Tie-2 expressing monocytes in chronic lymphocytic leukemia

(1)

Praca oryginalna/Original research article

Monocyty z ekspresją Tie-2 u chorych na przewlek łą bia łaczkę limfocytow ą

Tie-2 expressing monocytes in chronic lymphocytic leukemia

Agnieszka Bojarska-Junak

^1,

*, Piotr Grundszok

¹

, Ma łgorzata Waldowska

¹

, Justyna Wo ś

¹

, Sylwia Chocholska

²

, Iwona Hus

³

, Wioleta Kowalska

¹

, Katarzyna Gęca

¹

, Waldemar Tomczak

^2,4

, Jacek Roliński

¹

1KatedraiZakładImmunologiiKlinicznej,UniwersytetMedyczny,Kierownik:prof.drhab.n.med.JacekRoliński, Lublin,Polska

2KatedraiKlinikaHematoonkologiiiTransplantacjiSzpiku,UniwersytetMedyczny, Kierownik:drhab.n.med.MarekHus,Lublin,Polska

3SamodzielnaPracowniaTransplantologiiKlinicznej,UniwersytetMedyczny, Kierownik:prof.drhab.n.med.IwonaHus,Lublin,Polska

4KatedraInternyzZakłademPielęgniarstwaInternistycznego,UniwersytetMedyczny, Kierownik:prof.drhab.n.med.JadwigaDaniluk,Lublin,Polska

informacje o artykule

Historiaartykułu:

Otrzymano:14.07.2016 Zaakceptowano:08.08.2016 Dostępneonline:16.08.2016

Słowakluczowe:

przewlekłabiałaczkalimfocytowa

Tie-2

monocyty

TEM

CD38

ZAP-70

Keywords:

Chroniclymphocyticleukemia

Tie-2

monocytes

TEM

abstract

Introduction: Inperipheralblood, monocytesformaheterogeneous populationofcells.

Oneparticular subset ofcirculating monocytes is expressingthe angiopoietin receptor Tie-2(Tie2-expressingmonocyte;TEM).TEMarecharacterizedbytumorpromotingpro- perties.However,theroleofTEMinchroniclymphocyticleukemia(CLL)immunopatho- genesisremains undeﬁned. Material and Methods: Here,we evaluated the monocytes withTie-2expression(CD14⁺Tie-2⁺)inperipheralbloodofCLLpatients(n=55)andnor- malsubjects(n=15) byﬂowcytometry.Weinvestigated possibleassociationsbetween TEMandpoorprognosticfactorssuchasCD38orZAP-70expression,Raistageandunfa- vorablecytogeneticabnormalities.Moreover,weinvestigatedtheassociationofTEMper- centagewithCD14⁺⁺CD16⁺monocytesandTregpercentages.Results:WefoundthatCLL patientshad a higher percentage ofCD14⁺Tie-2⁺monocytes compared tonormal controls.ThepercentageofTEMwaspositivelyassociatedwithZAP-70expressionaswellas withunfavourablecytogeneticchanges:del(17p) and/ordel(11q).The frequencyofTEM increasedwiththedisease stage.Weshowednocorrelationbetweenthepercentageof TEM and CD38 expression. The percentage of TEM at diagnosis was associated with whiteblood cellcountaswellas withthepercentagesofCD19⁺CD5⁺lymphocytesand Tregs.ThemajorityofCD14⁺Tie-2⁺cellsbelongedtotheintermediatemonocytessubset (CD14⁺⁺CD16⁺)whilefewerofthemwereamongtheclassical(CD14⁺⁺CD16 )ornon-classical monocyte (CD14⁺CD16⁺⁺) subsets. TEM and CD14⁺⁺CD16⁺ monocytes have

*Adresdokorespondencji:KatedraiZakładImmunologiiKlinicznejUMwLublinie,ul.Chodźki4a,20-093Lublin,Polska.

Tel.:+48814486420.

Adresemail:abojarskajunak@gmail.com(A.Bojarska-Junak).

ContentslistsavailableatScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journalhomepage:www.elsevier.com/locate/achaem

http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2016.08.001

zo.o.Allrightsreserved.

(2)

Wstęp

Licznedanewskazują,żezaburzeniaimmunologiczneobser- wowane u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową (PBL) dotyczą nie tylko limfocytów B. Nieprawidłowości obserwuje siępraktycznie we wszystkichelementach odpo- wiedzi humoralnej i komórkowej [1, 2]. Istotną rolę wpatogenezietejjednostkichorobowejwydająsięodgrywać monocyty oraz wywodzące się z nich makrofagi [2, 3].

