Cytogenetic and molecular determinants of aggressive form of chronic lymphocytic leukemia

(1)

Praca poglądowa/Review

Cytogenetyczne i molekularne uwarunkowania agresywnej postaci przewlek łej bia łaczki

limfocytowej

Cytogenetic and molecular determinants of aggressive form of chronic lymphocytic leukemia

Anna Grenda *, Michał Budzyński, Agata A. Filip

ZakładGenetykiNowotworówzPracowniąCytogenetyczną,UniwersytetMedycznywLublinie,Kierownik:drhab.n.med.

AgataA.Filip,Lublin,Poland

informacje o artykule

Historiaartykułu:

Otrzymano:22.01.2013 Zaakceptowano:10.06.2013 Dostępneonline:19.06.2013

Słowakluczowe:

przewlekłabiałaczkalimfocytowa

aberracjechromosomowe

mikroRNA

nowemutacje

Keywords:

Chroniclymphocyticleukemia

Chromosomalaberrations

MicroRNAs

Novelmutations

abstract

Chroniclymphocyticleukemia(CLL)mainlyaffectspeopleolderthan60years.Accumu- lationofmorphologicallymaturebutdysfunctional B-lymphocytesinthebonemarrow, lymphnodesandperipheralbloodisacharacteristicfeatureofthisdisease.Chromoso- malaberrations are observed inlymphocytesofmost CLLpatients.Typical alterations includedeletionsof13q14and11q,trisomy12,anddeletionsof17p.Alteredexpression ofthegeneslocatedwithin involvedregions, i.e.microRNA15/16(13q14.3), ATM(11q22- q23) or TP53 (17p13)may be associatedwith the development andprogression of the disease.Cryptic mutationsmay alsocontributetoleukemogenesis. Amongothers,they affectTP53,NOTCH1,SF3B1andBIRCgenes.

CLLisa diseasewithheterogeneouscourse. Therearetwoclinicalforms–indolent andaggressive.Theformerischaracterizedbylongtimetofirsttreatment anddemise usuallyoccursbecauseofcoexistingdiseasesorisassociatedwithleukemia-dependent immunodeficiency.Rapidclinicalcourseandshortoverallsurvival,sometimesinspiteof appropriatetreatmentimplementation,istypicalforaggressiveformofCLL.Forpatients withthisform,themomentoftreatmentinitiationandthechoice offirst-linetherapy areespeciallyimportant,anddependinteraliaonprognosticandpredictivefactors.

EstablishedpoorprognosticfactorsinCLLincludechromosomalaberrations,i.e.,dele- tionof17por11q,highZAP-70kinaseexpression,mutations/deletionsofTP53,andlack ofmutationofimmunoglobulinheavychainvariableregiongenes(IgVH).

In this paper we triedto point out the importance of someof theprognostic and predictive factors usedroutinelyin thediagnostic managementofCLL. Prognosticand predictivepotentialofmicroRNAexpressionlevelandrecentlydescribedcrypticchanges intheTP53,NOTCH1,SF3B1andBIRC3havealsobeenpresented.

*Adresdokorespondencji:ZakładGenetykiNowotworówUM,ul.Radziwiłłowska11,20-950Lublin,Polska.Tel.:+48509277187.

Adresemail:an.grenda@gmail.com(A.Grenda).

ContentslistsavailableatSciVerseScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journal homepage:www.elsevier.com/locate/achaem

http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2013.06.002

(2)

Wstęp

Dostępne techniki badawcze umożliwiają poszukiwanie nowych markerów diagnostycznych, które mogą przyczynić się do szybszego rozpoznania PBL oraz do udoskonalenia istniejącychiopracowanianowychstrategiiterapeutycznych.

Dzięki metodom cytogenetycznym możliwe jest wykrycie aberracji chromosomowych, a nowoczesne narzędzia dia- gnostyczne pozwalają na precyzyjną identyfikację zmian wgenomie napoziomiemolekularnym. Mają oneniejedno- krotniestrategiczneznaczenieprzyocenieprzebieguchoroby, a docelowo przy doborze indywidualnego leczenia dla chorych. Od czasu opracowania przez Rai i wsp. w 1975 roku klasyfikacji zaawansowania PBL na podstawie limfocytozy, zajęciaorganówlimfatycznych,anemiioraztrombocytopenii, opisano i zwalidowano szereg nowych czynników prognostycznych [1]. Uzupełniają one klasyfikację Rai, ułatwiają podejmowanie decyzji o rozpoczęciu leczenia i o wyborze strategiiterapeutycznych.Bardzoistotnakliniczniejestiden- tyfikacjadel(17p)wlimfocytachchoregonaPBL,ponieważjej obecnośćwiążesięzszybkąprogresją,agresywnymprzebie- giemchorobyisłabąodpowiedziąnastandardoweschematy leczenia [1–3]. Niekorzystnymiczynnikamiprognostycznymi sątakżemutacjewobrębiegenówTP53iNOTCH1orazdelecja 11q[4–6].Dziękipozyskaniutakichinformacjiistniejesposob- nośćszczegółowej analizykażdegoprzypadku PBLiindywi- dualnegodoboruterapii[7].

