Y
Prof. dr hab. M aria N ow akow ska
W ydział C hem ii
U niw ersytet Jagielloński
ul. R. Ingardena 3
tel: ( 4 8 12) 663 2250
em ail :no w akow s@ chem ia.uj.edu.pl
O C E N A
pracy dok torskiej Pana m gr inż. M ichała K w ietnia zatytułow anej:
„N ow e biod egrad ow aln e m ateriały polim erow e oparte o biopoliestry
alifatyczne i ich syn tetyczn e analogi dla zastosow ań w m edycynie - synteza i
charak terystyk a”
Praca doktorska Pana m gr inż. M ichała K w ietnia została przygotow ana w Centrum M ateriałów Polim erow ych i W ęglow ych Polskiej A kadem ii N auk w Zabrzu, pod opieką prom otorską Pani dr hab. G rażyny A dam us, profesora nadzw yczajnego PAN.
Celem badań zrealizow anych w ram ach niniejszej rozpraw y było opracowanie m etodologii oraz otrzym anie now ych, biodegradow alnych m ateriałów polim erow ych, charakteryzujących się pożądanym i w łaściw ościam i fizykochem icznym i, bazujących na m akrocząsteczkach o zaplanow anej i kontrolowanej strukturze, zaw ierających segmenty budulcow e biopoliestrów z grupy poli(hydroksyalkanianów ) (PAH). M akrocząsteczki te zsyntetyzow ano w ykorzystując uprzednio otrzym ane w procesie częściowej degradacji
oligom ery PHA o kontrolowanej średniej masie molowej i strukturze chemicznej grup końcowych. O ligom ery te pełniły funkcję m akrom onom erów w procesie polikondensacji z dichlorkiem kw asu sebacynow ego lub m akroinicjatorów polim eryzacji anionowej (3- butyrolaktonu.
Cel pracy został dobrze zdefiniow any, a tem atyka prow adzonych badań w pisuje się w aktualne, św iatow e trendy badaw cze. W ostatnich latach obserw uje się duże zainteresow anie syntezą dobrze zdefiniow anych biodegradow alnych materiałów polim erow ych. W ynika ono zarów no z potrzeby rozw iązyw ania problem ów środowiskow ych, będących skutkiem pow szechnego stosow ania syntetycznych m ateriałów polim erow ych, które po okresie ich zamierzonej eksploatacji ulegają bardzo powolnej, trudno kontrolow anej i niejednokrotnie przebiegającej z utw orzeniem niepożądanych (czasam i toksycznych) produktów degradacji, ja k rów nież, z rosnącego zainteresow ania m ożliw ościam i zastosow ania tych m ateriałów w obszarze biom edycyny. W yniki badań prow adzonych przez Pana m gr inż. K w ietnia m ogą być przydatne w obu tych obszarach, chociaż w niniejszej pracy A utor zaakcentow ał głównie m ożliw ości otrzym ania m ateriałów potencjalnie przydatnych do zastosow ań biom edycznych.
Pan m gr inż. K w iecień przygotow ał i przedstaw ił rozpraw ę doktorską w tradycyjnej formie zw artego, liczącego 130 stron opracowania. O tw iera je krótkie w prowadzenie, po którym następuje przegląd literatury, określenie celu i zakresu pracy, om ów ienie wyników, podsum ow anie i w skazanie najw ażniejszych osiągnięć, charakterystyka użytych materiałów, m etod i procedur badaw czych oraz spis literatury. Liczący 42 strony, przegląd literatury, prezentujący aktualny stan w iedzy w przedm iocie badań, podzielony został na sześć rozdziałów , w których D oktorant zaw arł najw ażniejsze inform acje dotyczące kolejno: naturalnych biopolim erów , ze szczególnym uw zględnieniem polihydroksyalkanianów , w łaściw ości, obszarów zastosow ań i m etod w ykorzystyw anych do m odyfikacji tej grupy polim erów, a także przybliżył zagadnienia dotyczące syntetycznych analogów biopoliestrów. W mej ocenie dobór zagadnień om aw ianych w tej części pracy je st praw idłow y i logiczny. W szystkie podjęte w ątki tem atyczne znajdują odniesienie w badaniach własnych prow adzonych przez D oktoranta. Prezentow ane zagadnienia om ów ione zostały jasno, a jednocześnie dostatecznie w yczerpująco i precyzyjne. Tę część rozpraw y przygotow ał Pan mgr inż. K w iecień na podstaw ie dobrze w yselekcjonow anych pozycji literaturowych - w liczbie 245. Lektura literaturowej części rozpraw y pozw ala mi stw ierdzić, że Doktorant
posiada do brą znajom ość aktualnego stanu w iedzy w przedm iocie prow adzonych przez N iego badań.