U chorych na PBL wykazano istotną zależność pomiędzy monocytozą stwierdzoną w momencie diagnozy a krótkim czasem odrozpoznaniado rozpoczęcia leczenia orazcałko- witymczasemprzeżycia.Ponadtozaobserwowano,żemono- cytoza wiąże się z występowaniem aberracji chromosomowych: del(17p) i del(11q). Wysoka liczba monocytów wiąże sięrównieżz wyższymstadiumzaawansowaniaklinicznego ocenianego według skali Bineta oraz stanem mutacji IGVH (immunoglobulin variableheavychain genes)[3].Jednak, mono- cytywciążpozostająjednymiznajsłabiejpoznanychskłado- wychukładuimmunologicznegowpatogeneziePBL.

Wartopodkreślić,żerolamonocytówwodpowiedziprze- ciwnowotworowej nie jest jednoznaczna. W wyniku kon- taktuzkomórkaminowotworowymimogąwytwarzaćczyn- niki zarówno pro-, jak i przeciwnowotworowe. Ponadto badaniaostatnichlatdowiodły,żemonocytyznajdującesię we krwiobwodowej sąheterogenną populacją komórek[4, 5]. Część z puli krążących we krwi monocytów ma na powierzchni receptor dla angiopoetyn (Tie-2). Populacja ta określana jestjakomonocytyzekspresjąTie-2(Tie-2-expressing monocytes; TEM), wykazujące właściwości proangio- genne.WwarunkachﬁzjologicznychpopulacjaTEMstanowi ok. 20%populacji monocytów[6]. LiczbaTEM możejednak istotnie wzrastać w różnych stanach patologicznych, np.

wchorobienowotworowej[6,7].

Sugerujesię,żeTEMsągrupąniedojrzałychmonocytów, które mogą być prekursorami makrofagów tkankowych [8, 9]. U chorych z nowotworem obecność TEM wykazano we krwiobwodoweji,cociekawe,równieżwobrębienowotwo- ru. TEMsą trudno wykrywalne w prawidłowych, nienowo- tworowych tkankach [9, 10]. Stymulacja angiogenezy to prawdopodobniekluczowarolaTEMwprogresjinowotworu.

TEM uwalniają bFGF – cytokinę zaangażowaną w proces ﬁzjologicznej i patologicznej angiogenezy [11]. Molekularne podstawy aktywności proangiogennej tej subpopulacji monocytów wciąż jednak nie sąw pełni wyjaśnione.Wia- domo,żeliczebnośćiaktywnośćmonocytówTie-2-pozytyw- nych jest bezpośrednio zależna od angiopoetyny-2 (Ang-2) [7, 12]. TEM migrują ku Ang-2 uwalnianej m.in. przez aktywowanekomórkiśródbłonkainowo powstałenaczynia w obrębie guza, co sugeruje mechanizm naprowadzający

TEM do tkanki nowotworowej [9]. Co ciekawe, limfocyty białaczkowewPBLwydzielająAng-2[13]. Wzwiązkuz tym funkcjaTEMmoże zależećtakżeodkomórekPBL.Zaobser- wowano, że Ang-2 wpływa na syntezę cytokin przez TEM, m.in.hamujeuwalnianieprozapalnegoTNF[14,15]orazIL- 12 cytokiny o silnym działaniu antyangiogennym [14].

Wykazano również, że wysoki poziom Ang-2 wiąże się zkrótszymczasemodrozpoznaniadorozpoczęcialeczenia, ma związek z agresywnym przebiegiem choroby i szybką progresjąPBL[13].Ostatniedoniesieniawskazują,żemono- cytyzekspresjąTie-2hamująodpowiedźT-komórkowąoraz zwiększają powstawanie limfocytów T regulatorowych (Treg). Przypuszcza się, że ma to bezpośredni związek zaktywnościąIL-10.Cytokinąodziałaniuprzeciwzapalnym, uwalnianąprzeztęsubpopulacjęmonocytów[7,16].

W aktualnej literaturze istnieje tylko jedno doniesienie dotyczące TEM u chorych na PBL. Wskazuje się, że liczba tych komórek jest silnie związana z nieprawidłowościami cytogenetycznymi, takimi jak delecja 17p [16]. Niemniej jednak,badanianadznaczeniemTEMwbiologiiipatogene- ziePBLsąbardzonieliczne.