CorazwiększegoznaczeniaprognostycznegowPBLnabie- rająmikroRNA,samodzielnielubwpowiązaniuzokreślonymi aberracjami chromosomowymi. Przykładem jest skupisko genów miR-15/16, których obniżona ekspresja jestobserwo- wanauchorych z utratąfragmentuchromosomu 13q14[8].

MikroRNA-15a/16 są negatywnymi regulatorami ekspresji genuBCL2,któregorolawprzedłużaniuprzeżycialimfocytów PBL jest znana od dawna [8]. Izolowana delecja 13q14 jest korzystnymczynnikiemrokowniczym,alechorzyztegotypu

zaburzeniem stanowią heterogenną grupę, ze względu na możliwość występowania dodatkowych aberracji i różnic w ilości komórek białaczkowych z del(13q14). W związku z tym proﬁl ekspresji genów zaangażowanych w apoptozę, proliferację,funkcjecytoszkieletuczymetabolizmubikwityny jestzróżnicowanyuchorych wtejgrupie.Uosóbzwiększą liczbą komórek z del(13q14) zaobserwowano nadekspresję genówzaangażowanychw proliferację,aobniżonąekspresję genów zaangażowanych w zahamowanie cyklu komórko- wego. Danewskazujązatem,żeliczba komórekzizolowaną aberracją 13q14 ma znaczenie przy szacowaniu ogólnego czasuprzeżycia,jak również czasudoprogresji choroby [9].

Pewne znaczenie prognostyczne mają także nietypowe dla PBL aberracje chromosomowe, takie jak t(14;18) czy t(1;6) [10,11].

W niniejszej pracy starano się przedstawić cytogenetyczne imolekularne uwarunkowania wskazujące na agresywny przebieg PBL, związany z czasem do rozpoczęcia leczeniaiskróconymczasemcałkowitegoprzeżycia.

Delecja 17p oraz mutacja TP53 jako najistotniejsze z czynników prognostycznych związanych

z agresywnym przebiegiem PBL

Delecjakrótkiegoramieniachromosomu17 imutacjagenu TP53 (locus 17p31.1) zaliczane są doniekorzystnychczynni- ków rokowniczych. Zmiany te wskazują na skrócony czas całkowitegoprzeżyciaiwiążąsięzopornościąnachemiote- rapeutyki, co znacznie utrudnia leczenie [12]. U ok. 44%

chorychz opornościąnaleczenieﬂudarabinąobserwujesię del(17p)lubmutacjęTP53[12].

W przypadku TP53 stwierdza się mutacje nonsensowne zlokalizowane wkodonach 173,220,248i273.Występować mogą również zmiany typu przesunięcia ramki odczytu (frame-shift), z których dwie, stanowiące 18% wszystkich występującychmutacji,toY220Corazp.R209KfsX6[12].

Ryc.1–ProfilgenomowychorychnaPBLwykazującychopornośćnaleczeniefludarabinąwobecnościmutacjiTP53(1a)oraz przybrakumutacjiTP53(1b)(wgZenziwsp.,2009,modyfikacja)[12]

Fig.1–GenomicprofileofCLLpatientsresistanttofludarabineinthepresenceofTP53mutations(1a)andintheabsenceofTP53 mutations(1b)(accordingtoZenzetal.,2009,modified)[12]

(3)

Wykazano, żeu co najmniej50% osóbz PBL bezdelecji 17p obecna jest homozygotyczna mutacja TP53, spowodo- wanadisomiąjednorodzicielską(UPD;uniparentaldisomy)[12].

Mutacje w TP53 mogą występować z lub bez del(17p), jednak u większości chorych mutacjom TP53 towarzyszą delecje fragmentu krótkiego ramienia chromosomu 17 (Ryc.1a)[12,13].Obietezmianyrokująniepomyślnie–wiążą się ze skróconym czasem całkowitegoprzeżycia (OS;overall survival) orazzłąodpowiedziąnaleczenie[12].Jednakopor- ność na chemioterapię może rozwinąć siętakże u chorych z dzikim typem TP53. W takiej sytuacji często występują delecje11qlub–cociekawe–prawidłowykariotyp(Ryc.1b).

ObecnośćmutacjiTP53możestanowićniezależnyczynnik wskazującynagorszerokowaniedlachorychnaPBL,wyka- zujących oporność na ﬂudarabinę [4, 14]. Sugeruje się, że występowanie tej mutacji powinno być sprawdzane przed rozpoczęciemleczenia,ajeśliudanegochoregozostanieona potwierdzona, warto zastosować inne strategie terapeu- tyczne, aby uniknąć lekooporności [14]. Diagnostyka zmian wTP53powinnaobejmowaćeksonyod4do9jakomiejsca, gdzie najczęściej dochodzidouszkodzeń.Wczesna identyﬁ- kacja mutacji może przyspieszyć decyzję o zastosowaniu metodterapeutycznych,takichjakleczeniebiologiczne(prze- ciwciałamonoklonalneprzeciwCD52)iewentualnealloprze- szczepieniekomórekmacierzystychwfaziepierwszejremisji [4,15].