W części doświadczalnej pracy w yróżnić m ożna trzy, następujące po sobie sekwencje badawcze. W pierw szej z nich przedstaw iono w yniki badań nad otrzym ywaniem reaktywnych m akroinicjatorów i m akrom onom erów PHA w w yniku kontrolowanej degradacji polihydroksyalkanianów . I tak, stosując m etodę selektywnej redukcji polihydroksyalkanianów , w szczególności biopolim erów: poli(3-hydroksym aślan-ko-4-hydroksym aślanu) (P3H B 4H B ) i poli(3-aślan-ko-4-hydroksymaślan-Aw-3-hydroksyheksanianu) (PHBH) oraz polim eru syntetycznego, ataktycznego poli[(R,S)-3-hydroksym aślanu] ([R,S]PHB), przebiegającej przy użyciu borow odorku litu jak o czynnika redukującego otrzym ano oligoestrodiole, jed norodne oligom ery PHA zaw ierające w swej strukturze dwie hydroksylow e grupy końcow e. Prow adząc reakcje w tetrahydrofuranow ych roztworach polim erów o ustalonych stężeniach, w tem peraturze poniżej 20 C optym alizowano ich przebieg zm ieniając ilość dodanego czynnika redukującego. Strukturę otrzym anych produktów określano w oparciu o pom iary w idm m agnetycznego rezonansu protonow ego 'H N M R i wyniki pom iarów prow adzonych przy użyciu spektrom etrii m as z jo nizacją m etodą elektrorozpylania (ESI-M S). W artości średnich mas m olow ych oligom erów wyznaczano m etodą chrom atografii żelowej (GPC). W ykazano, że zaproponow ana m etoda degradacji m oże być zastosow ana do otrzym yw ania oligoestrodioli z polihydroksyalkanianów o zróżnicow anej budow ie chem icznej i różnej m ikrostrukturze łańcucha. Stw ierdzono także, iż m etoda cechuje się w ysokim stopniem specyficzności i prow adzi do otrzym ania teoretycznie przew idyw anych produktów degradacji. Ponadto stopień degradacji m oże być kontrolowany ilością czynnika redukującego w prow adzonego do środow iska reakcji.