Materiał i metody

Charakterystykachorych

Badaniemobjętogrupę55chorych(29mężczyzni26kobiet) wmomencierozpoznaniaPBL,hospitalizowanychwKated- rze iKliniceHematoonkologii iTransplantacjiSzpikuUni- wersytetu Medycznego w Lublinie. Badani chorzy znajdo- wali się w różnych stadiach zaawansowania klinicznego chorobywedługRai’a.Stadium0stwierdzonou20chorych, stadiumIu18chorych,stadiumIIu7chorych,stadiumIII u6chorych,astadiumIVu4chorych.Chorychpodzielono na trzy grupy według zmodyﬁkowanej klasyﬁkacji Rai’a:

grupę niskiego ryzyka (st. 0), grupę pośredniego ryzyka (st.I/II)orazgrupęwysokiegoryzyka(st.III/IV).Charaktery- stykęocenianychchorychnaPBLprzedstawionowTabeliI.

Grupę kontrolną stanowiło 15 zdrowych dawców (9 męż- czyzn i6kobiet)wwiekuod32do85lat(mediana56lat).

BadanieuzyskałozgodęKomisjiBioetycznejprzyUniwersy- tecieMedycznymw Lublinie(nrKE-0254/107/2013orazKE- 0254/52/2016). Wszyscychorzy wyrazili pisemną zgodęna udziałwbadaniu.

Materiałdobadań

Materiał do badań stanowiła krew obwodowa, pobrana na EDTA.Materiałuzyskiwanoodchorychpodczasrutynowych badańdiagnostycznych.

CD38

ZAP-70

a proangiogenic activity, suppress T-cell activation and promote Treg expansion. The resultssuggestthatmonitoringofTEMnumberandfunctionmayprovideusefulinfor- mationindeterminingdiseaseactivity.

(3)

OcenamonocytówCD14⁺Tie-2⁺

Ekspresję antygenów powierzchniowych monocytów oce- nionometodącytometrii przepływowej.Badanie wykonano

z użyciemkrwipełnej. Krewobwodowąpoddawano znako- waniu przeciwciałami monoklonalnymi: anty-CD14 FITC, anty-CD16 PE-Cy5 (BD Pharmingen) oraz anty-CD202b PE (Tie-2/Tek) (BioLegend). Przeciwciała stosowano w ilości zgodnejzzaleceniamiproducenta.Po20minutachinkubacji (temperatura pokojowa, w ciemności) przeprowadzano lizę erytrocytów roztworem FACS Lysing Solution (Becton Dic- kinson). Podwukrotnymodpłukaniu roztworemPBS próbki oceniano w cytometrze przepływowym. Do ocenymonocy- tów CD14⁺Tie-2⁺ wykorzystano cytometr przepływowy BD FACSCalibur^TM(BDBiosciences).Oceniono odsetekmonocy- tów z ekspresją Tie-2 pośród komórek CD14+ (Ryc. 1).

Ponadto oceniono odsetek komórek CD14⁺Tie-2⁺ pośród subpopulacjimonocytówCD14⁺⁺CD16 (monocytyklasyczne), CD14⁺⁺CD16⁺ (monocyty pośrednie) oraz CD14⁺CD16⁺⁺

(monocyty nieklasyczne). Do analizyorazgraﬁcznejprezen- tacjidanychwykorzystanoprogramCellQuestPro.

OznaczeniaodsetkalimfocytówTregCD4⁺CD25^hifhFOXP3⁺

Odsetek limfocytów T CD4⁺CD25^high/FOXP3⁺ oznaczono za pomocąHumanTregFlow^TMKit(FOXP3AlexaFluor488/CD4 PE-Cy5/CD25 PE) ﬁrmy BioLegend. Znakowanie limfocytów Treg przeprowadzono zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta.

OcenaekspresjiZAP-70iCD38

Ocenę ekspresji ZAP-70 w limfocytach CD19+/CD5+ we wszystkichbadanychpróbkachprzeprowadzonoza pomocą przeciwciał monoklonalnych: anty-CD19 FITC, anty-ZAP-70 PE(klon1E7.2)orazanty-CD5PE-Cy5(BDPharmingen,USA).

DoocenyekspresjiCD38użytoprzeciwciałmonoklonalnych:

anty-CD19 FITC, anty-CD38, PE anty-CD5 PE-Cy5 (BD Phar- mingen,USA).