Zagresywną formąPBLoporną naleczeniewiązany jest również określony proﬁl ekspresji mikroRNA. U ponad 30%

chorych opornych na ﬂudarabinę zaobserwowano obniżoną ekspresjęmiR-34awporównaniuzchorymiodpowiadającymi na leczenie [12]. Niższa ekspresja mikroRNA-34a występuje uosóbzdelecją17p,zarównowobecnościmutacjiTP53jak iprzyjejbraku[16].Rossiiwsp.potwierdzili,żemiR-34ajest transaktywowane przez białko TP53, ale ze względu na obniżenie ekspresji miR-34a także u chorych z dzikim TP53 należywnioskować,żeistniejąinnemechanizmywpływające naniskąekspresjęmikroRNA-34a[16].Przezswojezaangażo- wanie w szlaki działania białka TP53, cząsteczkamikroRNA- 34astajesięważnymelementemprocesówmającychnacelu zapobieganie podziałom komórki w przypadku uszkodzenia materiaługenetycznego.Sugeruje się,żeobniżenieekspresji tegomikroRNAmożesięprzyczyniaćdoakumulacjibiałaczko- wychlimfocytów[12].Napodstawieanalizypoziomuekspre- sji miR-34a można prognozować czas do podwojenia ilości limfocytów(LDT;lymphocytedoublingtime)orazczascałkowi- tego przeżycia. Badania dużych grup chorych pozwolą na sprawdzenie,czypoziomekspresjimiR-34astaniesięrównież samodzielnym czynnikiem szacowania czasu przeżycia bez leczenia(TFS;treatmentfree-survival)[17].

Określone delecje, mutacje poszczególnych genów oraz w przyszłości, być może, poziom ekspresji wybranych mikroRNAsąniezwykle istotnejakoczynnikidiagnostyczne i prognostyczne, ponieważ zdiagnozowanie PBL nie musi oznaczać rozpoczęcia leczenia, dopiero przekształcanie się jejwpostaćagresywnąjestsygnałemdorozpoczęciaterapii oraz wyboru rodzaju chemioterapeutyku. Analiza ekspresji miRNAmoże ułatwić podejmowanie takich decyzji, dlatego prowadzone są intensywne badania, które mają na celu wyjaśnienie, jak zmienia się proﬁl ekspresji mikroRNA w trakcie choroby i jak charakteryzuje poszczególne jej

stadia, włącznie z etapami przekształcania się PBL wagresywnąpostać.

Jak wykazali Rossi i wsp., cząsteczkami, których geny ulegają nadekspresji w przypadku chorych opornych na terapię z del(17p), są miR-15a, miR-21, miR-155, natomiast obniżeniuulegająwspomnianawcześniejmiR-34aorazmiR- -181,miR-497[16].WprzypadkumikroRNA-497wskazujesię na znacznie obniżony poziom ekspresji, zarówno wtedy, gdy del(17p) występuje jako izolowana aberracja, jak też wtedy, gdyobecne sąaberracjewspółistniejące[16]. Suge- ruje się, że genami docelowymi dla tych miRNA są geny zaangażowanemiędzyinnymi w kontrolę cyklukomórko- wego czy kontrolę cyklu dobowego komórki [12]. Wydaje się, żełącznaocena kariotypuw poszukiwaniudelecji17p oraz badanie ekspresji miR-21 mogą być pomocne w róż- nicowaniuchorych zgrup niskiegoiwysokiego ryzyka,co mogłoby ułatwić decyzję o rozpoczęciu leczenia oraz o rodzaju terapii. Niezbędne są jednak dalsze badania w tym zakresie. Na dzień dzisiejszy największe znaczenie w praktyce klinicznej dotyczącej PBL mają mutacje TP53 i delecja 17p, jako zmiany, które wskazują na agresywną postaćPBL.Sąjednymzważniejszychczynnikówrokowni- czych wraz z obecnością kinazy ZAP-70, niezmutowanej formy genów IgVH, predysponujących do zastosowania strategii terapeutycznych obejmujących przeciwciała monoklonalne oraz alloprzeszczepienie komórek macie- rzystych, szczególnie utych chorych, u których widoczna jestopornośćnaleczenieanalogamipurynowymi.