Prow adzono także badania nad m ożliw ością w ykorzystania innej metody kontrolowanej degradacji polihydroksyalkanianów polegającej na indukowanej karboksylanam i term icznej degradacji tych polim erów. W badaniach w ykorzystano poli(3- hydroksymaślan-& o-4-hydroksym aślan) o liczbow o średniej m asie molowej 250 000 g/mol, zaw ierający 8,8 % m olow ych jednostek 4-hydroksym aślanu, którego degradację indukowano przy użyciu octanu potasu. Stw ierdzono, że w obecności octanu potasu proces degradacji przebiega ju ż w tem peraturze 180 C podczas gdy piroliza tego polim eru zachodzi w tem peraturze 290 C. Postęp degradacji był determ inow any czasem ekspozycji próbki na działanie podw yższonej tem peratury i m onitorow any poprzez pom iary w artości średnich mas m olow ych m etodą chrom atografii żelowej GPC. Strukturę otrzym anych oligom erów określano w oparciu o w yniki pom iarów w idm m agnetycznego rezonansu protonow ego i
spektrom etrii m as z jo n izacją m etodą elektrorozpylania. Przeprow adzone badania wykazały, że w w yniku procesu degradacji term icznej P3HB4HB indukow anej octanem potasu m ożliw ym je st otrzym anie pożądanych w dalszych badaniach liniow ych oligom erów zakończonych krotonianow ym i i karboksylanow ym i grupami końcow ym i. Tworzenie liniowych (a nie cyklicznych oligom erów ) potw ierdzono dodatkow o prow adząc reakcję estryfikacji grupy karboksylow ej trim etylosillilodiazom etanem . W oparciu o uzyskane wyniki postulow ano, że indukow ana octanem potasu, zdolnym do oderw ania protonu od w ęgla C2 jednostki konstytucyjnej 3HB biopoliestru P3HB4HB, degradacja term iczna tego polim eru przebiega zgodnie z m echanizm em a-deprotonacji. O trzym anie oligom erów o pożądanej m asie m olow ej m oże być kontrolow ane doborem czasu reakcji. W opisie warunków, w jak ich prow adzono proces degradacji nie znalazłam inform acji dotyczącej atm osfery, w której ona przebiegała, tzn. czy tw orzył j ą gaz obojętny czy też obecny był tlen. Jeśli proces był prow adzony w obecności tlenu istnieje obaw a o tw orzenie produktów ubocznych, szczególnie, że w procesie degradacji pow stają produkty zaw ierające nienasycone w iązania w ęgiel-w ęgiel.
N astępna, w m ym przekonaniu, bardzo interesująca i w artościow a sekwencja prow adzonych przez D oktoranta badań dotyczyła syntezy now ych m ateriałów polim erow ych zaw ierających segm enty strukturalne biopoliestrów . W pierw szym etapie prow adzono syntezę kopoliestrów na drodze kondensacji oligoestrodioli otrzym anych w procesie kontrolowanej redukcji poli(3-hydroksym aślanu-A:o-3-hydroksyheksanianu) (PH BH ) przy użyciu borow odorku litu PH BH o średnich m asach m olow ych w zakresie od 1200 do 3500 g/mol oraz dichlorku kw asu sebacynow ego. Proces polikondensacji prow adzono w masie, stosując rów nom olow y stosunek obu reagentów . Reakcję prow adzono, w tem peraturze 129 C pod zm niejszonym ciśnieniem 600 m m Hg. M asy m olow e uzyskanych polim erów oznaczano przy pom ocy chrom atografii żelowej zaś ich strukturę w oparciu o w yniki badań techniką węglowego rezonansu param agnetycznego 13C N M R. W w yniku prow adzonych syntez otrzym ano terpoliestry zaw ierające trzy rodzaje jednostek konstytucyjnych: jednostki 3- hydroksym aślanow e (3H B), jednostki 3-hydroksyheksanianow e (3HH) oraz jednostki konstytucyjne pochodzące od kw asu sebacynow ego (SEB). Dzięki wykorzystaniu oligoestrodioli różniących się średnią m asą m olow ą otrzym ano terpolim ery o zróżnicow anym składzie chem icznym , różniące się zasadniczo w łaściw ościam i term icznym i - temperaturami przejścia szklistego Tg, tem peraturam i topnienia Tm , ja k w ykazano stosując techniki DSC i TGA. Zsyntetyzow ane terpoliestry charakteryzują się w yższą stabilnością term iczną niż w yjściow y biopoliester PHBH. W raz ze w zrostem zaw artości jednostek konstytucyjnych
pochodzących od kw asu sebacynow ego obniża się w artość tem peratury przejścia szklistego. Co istotne, w kontekście m ożliw ych aplikacji, otrzym ane terpoliestry charakteryzują się znacznie niższym i w artościam i Tg niż bipolim er PHBH, przy zachow aniu relatywnie wysokiej w artości T m.