TabelaI–CharakterystykachorychnaPBL TableI–CharacteristicsofCLLpatients

Liczbachorych(%) Grupyryzyka

Grupaniskiegoryzyka(st.0) 20(36,4) Grupapośredniegoryzyka(st.I/II) 25(45,4) Grupawysokiegoryzyka(st.III/IV) 10(18,2) ZAP-70(wartośćodcięcia20%)

dodatni 21(38,2)

ujemni 34(61,8)

CD38(wartośćodcięcia30%)

dodatni 18(32,7)

ujemni 37(67,3)

Aberracjecytogenetyczne

del(17p13.1)i/lubdel(11q22.3) 10(18,2) bezdel(17p13.1)i/lubdel(11q22.3)) 37(67,3)

Nieokreślono 8(14,5)

mediana (minimum–maksimum)

Wiek(lata) 65(49–87)

WBC(G/L) 26,59(10,11–194,54)

Limfocytoza(G/L) 20,30(5,51–181,09)

b2M(mg/dL) 2,39(1,36–5,86)

LDH(IU/L) 373(266–839)

Hemoglobina(g/dL) 13,95(8,10–17,20)

PLT(G/L) 199(49–399)

CD19+/CD5+/ZAP-70+(%) 14,64(0,21–44,29) CD19+/CD5+/CD38+(%) 9,42(0,22–80,90)

WBC–liczbakrwinekbiałych(whitebloodcell),leukocytoza;LDH– dehydrogenaza mleczanowa (Lactate dehydrogenase); b2M – b2- microglobulina;PLT–płytkikrwi

Ryc.1–PrzykładowyobrazzcytometruprzepływowegoprzedstawiającyanalizęmonocytówCD14+wykazującychekspresję Tie-2.(A)UkładFSC/SSC–ustanowieniebramki(regionR1)dlamonocytów.(B)Pośródkomórekzgromadzonychwregionie R1wyodrębnianokomórkiCD14⁺(regionR2).(C)KońcowyobrazprzedstawiającykomórkiwukładzieCD14FITC/Tie-2PE zawierakomórkizrejonówR1iR2.KomórkiwprawymgórnymroguprzedstawiająodsetekmonocytówCD14+zekspresją Tie-2(CD14⁺Tie-2⁺;TEM)

Fig.1–TheflowcytometrydotplotsshowingtheanalysisofthepercentageofCD14⁺monocyteswithTie-2expression(CD14⁺Tie-2⁺; TEM).(A)ThedotplotshowsFSC/SSCdistributionandthegate(regionR1)usedtoselectmonocytes.(B)TheR1gateeventswerethen analyzedforCD14expression.CD14+cellsweregated(regionR2).(C)ThefinaldotplotCD14FITC/Tie-2PEwasestablishedby combinedgatingofeventsusingR1andR2.ThenumberinupperrightquadrantonthedotplotrepresentpercentageofCD14+

monocyteswithTie-2expression(CD14⁺Tie-2⁺;TEM)

(4)

Wartość odcięcia (punkt cut-off) dla komórek białaczko- wych z ekspresja ZAP-70 wynosiła 20%, natomiast dla komórekbiałaczkowychzekspresjaCD3830%.

Analiza statystyczna

Do analizy statystycznej uzyskanych wyników wykorzystano program Statistica 10.0 PL. W celu oceny różnic pomiędzy grupami wykorzystano test nieparametryczny UManna-Whitneya. Istnienie związkówstatystycznych po- między zmiennymi oceniano, wyznaczając współczynnik korelacjirangSpearmana.Zaistotnestatystycznieuznawa- nowyniki,którychprógpoziomuistotnościbyłp<0,05.

Wyniki i omówienie

W patogenezie wielu chorób nowotworowych wykazano naciekanie nowotworu przezmonocyty/makrofagi. Wprze- wlekłej białaczce limfocytowej monocytoza wiąże się z niekorzystnymrokowaniem [3,17]. Zaobserwowanorów- nież,żewPBLmonocytyzapośrednictwemcząsteczkiCD14 lub jej rozpuszczalnej formy sCD14 chronią białaczkowe limfocytyB przed śmierciąnadrodzeapoptozy[18]. Mono- cyty stanowią heterogenną populacjękomórek wykazującą m.in.zróżnicowanąekspresjęcząsteczekCD16iCD14[4,5].

Ponadtoczęśćz pulikrążącychwe krwimonocytówmana powierzchni receptor Tie-2[6]. Badania określające znacze- nieposzczególnychsubpopulacjimonocytówwpatogenezie PBLsąjednakbardzonieliczne.

W przeprowadzonych badaniach oceniono monocyty CD14⁺Tie-2⁺ (TEM) u chorych na PBL. Wykazano istotnie wyższyodsetekTEMuchorychnaPBL(mediana15,47%)niż u zdrowych dawców (mediana: 2,90%) (p<0,001) (Ryc. 2).