Obniżona ekspresja niektórych mikroRNA oraz delecje 11q u chorych z agresywną postacią PBL

Badania wskazują, że przy szacowaniu TFS czy OS przy- datnamoże być ocenapoziomu ekspresjimiR-29c orazmiR- -223.Wykazano,żetemikroRNAmogąpotencjalniestanowić czynniki prognostyczne, pomocne w określaniu przebiegu PBLiwdoborzeleczeniaspersonalizowanego.Dowiedziono, że obniżeniu ekspresji mikroRNA-29c oraz mikroRNA-223 towarzyszy podwyższenie ekspresji onkogenu TCL1 (T-cell leukemia/lymphoma 1)[18].Wskazujetonagorszerokowanie oraz agresywniejszyprzebiegchoroby[18].Niższaekspresja miR-223 jest również obserwowana w przypadku MBCL (monoclonal B-cell lymphocytosis) oraz SMZL (splenic marginal zonelymphoma),przyczymniestwierdzasięistotnejróżnicy w ekspresji tego mikroRNA między PBL a MBCL czy SMZL.

NieobserwujesięrównieżzwiązkupomiędzyekspresjąmiR- -223 a występowaniem aberracji chromosomowych, takich jakdel(13q14),del(11q22),del(17p13)czy+12[19].

Wskazuje sięnatomiastna powiązaniamiędzy del(11q), obniżoną ekspresją miR-29 i miR-181 oraz ekspresją onko- genuTCL1[20].Badaniawykazały,żeuchorychzagresywną postaciąPBLdochodzidoczęstszychdelecji11qwporówna- niuzosobamizłagodnymprzebiegiemchoroby[20].

Związek pomiędzy TCL1, delecją 11q oraz cząsteczkami miR-29 imiR-181 sugeruje, żena długim ramieniu chromo- somu11mogąznajdowaćsięgenyczynnikówregulujących ekspresję miR-29 oraz miR-181. Gdy dochodzi do ubytku fragmentu11q,prawdopodobnietegenysątracone,acoza tym idzie, zmniejsza się ilość czynników stymulujących

(4)

ekspresję tych dwu miRNA. Skutkuje to niedoborem mikroRNA-29oraz mikroRNA-181,co zkolei możeprowadzić donadekspresjionkogenuTCL1[20].

OnkoproteinaTCL1(p14)jestkoaktywatoremkinazyAKT.

Bierzeudział w jejfosforylacji iaktywacji. AKT jeststrate- giczną cząsteczką szlaku przekazywania komórkowych sygnałówantyapoptotycznych[20].Jejnadaktywność,wyni- kającamiędzy innymiz nadmiernejstymulacjiprzezTCL1, możeprzyczyniaćsiędoakumulacjibiałaczkowychlimfocy- tów(Ryc.2).

PonieważmiR-29 orazmiR-181mogąregulowaćekspresję onkogenu TCL1, terapia mająca na celu przywrócenie ekspresji czy uzupełnianie niedoborów tych mikroRNA jest wartarozważeniauchorychznadekspresjąTCL1[20].

Delecje 11q22-q23 są na drugim miejscu pod względem częstości występowaniaaberracji chromosomowych ucho- rychnaPBLiobserwujesięje uok.20%z nich[7].Niemal uwszystkichchorychztegorodzajuzaburzeniemnotowane jest znaczne powiększenie węzłów chłonnych zarówno obwodowych,brzusznychjakiśródpiersiowych.Delecja11q wiążesięzryzykiemagresywnegoprzebieguchoroby,który może wyrażać się przez szybszą progresję i skrócony czas dorozpoczęcia leczenia. Wskazuje się, że del(11q) stanowi ważnyczynnikniepomyślnegorokowania,zwłaszczauosób poniżej 55. roku życia, ponieważ właśnie w tej grupie chorych dochodzi doznacznego skrócenia czasu przeżycia [6]. Ubytek fragmentu długiego ramienia chromosomu 11 wiążesięzagresywniejszymprzebiegiemPBLprawdopodob- niedlatego, żedelecja11q22-q23obejmuje genATM(ataxia telangiectasiamutated)[7](Ryc.3).

Kinaza ATM jestgłównym czynnikiemintegrującym syg- nały,któremająnaceluwłączeniemechanizmówzapobiega- jących podziałom komórek z dwułańcuchowymi uszkodze- niamiDNA[22].Regulujerównieższlakisygnalizacyjnebiałka supresorowego TP53 [7]. Delecja fragmentu 11q22-q23 skutkujebrakiembiałkaATM,comożewpływaćnazakłócenie kontroli cyklu komórkowego i destabilizację genomu. Brak kinazyATMprzyczyniasiędonieprawidłowościwprocesach apoptozy i senescencji komórek, czyli upośledzenia

mechanizmówchroniącychprzedzwiększaniemilościkomó- rekzdefektemwmaterialegenetycznym[7].Wynikiemtego możebyć nagromadzeniesiękomórekz uszkodzonymDNA, o nieograniczonych zdolnościach podziałowych, które będą stopniowo wypierały komórkiprawidłowe.Niedawno stwier- dzono, że polimorﬁzmy genu ATM w intronach 15 i 61 równieżmogązakłócaćekspresjęgenuATM[23].Jednonukleo- tydowe zmiany (SNP; single nucleotide polymorphism) mogą doprowadzićdoeliminacjigrupmetylowychwkażdymzobu wymienionych intronów,cowiąże sięzezwiększonymryzy- kiemrozwoju PBL.Niedokońcajestjasne,dlaczego taksię dzieje. Być może zmiana we wzorze metylacji prowadzi do subtelnychzakłóceńwekspresjigenu,któreskutkująwiększą podatnościąnarozwójPBL[23].Nieobserwujesięnatomiast wyciszenia ekspresji genu ATM przez hipermetylację regio- nówpromotorowych.