W kolejnym etapie badań opracow ano metodę syntezy kopolim erów blokowych poli(3-hydroksym aślan-£o-4-hydroksym aślan)-blok- poli(3-hydroksym aślan) (P3HB4HB- /j/o£-[R,S]PHB). Proces przebiegał poprzez inicjow aną m akroinicjatoram i anionow ą polim eryzację z otw arciem pierścienia laktonow ego P- butyrolaktonu. Użyte m akroinicjatory zakończone krotonianow ym i i karboksylanow ym i grupam i końcowymi otrzym ano w procesie kontrolowanej degradacji term icznej biopoliestru P3HB4HB indukowanej octanem tetrabutyloam oniow ym . Zsyntetyzow ano kopolim ery blokow eh P3H B 4H B -blok-[R,S]PH B zaw ierające bloki pochodzące od izotaktycznego biopoliestru P3HB4HB oraz od ataktycznego[R ,S]PH B .
O trzym ane kopolim ery blokow e P3HB4HB-ń/o&-[R,S]PHB o średniej m asie molowej w zakresie 7 100 do 12 300 g/m ol charakteryzow ano przy użyciu chrom atografii żelowej, param agnetycznego rezonansu jądrow ego, a także analizy term ograw im etrycznej i różnicowej kalorym etrii skaningowej. Strukturę blokow ą kopoliestrow potw ierdzono przeprow adzając selektyw ną ekstrakcję , stosując m etanol jak o selektyw ny rozpuszczalnik, rozpuszczający dobrze poli[(R ,S)-3-hydroksym aślan], zaś będący nierozpuszczalnikiem dla oligom erów P3H B 4H B, skorelow aną z pom iaram i w i d m ' H N M R. B adania kopolim erów blokow ych P31IB4H B -ń/oU aPH B prow adzone przy użyciu różnicowej kalorym etrii skaningowej w ykazały, że charakteryzują się one obecnością tylko jednej tem peratury przejścia szklistego Tg, której w artość znajduje się pom iędzy tym i w yznaczonym i dla m akroinicjatora i hom opolim eru [R.SjPH B i zależy od zaw artości poszczególnych bloków. W ykazano także, iż zaw artość poszczególnych bloków w pływ a na stopień krystaliczności kopolim eru - zasadniczo obecność bloków pochodzących od fragm entu [R,S]PHB obniża w sposób znaczący krystaliczność m ateriału. Badania degradacji hydrolitycznej otrzym anych kopolim erów blokow ych prow adzone w roztw orze buforow ym o pH = 7.4 w tem peraturze 70 C przez okres 80 dni potw ierdziły, że kopoliestry degradują szybciej niż biopoliester P3HB4HB i, że zgodnie z oczekiw aniam i, degradacji ulegają w pierwszej kolejności obszary am orficzne badanych m ateriałów . Powyższe obserw acje są istotne w kontekście możliwości planow ania syntezy m ateriału o pożądanych w łaściw ościach fizykochem icznych i podatności hydrolitycznej.
Trzecia sekw encja prow adzonych badań dotyczyła próby oceny możliwości zastosow ania otrzym anych m ateriałów polim erow ych w rozw iązyw aniu określonych problem ów biom edycznych. B adania te m ają charakter w stępnych studiów rozpoznawczych. Tak więc przeprow adzono badania nad w ykorzystaniem terpoliestrow poli(3HB-&o-3HH-A:o- SEB) do sporządzania trójw ym iarow ych porow atych rusztow ań do hodow li komórkowych. W tym celu form ułow ano z roztw oru polim eru w chlorku m etylenu obiekt trójw ym iarow y zaw ierający określoną ilość chlorku sodu. W ypłukanie chlorku sodu zapew niło porow atą strukturę m ateriału, co zobrazow ano przy użyciu m ikroskopii elektronowej SEM. M ateriał ten je st obecnie w ykorzystyw any w badaniach dotyczących hodow li kom órek w partnerskim laboratorium zagranicznym .