Ponadto, stwierdzono znamiennie niższy odsetek komórek CD14⁺Tie-2⁺uchorychzakwaliﬁkowanychdogrupyniskiego ryzyka (stadium 0 wg Rai’a) w porównaniu z grupą owysokimstopniuryzyka(stadiumIII–IVwgRai’a)(p<0,01) (Ryc. 3). Nie wykazano natomiast istotnych statystycznie

różnic w odsetku monocytów CD14⁺Tie-2⁺ pomiędzy grupą chorych w stadium0agrupąw stadiumI/II(Ryc.3).Maffei i wsp.[16] wykazali wzrostliczby TEMwe krwiobwodowej chorych na PBL. Autorzy nie wykazali jednak zależności pomiędzyliczbąTEMastopniemzaawansowaniaklinicznego PBL.

Obecność specyﬁcznych aberracji chromosomowych, w szczególności del(17p)czy del(11q) jest jednym z niekorzystnych czynnikówrokowniczych w PBL [19]. Wprzepro- wadzonej analizie porównano odsetek TEM u chorych z niekorzystnymi zmianami cytogenetycznymi del(17p13.1) i/lub del(11q22.3) zodsetkiem występującym w grupiecho- rych bez tych niekorzystnych aberracji (Ryc. 4). W grupie chorychwykazującychobecnośćdelecji17pi/lub11qstwier- dzono znamienniewyższyodsetek monocytówCD14⁺Tie-2⁺ (mediana: 17,5% vs 9,02%) (p<0,05) (Ryc. 4). Wyniki te są zgodne z rezultatami badań Maffei i wsp. [16], którzy wykazaliwyższąliczbęTEMuchorychzdelecją17p.

U wszystkich ocenianych chorych na PBL oznaczono ekspresję markera CD38 oraz określono wewnątrzkomór- kową ekspresję białka ZAP-70 w komórkach CD19⁺/CD5⁺. W przeprowadzonej analizie wykazano dodatnią korelację pomiędzy ekspresją ZAP-70 a odsetkiem monocytów CD14⁺Tie-2⁺ (p<0,001). Wykazanoistotnie wyższy odsetek TEMwśródmonocytówCD14+uchorychZAP-70+(mediana:

17,37%) w porównaniuz chorymiZAP-70- (mediana: 7,69%) (Ryc. 5A). Jednak analogicznie do badań Maffei i wsp. [16]

nie zaobserwowano zależności pomiędzy odsetkiem TEM aekspresjąCD38(Ryc.5B).

Wprzeprowadzonychbadaniachniewykazanoistotnych statystycznie zależności pomiędzy odsetkiem TEM a po- ziomem b2-mikroglobuliny, liczbą płytek krwi, stężeniem hemoglobiny lub aktywnością LDH w surowicy. Nie stwierdzono także statystycznie istotnych zależności pomię- dzy odsetkiemTEMawiekiemchorych. Odnotowano natomiast istotną statystycznie zależność pomiędzy odsetkiem CD14⁺Tie-2⁺ a leukocytozą (R=0,324; p<0,05) (Ryc. 6A).

Ryc.2–OdsetekTEMuchorychnaPBLorazwgrupie kontrolnej

Fig.2–ThepercentageofTEMinCLLpatientsandhealth controls

Ryc.3–OdsetekTEMuchorychnaPBLznajdującychsię wróżnychstadiachzaawansowaniawgRaiiwsp.

Fig.3–ThepercentageofTEMinCLLpatientsindifferent stagesofdisease

(5)

Przeciwnie, Maffei iwsp. [16]nie wykazaliistotnychzależ- ności pomiędzy liczbą TEM a WBC. Warto jednak zwrócić uwagę,żebadaczeocenialimniejsząliczbęchorych(n=26) w porównaniu z liczbąchorych przebadanych w niniejszej pracy(n=55).Wprzeprowadzonychbadaniachnieoceniano wpływu TEM na przeżycie komórek PBL. Zaobserwowano jednak, że odsetek monocytów z ekspresją Tie-2 dodatnio koreluje nie tylko z leukocytozą, ale także z odsetkiem białaczkowychlimfocytówBCD5⁺/CD19⁺ (R=0,350;p<0,05) (Ryc.6B).

Przeżycie limfocytów PBL przypuszczalnie zależy od wzmożonego wydzielania immunosupresyjnych cytokin, m.in. IL-10 oraz TGF-b. Cytokiny te uwalniane sązarówno przez białaczkowe limfocyty B, jak i przez komórki wcho- dzącewskładmikrośrodowiskawtymmonocyty[1].Jakjuż wspomniano,istotnymźródłemIL-10(indukującejekspansję Treg) mogą być monocyty z ekspresją Tie-2, [7, 12, 16].

