal DNA replication origin of the Strep-tomyces coelicolor chromosome is close to the dnaA-gyrB region. J. Bacteriol. 176, 5123–5125.

NETOLITZKYD. J., WUX., JENSENS. E., ROYK. L., 1995.

Giant linear plasmids of beta-lactam antibiotic producing Streptomyces. FEMS Microbiol. Lett.

131, 27–34.

PALMERN., FRASERC., CASJENSS., 2000. Distribution of

twelve linear extrachromosomal DNAs in natural isolates of Lyme disease spirochetes. J. Bacteriol.

182, 2476–2480.

PIZAK., PFALZERG., CULLUMJ., HRANUELID., 1997.

Physi-cal mapping shows that the unstable oxytetracyc-line gene cluster of Streptomyces rimosus lies close to one end of the linear chromosome.

Microbio-logy 143, 1493–1501.

PIZAS., BIUKOVICG., PARAVICA., DADBINA., CULLUM J., HRANUELID., 1998. Recombination between the

li-near plasmid pPZG101 and the lili-near chromoso-me of Streptomyces rimosus can lead to exCHANGe of ends. Mol. Microbiol. 28, 1165–1176.

PANGX., SUNY., LIUJ., ZHOUX., DENGZ., 2002. A linear

plasmid temperature-sensitive for replication in Streptomyces hygroscopicus 10-22. FEMS

Micro-biol. Lett. 208, 25–28.

PICARDEAUM., LEDANTECC., VINCENTV., 2000. Analysis

of the internal replication region of a mycobacte-rial linear plasmid. Microbiology 146, 305–313.

PICARDEAU M., VINCENT V., 1997. Characterization of

large linear plasmids in mycobacteria. J.

Bacte-riol. 179, 2753–2756.

PICARDEAUM., VINCENTV., 1998. Mycobacterial linear

plasmids have an invertron-like structure related to other linear replicons in actinomycetes.

Micro-biology 144, 1981–1988.

QINZ., COHENS. N., 1998. Replication at the telomeres

of the Streptomyces linear plasmid pSLA2. Mol.

Microbiol. 28, 893–903.

RAVELJ., DIRUGGIEROJ., ROBBF. T., HILLR. T., 2000.

Clo-ning and sequence analysis of the mercury resi-stance operon of Streptomyces sp. Strain CHR28 reveals a novel putative second regulatory gene. J.

Bacteriol. 182, 2345–2349.

RAVELJ., SCHREMPFH., HILLR. T., 1998. Mercury

resi-stance is encoded by transferable giant linear pla-smids in two chesapeake bay Streptomyces stra-ins. Appl. Environ. Microbiol. 64, 3383–3388.

RAVINN. V., STRAKHOVAT. S., KUPRIANOVV. V., 2001. The

protelomerase of the phage-plasmid N15 is re-sponsible for its maintenance in linear form. J.

Mol. Biol. 312, 899–906.

RAVINV., RAVINN., CASJENSS., FORDM. E., HATFULLG. F., HENDRIXR. W., 2000. Genomic sequence and

ana-lysis of the atypical temperate bacteriophage N15.

J. Mol. Biol. 299, 53–73.

REDENBACHM., BIBB M., GUST B., SEITZ B., SPYCHAJA., 1999. The linear plasmid SCP1 of Streptomyces

co-elicolor A3(2) possesses a centrally located repli-cation origin and shows significant homology to the transposon Tn4811. Plasmid 42, 174–185.

ROUSSELY., COLMINC., SIMONETJ. M., DECARISB., 1993.

Strain characterization, genome size and pla-smid content in the Lactobacillus acidophilus gro-up (Hansen i Mocquot). J. Appl. Bacteriol. 74,

549–556.

RYBCHINV. N., SVARCHEVSKYA. N., 1999. The plasmid

prophage N15: a linear DNA with covalently clo-sed ends. Mol. Microbiol. 33, 895–903.

SVEKI H., AKIRA M., FURUHASHI K., AVERHOFF B., GOTTSCHALKG., 1999. Degradation of

trichloroet-hene by a linear-plasmid-encoded alkene mo-nooxygenase in Rhodococcus corallinus (Nocar-dia corallina) B-276. Microbiology 145, 1721–1730.

SAKAGUCHIK., 1990. Invertrons, a class of structurally

and functionally related genetic elements that inc-ludes linear DNA plasmids, transposable ele-ments, and genomes of adeno-type viruses.

Micro-biol. Rev. 54, 66–74.

SALAS M., 1999. Mechanisms of initiation of linear

DNA replication in prokaryotes. Genet. Eng. 21,

159–171.

SHIFFMAN D., COHENS. N., 1992. Reconstruction of a

Streptomyces linear replicon from separately clo-ned DNA fragments: existence of a cryptic origin of circular replication within the linear plasmid.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6129–6133. SHIMIZU S., KOBAYASHIH., MASAI E., FUKUDA M., 2001.

Characterization of the 450-kb linear plasmid in a polychlorinated biphenyl degrader, Rhodococ-cus sp. strain RHA1. Appl. Environ. Microbiol. 67,

2021–2028.

SPATZK., KOHNH., REDENBACHM., 2002.

Characteriza-tion of the Streptomyces violaceoruber SANK95570 plasmids pSV1 and pSV2. FEMS

Microbiol. Lett. 213, 87–92.

STOLL A., HORVATL. I., LOPES-SHIKIDAS. A., PADILLA G., CULLUMJ., 2000. Isolation and cloning of

Strepto-myces terminal fragments. Antonie Van

Leeuwen-hoek, 78, 223–236.

TAKAHASHI Y., CUTLER S. J., FUKUNAGA M., 2000. Size

conversion of a linear plasmid in the relapsing fever agent Borrelia duttonii. Microbiol.

Immu-nol. 44, 1071–1074.

UZI., DUANY. P., OGRAMA., 2000. Characterization of

Rhodococ-cus opaRhodococ-cus M213. FEMS Microbiol. Lett. 185,

231–238.

VOLFFJ. N., ALTENBUCHNERJ., 2000. A new beginning

with new ends: linearisation of circular chromo-somes during bacterial evolution. FEMS

Micro-biol. Lett. 186, 143–150.

WIENERP., EGANS., HUDDLESTONA. S., WELLINGTONE. M., 1998. Evidence for transfer of

antibiotic-resistan-ce genes in soil populations of streptomyantibiotic-resistan-cetes.

Mol. Ecol. 7, 1205–1216.

WILLEMSH., JAGERC., BALJERG., 1998. Physical and

ge-netic map of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii. J. Bacteriol. 180, 3816–3822.

YANGC. C., HUANGC. H., LIC. Y., TSAYY. G., LEES. C., CHENC. W., 2002. The terminal proteins of linear

Streptomyces chromosomes and plasmids: a novel class of replication priming proteins. Mol.

Micro-biol. 43, 297–305.

YANGM. C., LOSCICKR., 2001. Cytological evidence for

association of the ends of the linear chromosome in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 183,

5180–5186.

ZAKRZEWSKA-CZERWINSKAJ., SCHREMPFH., 1992.

Charac-terization of an autonomously replicating region from the Streptomyces lividans chromosome. J.