Ryc.3–LokalizacjachromosomowagenukinazyATM, któregoutratamożewskazywaćnaagresywnąpostaćPBL (wgStilgenbaueriwsp.,1996,modyfikacja)[22]

Fig.3–ChromosomallocationofATMkinasegenewhich deletionmayindicateanaggressiveformofCLL(accordingto Stilgenbaueretal.,1996,modified)[22]

Ryc.2–SchematprzedstawiającypotencjalnąfunkcjęonkogennąTCL1wlimfocytachTiB.

NadekspresjaonkogenuTCL1wiązanajestgłówniezbiałaczkąprolimfocytowązkomórekT(PLL-T).Przyjmujesię,że nadekspresjaTCL1wprzypadkuprzewlekłejbiałaczkilimfocytowejprowadzidoakumulacjibiałaczkowychlimfocytów iprawdopodobniemazwiązekzbardziejagresywnąpostaciąchoroby(wgPekarskyiwsp.,2010,modyfikacja)[21]

NF-kB–nuclearfactorofkappalightpolypeptidegeneenhancerinB-cells,FOS–FBJmurineosteosarcomaviraloncogenehomolog, JUN–junproto-oncogene,AP-1–activatorprotein1

Fig.2–DiagramshowingthepotentialoncogenicfunctionofTCL1inTandBlymphocytes.OverexpressionofTCL1oncogeneis associatedmainlywithT-cellprolymphocyticleukemia(T-PLL).ItisassumedthattheoverexpressionofTCL1leadstothe accumulationofleukemiccellsinchroniclymphocyticleukemia.Itisprobablyrelatedtoamoreaggressiveformofthedisease (accordingtoPekarskyetal.,2010,modified)[21]

(5)

Trisomia 12 i mutacje genu NOTCH1 jako czynniki związane z agresywną postacią PBL

Obecność dodatkowej kopii chromosomu 12 jest klasyﬁko- wananatrzecimmiejscu podwzględemczęstościwystępo- wania zaburzeńchromosomowychuchorych z PBL.Stwier- dzono,żew70%przypadkówjesttosamodzielnaaberracja, natomiastwpozostałychobserwujesięaberracjewspółistnie- jące[5]. DelGuidice iwsp.wykazali,żeu osóbzizolowaną trisomią12 częściejwystępująmutacjegenuNOTCH1(Notch homolog1, translocation-associated –Drosophila) wporównaniu z chorymi z innymi zaburzeniami chromosomowymi [5].

Mutacje NOTCH1 (locus 9q34.3) to w większości delecje zprzesunięciemramkiodczytu.Występująone zjednakową częstością umężczyzniukobiet[5,24].Sądzi się,żemogą być ważnym czynnikiem prognostycznym wskazującym na agresywny przebieg choroby u obydwu płci [5]. Agresywna postać PBL u osób z mutacją NOTCH1 najprawdopodobniej mazwiązek ze wzmożoną proliferacjąkomórkową, wynika- jącą między innymi z działania nieprawidłowego białka NOTCH1 [5]. Jest ono receptorem przezbłonowym biorącym udział w promowaniu podziałów komórkowych. Aktywacja receptorówNOTCHodbywasiępoprzezichoddziaływanieze specyﬁcznymi ligandami (DELTA-like,JAGGED), zlokalizowa- nyminasąsiednichkomórkach.Interakcjetezapoczątkowują seriezdarzeń,prowadzącychdoodcięciaczęściwewnątrzko- mórkowejreceptoraNOTCHijegoszybkiejwędrówkidojądra

komórkowego,gdziemożestymulowaćekspresjęgenów.Tak więcNOTCH1działajakoreceptorprzezbłonowy,jakrównież czynnik transkrypcyjny. Bierze on udział w inicjacji transkrypcji genu MYC, a także innych zaangażowanych we wzrost,podziałykomórkowe,różnicowanieorazapoptozę[25, 26](Ryc.4).