W PBL obserwuje się akumulację Treg, a odsetek tych limfocytów często wiąże się ze stadium zaawansowania klinicznego oraz gorszą prognozą [20]. W przeprowadzonej analizie wykazano u chorych na PBL istotną zależność Ryc.5–OdsetekTEMuchorychnaPBLwykazującychróżną

ekspresjęantygenówZAP-70iCD38

Fig.5–ThepercentageofTEMinCLLpatientswithdifferent ZAP-70andCD38antigenexpression

Ryc.4–OdsetekTEMuchorychnaPBLwzależnościod występowaniaaberracjichromosomowych:del(11q)i/lub del(17p)

Fig.4–ThepercentageofTEMinCLLpatientssubdivided accordingtocytogeneticaberrationsdel(11q)or/anddel(17p)

Ryc.6–ZależnośćpomiędzyodsetkiemTEM(CD14⁺Tie2⁺)a leukocytozą(A)orazodsetkiemlimfocytówCD19⁺CD5⁺(B) Fig.6–TherelationshipbetweenpercentageofTEM

(CD14⁺Tie2⁺)andwhitebloodcellcount(A)andpercentageof CD19⁺CD5⁺cells(B)

(6)

pomiędzy odsetkiem TEM a odsetkiem limfocytów Treg (CD4⁺CD25^highFOXP3⁺) (R=0,306; p<0,05). Warto przypom- nieć, że komórki PBL wydzielają znaczne ilości angiopoetyny-2[13], która z kolei jest bezpośrednioodpowiedzialna zawzrostliczebnościiaktywnośćTEM[7,12].Ponadto,TEM sąodpowiedzialne za hamowanie proliferacji limfocytów T iosłabienieodpowiedzi Tkomórkowejtak istotnej wzwal- czaniunowotworu[12].

DoistotnychmechanizmówzwiązanychzpatogeneząPBL należą również zaburzenia związane z angiogenezą [21–24]. Ostatnielatapokazały kluczoweznaczenietegoprocesu nie tylkowrozwojuguzówlitych,alerównieżwpatomechaniz- mie nowotworów limfoproliferacyjnych w tym PBL [21, 22].

U chorych na PBLstwierdzono zwiększoną gęstość unaczy- nienia węzłów chłonnych [21]. Zwiększone unaczynienie obserwowanorównieżwszpikukostnym[22].Zaobserwowa- no,żezwiększoneunaczynieniewszpikuunowozdiagnozo- wanych chorych, znajdujących się we wczesnym stadium PBL, wiąże się z większym ryzykiem do progresji choroby [22]. Stymulacja angiogenezy to prawdopodobnie kluczowa rolaTEMwprogresjinowotworu.MonocytyzekspresjąTie-2 uwalniająbFGFzaangażowanywprocesangiogenezy[6, 11].

Uchorych naPBLpodwyższonypoziombFGF związanyjest ze stadium zaawansowania choroby [21]. Ponadto, wysokie stężeniebFGFzwiązanejestzwydłużonymczasemprzeżycia białaczkowych limfocytów oraz niekorzystnym przebiegiem choroby [23, 24]. W przeprowadzonych badaniach nie oceniano związku TEM z angiogenezą w PBL. Zaobserwowano natomiast dodatnią korelację pomiędzy odsetkiem TEM

aodsetkiemmonocytówpośrednich(CD14⁺⁺CD16⁺)(R=0,378;

p<0,05) (Ryc.7A). Ostatniebadania wykazały, żeto monocyty pośrednie stanowią subpopulację o właściwościach proangiogennych. Ponadto, monocyty CD14⁺⁺CD16⁺ analo- giczniedoTEMhamująodpowiedźT-komórkowąorazsymu- lująpowstawanielimfocytówTreg.Jesttowięcsubpopulacja monocytów,którasprzyjarozwojowinowotworu[16].Reasu- mując, najwyższy odsetek monocytów z ekspresją Tie-2 wykazano pośród monocytów pośrednich (CD14⁺⁺CD16⁺) (mediana:16,85%).Podczasgdymniejichbyłopośródmono- cytów klasycznych (mediana: 11,82%) lub nieklasycznych (mediana: 3,83%) (Ryc. 7B). Z wynikami tymi koresponduje rezultat badań Maffei i wsp. [16], którzy również wykazali istotniewyższyodsetekmonocytówzekspresjąTie-2pośród subpopulacjimonocytówpośrednich.

Wnioski

Podsumowując uzyskane wyniki badań, należy sądzić, że TEM odgrywają istotną rolę w patogenezie PBL. Na dalszą ocenę zasługuje przeprowadzenie badań funkcjonalnych i analiza aktywności monocytów Tie-2⁺. Niemniej jednak, uchorychnaPBLodsetekTEMkorelujezczynnikamiryzyka (ekspresja ZAP-70,del(17p) i/lubdel(11q), stadiumwgRai’a).