Podjęto także badania nad m ożliw ością w ykorzystania otrzym anych kopolim erów blokowych, w szczególności PH B -blok-[R,S]PH B zaw ierającego 80 % m olow ych bloku [R,S]PHB do uzyskania cienkich (7-8 pm) biodegradow alnych, chem okom patybilnych, elastycznych i w ytrzym ałych na naprężenia w ew nętrzne pow łok pokryw ających biom im etyczny poliuretan stosow any w badaniach nad konstrukcją protezy serca. W stępne badania w łaściw ości fizykochem icznych i m echanicznych tych pow łok, a także badań biologicznych (testy cytotoksyczności ) użytych polim erów oraz m odelow e badania dotyczące ich degradacji w sztucznym płynie fizjologicznym (SBF) są obiecujące. Badania te prow adzone są we w spółpracy z F undacją Rozwoju
K ardiochirurgii w ram ach Program u Polskie Sztuczne Serce i z pew nością są warte kontynuacji.
Prow adzono także badania nad w ykorzystaniem kopolim erów blokow ych PH A-b lo k - [R,S]PHB do uszczelniania protez naczyń krw ionośnych w ytw arzanych z włókien poliestrow ych. Pow ierzchnie kom ercyjnie dostępnych protez naczyniow ych D ALLO N R H pokryto w arstw ą kopolim eru blokow ego PHA-ó/cA-[R,SjPI IB m etodą elektroprzędzenia. Testy przepuszczalności w ody, przeprow adzone zgodnie z polską norm ą, w Instytucie B iopolim erów i W łókien Chem icznych w Łodzi były pozytyw ne i w ykazały, że naniesiona w arstw a polim eru w ykazuje pew ien efekt uszczelniający.
Wnioski końcowe.
Po starannym zapoznaniu się z rozpraw ą doktorską Pana m gr inż. M ichała Kwietnia stw ierdzam ,że głów ny cel pracy został dobrze zdefiniow any, a dobór m ateriału i metod
badaw czych pozw olił na jego realizację. Studia przeprow adzone w ram ach niniejszej pracy należą do głów nego, św iatow ego nurtu badań nad now ym i m ateriałam i polim erow ym i charakteryzującym i się pożądanym i w łaściw ościam i użytkowym i, w szczególności łączącymi unikalne cechy m ateriałów pochodzenia naturalnego z tym i charakterystycznym i dla m ateriałów syntetycznych, których strukturę m ożna planować w skali molekularnej. Zaprezentow ane w pracy badania m ają charakter studiów interdyscyplinarnych, w ym agających od D oktoranta dobrego przygotow ania i w iedzy z zakresu kilku gałęzi chemii, inżynierii m ateriałow ej i biologii. Pom yślna realizacja badań była m ożliw a dzięki zastosow aniu szeregu now oczesnych, kom plem entarnych technik badaw czych. D oktorant opanow ał zarów no podstaw y fizykochem iczne ja k i zdobył kom petencje instrum entalne um ożliw iające w łaściw y dobór technik badaw czych, przeprow adzenie pom iarów i interpretację w yników . W ykazał się dobrym przygotow aniem m erytorycznym i dużą spraw nością eksperym entalną. Praca napisana je st starannie a nieliczne błędy i potknięcia językow e nie u trudniają zrozum ienia głów nego nurtu narracji.
N a podstaw ie bazy danych Scopus ustaliłam, że Pan m gr inż. K wiecień je st w spółautorem 4 dotyczących ściśle problem atyki badań realizow anych w ram ach pracy doktorskiej publikacji w prestiżow ych specjalistycznych czasopism ach naukow ych takich jak:
Biomacromolecules, Polymer Degradation and Stability, European Polymer Journal.
Biorąc pod uw agę pow yższe uw ażam , ze spełnione są w arunki ustaw y o stopniach i tytułach naukow ych z dnia 14 m arca 2003 r. (Dz. U. nr 65) znow elizow anej w dniu 18 marca 2011 r. (Dz.U. 2011 nr 84 poz. 455) i w noszę do Rady W ydziału Chem icznego Politechniki Śląskiej o dopuszczenie Pana m gr inż. M ichała K w ietnia do dalszych etapów przew odu doktorskiego.
Jednocześnie, biorąc pod uw agę w ysoką w artość m erytoryczną pracy, fakt opublikow ania znacznej części zaw artych w niej w yników w uznanych specjalistycznych czasopism ach naukow ych w noszę oj ej w yróżnienie.