WewnątrzkomórkowadomenaNOTCHwrazzczynnikami transkrypcyjnymiorazinnymibiałkamitworząwieloskładni- kowe kompleksy, biorące udział w aktywacji pierwszego etapu ekspresji genów. Proces transkrypcji jest ułatwiony dziękiudziałowiacetylotransferazyhistonowejorazkomplek- sowiremodelującemuchromatynę.Wpływająone nainicja- cjęoraznaelongacjętranskrypcjiprzezrozluźnieniechroma- tyny, co umożliwia polimerazie i białkom pomocniczym dostęp do sekwencji transkrybowanych genów [27]. Przy terminacji transkrypcji do kompleksów białkowych wiążą- cychDNArekrutowanesąkorepresory,akinazy(CDK8;cyclin- dependentkinase-8)orazligazySEL10E3modyﬁkująwewnatrz- komórkową domenę NOTCH, w taki sposób, aby była dostępnadlaproteasomów,wktórychjestdegradowanaprzy udzialeubikwityny.Korepresoryangażują deacetylazęhisto- nową (HDAC) i inne kofaktory prowadzące do kondensacji chromatyny[27].

MutacjeNOTCH1dotyczągłówniedomenyPEST,którajest składową wewnątrzkomórkowej części receptora, pełniącej funkcjęczynnikatranskrypcyjnego.Mająonecharakterakty- wującyiprowadządoupośledzeniamechanizmówubikwity- nacjiidegradacjizmutowanegoNOTCH1,coprawdopodobnie

Ryc.4–SchematdziałaniareceptoraNOTCH.PrzezbłonowyreceptorNOTCHwiążeligandDELTA-like,zlokalizowanyna sąsiedniejkomórce.SkutkujetoreakcjąenzymatycznązudziałemmetaloproteinazyADAM17(TACE;TNF-a-converting enzyme)prowadzącądoodcięciazewnątrzkomórkowejdomenyNOTCH.Drugareakcjazudziałemkompleksu

enzymatycznegog-sekretazyuwalniawewnątrzkomórkowądomenęNOTCH,która,przechodzącdojądra,stajesię czynnikiemtranskrypcyjnym.NiełączysięonbezpośredniozDNA,azbiałkowymkomplekseminicjującymtranskrypcję iwrazzprzyłączonymkoaktywatoremstymulujeekspresjęgenówdocelowych(wgBray,2006,modyfikacja)[27]

Fig.4–SchemeoftheNOTCHreceptormechanismofaction.TransmembranereceptorbindsNOTCHDELTA-likeligand,locatedonthe neighboringcell.ThisresultsintheenzymaticreactioninvolvingmetalloproteinaseADAM17(TACE,TNF-a-convertingenzyme), whichleadstocuttingoftheextracellulardomainofNOTCH.Thesecondreactionwiththeg-secretaseenzymecomplexreleasesthe intracellulardomainofNOTCH,whichtranslocatestothenucleusandactsastranscriptionfactor.ItdoesnotdirectlybindDNA,but theproteincomplexthatinitiatestranscription.TheintracellulardomainofNOTCHwiththeattachedcoactivatorstimulatesthe expressionoftargetgenes(accordingtoBray,2006,modified)[27]

(6)

skutkujenadmiernąstymulacjągenów przyczyniającychsię doprzekształcaniaPBLwbardziejagresywnąpostać[24,28].

Jedneznajnowszychbadańwskazująnadużeznaczenie predykcyjne mutacji NOTCH1. Rossi i wsp. stwierdzili, że występują one u ok. 11% chorych z PBL [29]. Okazuje się, że dwunukleotydowe delecje w tym genie wiążą się ze skróconym OS oraz TFS. Mutacje te pociągają za sobą również duże ryzyko postępu choroby i transformacji PBL w zespół Richtera [24, 29]. Mutacji genu NOTCH1 rzadko towarzyszy delecja 13q14. Zauważono również, że przy mutacji NOTCH1 wraz z +12 nie obserwuje się delecji czy mutacji TP53, co może oznaczać wzajemne wykluczenie występowaniauszkodzeńwtychdwugenach[5,30].

Badania wskazują, że mutacja NOTCH1 może stanowić samodzielny czynnik rokowniczy, a zastosowanie systemu ARMS(amplificationrefractory mutationsystem),bazującego na reakcji PCR, jest badaniem o 100-procentowej czułości ispecyficzności.Takiepostępowanieułatwiaszybkiewykry- waniemutacjiipozwalauniknąćczasochłonnegoorazkosz- townegosekwencjonowaniaDNAwceluposzukiwaniamuta- cji [30]. Wykorzystanie tej techniki diagnostycznej byłoby bardzo pożądane, ponieważ czaspotrzebny do rozpoznania postaci choroby (łagodna/agresywna) uległby znacznemu skróceniu.DiagnostykawkierunkumutacjiNOTCH1zzasto- sowaniem techniki ARMS jest mniej pracochłonna, tańsza i mniej skomplikowana w porównaniu z określaniem statusumutacji genów IgVH czy badaniemekspresji kinazy ZAP-70 [30]. Oscier i wsp. wskazują, że istnieje znacząca korelacja pomiędzy brakiem somatycznych mutacji IgVH inadekspresjąkinazyZAP70amutacjamiNOTCH,cododat- kowopotwierdza,żeidentyfikacjamutacjiNOTCH1uchorych zPBLpozwalanaprzewidywanieszybkiegopostępuchoroby iprawdopodobieństwa transformacji w zespółRichtera [24].