Ponadto, odsetek CD14⁺Tie-2⁺ koreluje z leukocytozą oraz odsetkiem białaczkowychlimfocytówCD19⁺CD5⁺.Prawdopo- dobnieTEMmająistotneznaczeniewakumulacjilimfocytów nowotworowych w PBL. Przypuszczalnie, monitorowanie Ryc.7–ZależnośćpomiędzyodsetkiemTEM(CD14⁺Tie2⁺)aodsetkiemmonocytówpośrednichuchorychnaPBL(A).

OdsetekmonocytówTie-2⁺pośródmonocytówklasycznych(CD14⁺⁺CD16^S)pośrednich(CD14⁺⁺CD16⁺)inieklasycznych (CD14⁺CD16⁺⁺)(B)

Fig.7–TherelationshipbetweenpercentageofTEM(CD14⁺Tie2⁺)andpercentageofintermediatemonocytessubset.Thepercentage ofTie-2⁺monocytesamongtheclassical(CD14⁺⁺CD16^S),intermediate(CD14⁺⁺CD16⁺)andnon-classical(CD14⁺CD16⁺⁺)monocyte subsets(B)

(7)

liczbyifunkcjitejsubpopulacjimonocytówmożedostarczyć informacji określających aktywność choroby. Istotna zależ- nośćpomiędzyodsetkiemTEMaodsetkiemlimfocytówTreg możepotwierdzaćimmunosupresyjnewłaściwościCD14⁺Tie- 2. W związku z korelacją pomiędzy odsetkiem TEM aodsetkiemmonocytówpośrednichCD14⁺⁺CD16⁺(mających właściwościproangiogenne)uzasadnionejestkontynuowanie badańnadwpływemTEMnaangiogenezęwPBL.

Wkład autorów/Authors’ contributions

Wedługkolejności.

Konﬂikt interesu/Conﬂict of interest

Niewystępuje.

Finansowanie/Financial support

Pracanaukowaﬁnansowanazaśrodkówprzeznaczonychna badanie statutowe nr Ds. 458 Uniwersytetu Medycznego wLublinie.Pracapowstałaz wykorzystaniemsprzętuzaku- pionego w ramach Projektu „Wyposażenie innowacyjnych laboratoriów prowadzących badania nad nowymi lekami stosowanymiwterapiichoróbcywilizacyjnychinowotworo- wych” w ramach Programu Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej2007–2013,OsipriorytetowejINowoczesnaGos- podarka,DziałaniaI.3WspieranieInnowacji.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami DeklaracjiHelsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.

pi smiennictwo/references

[1] Caligaris-CappioF.Inﬂammation,themicroenvironment andchroniclymphocyticleukemia.Haematologica 2011;96:353–355.

[2] ŁapućI,EljaszewiczA,KłoczkoJ,MoniuszkoM.Rola monocytówwpatogenezieprzewlekłejbiałaczki limfocytowej.ActaHaematolPol2014;45:340–346.

[3] MazumdarR,EvansP,CulpinR,BaileyJ,AllsupD.The automatedmonocytecountisindependentlypredictiveof overallsurvivalfromdiagnosisinchroniclymphocytic leukaemiaandofsurvivalfollowingﬁrst-line chemotherapy.LeukRes2013;37:614–618.

[4] ItalianiP,BoraschiD.FromMonocytestoM1/M2 Macrophages:Phenotypicalvs.FunctionalDifferentiation.

FrontImmunol2014;5:514.eCollection2014.

[5] Ziegler-HeitbrockL,AncutaP,CroweS,DalodM,GrauV, HartDN,etal.Nomenclatureofmonocytesanddendritic cellsinblood.Blood2010;116:e74–e80.

[6] DePalmaM,MurdochC,VenneriMA,NaldiniL,LewisCE.

Tie2-expressingmonocytes:regulationoftumor

angiogenesisandtherapeuticimplications.Trends Immunol2007;28:519–524.

[7] CoffeltSB,TalAO,ScholzA,DePalmaM,PatelS,UrbichC, etal.Angiopoietin-2regulatesgeneexpressioninTIE2- expressingmonocytesandaugmentstheirinherent proangiogenicfunctions.CancerRes2010;70:5270–5280.

[8] GeissmannF,JungS,LittmanDR.Bloodmonocytesconsist oftwoprincipalsubsetswithdistinctmigratoryproperties.

Immunity2003;19:71–82.

[9] VenneriMA,DePalmaM,PonzoniM,PucciF,ScielzoC, ZonariE,etal.IdentiﬁcationofproangiogenicTIE2- expressingmonocytes(TEMs)inhumanperipheralblood andcancer.Blood2007;109:5276–5285.

[10] BronS,HenryL,Faes-Van’tHullE,TurriniR,VanheckeD, GuexN,etal.TIE-2-expressingmonocytesare

lymphangiogenicandassociatespeciﬁcallywith lymphaticsofhumanbreastcancer.Oncoimmunology 2015;5:e1073882.eCollection2016.

[11] DePalmaM,VenneriMA,GalliR,SergiSergiL,PolitiLS, SampaolesiM,etal.Tie2identiﬁesahematopoieticlineage ofproangiogenicmonocytesrequiredfortumorvessel formationandamesenchymalpopulationofpericyte progenitors.CancerCell2005;8:211–226.

[12] CoffeltSB,ChenYY,MuthanaM,WelfordAF,TalAO,Scholz A,etal.Angiopoietin2stimulatesTIE2-expressing monocytestosuppressTcellactivationandtopromote regulatoryTcellexpansion.JImmunol2011;186:4183–4190.

[13] MaffeiR,MartinelliS,CastelliI,SantachiaraR,ZucchiniP, FontanaM,etal.Increasedangiogenesisinducedby chroniclymphocyticleukemiaBcellsismediatedby leukemia-derivedAng2andVEGF.LeukRes2010;34:

312–321.

[14] LewisCE,DePalmaM,NaldiniL.Tie2-expressing

monocytesandtumorangiogenesis:regulationbyhypoxia andangiopoietin-2.CancerRes2007;67:8429–8432.

[15] MurdochC,TazzymanS,WebsterS,LewisCE.Expressionof Tie-2byhumanmonocytesandtheirresponsesto angiopoietin-2.JImmunol2007;178:7405–7411.

[16] MaffeiR,BulgarelliJ,FiorcariS,BertoncelliL,MartinelliS, GuarnottaC,etal.Themonocyticpopulationinchronic lymphocyticleukemiashowsalteredcompositionand deregulationofgenesinvolvedinphagocytosisand inﬂammation.Haematologica2013;98:1115–1123.

[17] HerishanuY,KayS,SaridN,KohanP,BraunsteinR,Rotman R,etal.Absolutemonocytecounttrichotomizeschronic lymphocyticleukemiaintohighriskpatientswithimmune dysregulation,diseaseprogressionandpoorsurvival.

LeukemiaResearch2013;37:1222–1228.

[18] SeiffertM,SchulzA,OhlS,DöhnerH,StilgenbauerS, LichterP.SolubleCD14isanovelmonocyte-derived survivalfactorforchroniclymphocyticleukemiacells, whichisinducedbyCLLcellsinvitroandpresentat abnormallyhighlevelsinvivo.Blood2010;116:4223–4230.

[19] StilgenbauerS,BullingerL,LichterP,DöhnerH,GermanCLL StudyGroup(GCLLSG).Chroniclymphocyticleukemia.

Geneticsofchroniclymphocytic

leukemia:genomicaberrationsandV(H)genemutation statusinpathogenesisandclinicalcourse.Leukemia 2002;16:993–1007.

[20] LadDP,VarmaS,VarmaN,SachdevaMU,BoseP,Malhotra P.RegulatoryT-cellsinB-cellchroniclymphocytic leukemia:theirroleindiseaseprogressionand autoimmunecytopenias.LeukLymphoma2013;54:

1012–1019.

[21] ChenH,TreweekeAT,WestDC,TillKJ,CawleyJC,ZuzelM, etal.Invitroandinvivoproductionofvascularendothelial growthfactorbychroniclymphocyticleukemiacells.Blood 2000;96:3181–3187.

(8)

[22] MolicaS,VaccaA,RibattiD,CuneoA,CavazziniF,LevatoD, etal.Prognosticvalueofenhancedbonemarrow

angiogenesisinearlyB-cellchroniclymphocyticleukemia.

Blood2002;100:3344–3351.

[23] MenzelT,RahmanZ,CallejaE,WhiteK,WilsonEL,Wieder R,etal.Elevatedintracellularlevelofbasicﬁbroblast growthfactorcorrelateswithstageofchroniclymphocytic

leukemiaandisassociatedwithresistancetoﬂudarabine.

Blood1996;87:1056–1063.

[24] KönigA,MenzelT,LynenS,WrazelL,RosénA,Al-KatibA, etal.Basicﬁbroblastgrowthfactor(bFGF)upregulatesthe expressionofbcl-2inBcellchroniclymphocyticleukemia celllinesresultingindelayingapoptosis.Leukemia 1997;11:258–265.