ZnajomośćnastępstwmutacjiNOTCH1napoziomiemoleku- larnymotwieramożliwośćopracowanialeków,któremogłyby działać na zasadzie inhibitorów zmutowanego receptora NOTCH1, nadmiernie stymulującego ekspresję genów anty- apoptotycznychuchorychzPBL.

KomórkizmutacjąNOTCH1itrisomią12jakoizolowaną aberracjąmogąpodlegaćselekcji klonalnejiintensywnemu rozrostowi dzięki wzajemnej komunikacji stymulowanej białkami sygnalizacyjnymi, którychgenyznajdują sięm.in.

nachromosomie12. Ze względunajego dodatkowąkopię, powstajewięcej białek, które wzmagają intensywność syg- nałów podziałowych płynących do białaczkowych limfocy- tówB,wrażliwszychnastymulacjęzewnętrzną[5].

W przypadku chorób nowotworowych obecność aneu- ploidii świadczyo destabilizacji genomu: może mieć zwią- zek z zaawansowanym stadium, szybkim postępem choroby, gorszym rokowaniem i krótszym czasem przeżycia.

Możnato tłumaczyć, między innymi, zwiększonąekspresją genów zlokalizowanych na dodatkowych chromosomach [25].Potwierdzono,żeprzytrisomiichromosomu12nadeks- presji ulegają geny ANAPC5 (anaphase promoting complex subunit5),GLIPR1(GLIpathogenesis-related1),TIMELESS(timeless homolog – Drosophila) i SLC2A6 (solute carrier family 2[facilitatedglucosetransporter]member6)[5].

Jako dodatkowe zaburzenia chromosomowe u chorych z +12 mogą wystąpić t(14;18)(q32;q21), +18, del(13q14), del (6q21)oraz+19[10].

Niespecyﬁczne zaburzenia chromosomowe wskazujące na przekształcenie się PBL w postać agresywną

Wśród wspomnianych wcześniej zaburzeń chromosomowych współistniejących z trisomią 12 wymieniona została translokacjat(14;18)(q32;q21).Jestonacharakterystycznadla osób cierpiącychna chłoniakagrudkowego, alemożepoja- wiaćsięuchorychz przewlekłąbiałaczkąlimfocytową[10].

Lau i wsp. wskazują, że również t(8;14)(q24.1;q11.2), która jest charakterystycznym zaburzeniem dotyczącym nowo- tworów z komórekT, może wystąpić uchorych z PBL[10].

Nietypową translokację opisali również Michaux i wsp.

Stwierdzili oni, że unieznacznego odsetkachorych naPBL może pojawić się t(1;6)(p35.3;p25.2) [11]. We wszystkich przypadkach ztąrearanżacjąobserwowanobraksomatycz- nej mutacji części zmiennej łańcuchów ciężkich immuno- globulinorazcharakterystycznedlaPBLaberracjechromoso- mowe: del(11q), +12 lub del(17p)[11].Sugeruje się, żetakie niespecyficzne, dodatkowe translokacje u chorych z PBL mogą wynikać z dużej niestabilności genetycznejobserwo- wanej, gdy dochodzi do szybkiej progresji choroby itransformacjiwzespółRichtera.Identyfikacjatakichzmian pozwalakwalifikowaćchorychdopodgrupyPBLcharaktery- zującej się dużym ryzykiem szybkiego postępu choroby, koniecznościąwcześniejszegorozpoczęcia leczenia, a także znacznieskróconymczasemprzeżycia[10,11].

Nowe, submikroskopowe zmiany genomu w PBL

Obecnie jedną ze strategii postępowania w badaniach nad PBL jest analiza roli mutacji czy delecji nowych genów w powstawaniu i przebiegu choroby, w odniesieniu do znanych prognostycznych czynników cytogenetycznych imolekularnych. Najnowszedanewskazują,że takiepodej- ścieprowadzidoidentyﬁkacjizmianmutacyjnychczydelecji genówdotejporyniewiązanychzetiologiąPBL.Rossiiwsp.

wykazali, że z agresywną postacią PBL wiążą się mutacje i delecje genu BIRC3 (baculoviral IAP repeat containing 3), zlokalizowanego w regionie 11q22.2 [31]. U 24% chorych opornych na leczenie ﬂudarabiną obecne są pojedyncze mutacje BIRC3 lubmutacje z towarzyszącądelecją drugiego allela genu.Niestwierdzono natomiastzmian BIRC3uosób z dobrąodpowiedziąnachemioterapeutyki[31]. Zaobserwo- wanotakżewzajemnewykluczeniemutacji/delecjiBIRC3oraz zaburzeńwgenieTP53.Wnioskujesię,żeuszkodzeniaBIRC3 w PBLmogąstanowić niezależnyczynnikrokowniczywska- zującynaniepomyślnerokowanieiskróconyOS(mediana3,1 roku)podobniejakzaburzeniaTP53(mediana2,9roku)[31].

Do genów, którychmutacje opisano ostatnio w komór- kach PBL, należą również NOTCH (Notch homolog 1, translocation-associated – Drosophila) i SF3B1 (splicing factor 3b, subunit 1, 155kDa) [32]. Najnowsze badania Rossi i wsp.

sugerują, żeanaliza zmian mutacyjnych czy delecji genów BIRC3,NOTCH1,SF3B1,TP53,wrazzjednoczesnądiagnostyką w kierunku aberracji chromosomowych z zastosowaniem metodyFISH(ﬂuorescenceinsituhybridization),możeułatwiać przewidywanie czasu przeżycia czy podejmowanie decyzji

(7)

terapeutycznych, zwłaszcza u osób z agresywną postacią PBL [32]. Taka strategia badawcza może przyczynić się również dobardziejprecyzyjnejstratyﬁkacjichorych,którzy bardzo dobrze rokują, oraz tych, u których przewiduje się szybkipostępchorobyiwczesnyzgon.Proponowanypodział opartyna analiziepowiązańmiędzy uszkodzeniamigenów lubichdelecjamiaaberracjamichromosomowymiwstępnie pozwalawyróżnićczteryprognostycznepodgrupychorych:

- grupaosóbwysokiego ryzyka,uktórychwystępują zabu- rzeniaTP53i/lubBIRC3(dziesięcioletniczasprzeżyciatylko u29%chorych),

- grupaosób średniego ryzyka, u których występują zaburzenia NOTCH1 i/lub SF3B1 i/lub del11q22-q23 (dziesięcio- letniczasprzeżyciau37%chorych),

- grupaosóbniskiegoryzyka,uktórychobecnajesttrisomia chromosomu 12 lub brak jest uszkodzeń molekularnych i cytogenetycznych (dziesięcioletni czas przeżycia u 57%

chorych),

- grupaosóbbardzoniskiegoryzyka,uktórychobecnajest del13q14,aczasprzeżyciachorychniejestznaczącoróżny odczasuprzeżyciawogólnejpopulacji[32].

Przedstawionawstępnaklasyﬁkacja powstałanapodsta- wie wyników badań retrospektywnych, przeprowadzonych na dużej grupie chorych (1274 osób), niemniej wymaga walidacji w dużych badaniach wieloośrodkowych, aby stwierdzić, czy będzie można ją stosować w codziennej praktyceklinicznej.

Podsumowanie

Ze względu na to, że przewlekła białaczka limfocytowa charakteryzujesiędużąheterogennością,określanienowych czynników prognostycznych oraz szukanie zależności mię- dzy nimi może być znaczącym wkładem w rozwinięcie bardziej precyzyjnych metod diagnozowania i określania ,,indywidualnego wzoru’’ przebiegu PBL u poszczególnych chorych.PowiązaniamiędzystatusemmutacjiIgVH,ekspre- sją ZAP70, aberracjami chromosomowymi, zmianami w ekspresji genów związanych z PBL czy zmianami w ekspresji mikroRNA ułatwią podejmowanie decyzji terapeutycznych iudoskonalą metodyleczeniaPBL o agresyw- nymprzebiegu.

Wkład autorów/Authors' contributions

Wedługkolejności.

Konﬂikt interesu/Conﬂict of interest

Niewystępuje.

Finansowanie/Financial support

Praca została wykonana w ramach projektów naukowych MNsd 230 oraz MNsd 231 Uniwersytetu Medycznego wLublinie.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.

pi smiennictwo/references

[1] RaiKR,SawitskyA,CronkiteEP,etal.Clinicalstagingof chroniclymphocyticleukemia.Blood1975;46:219–234.

[2] RudenkoHC,ElseM,DeardenC,etal.Characterisingthe TP53-deletedsubgroupofchroniclymphocyticleukemia:

ananalysisofadditionalcytogeneticabnormalities detectedbyinterphaseﬂuorescenceinsituhybridisation andarray-basedcomparativegenomichybridisation.Leuk Lymphoma2008;49:1879–1886.

[3] DickerF,HerholzH,SchnittgerS,etal.Thedetectionof TP53mutationsinchroniclymphocyticleukemia independentlypredictsrapiddiseaseprogressionandis highlycorrelatedwithacomplexaberrantkaryotype.

Leukemia2009;23:117–124.

[4] PospisilovaS,GonzalezD,MalcikovaJ,etal.ERIC recommendationsonTP53mutationanalysisinchronic lymphocyticleukemia.Leukemia2012;26:1458–1461.

[5] DelGiudiceI,RossiD,ChiarettiS,etal.NOTCH1mutations in+12chroniclymphocyticleukemia(CLL)conferan unfavorableprognosis,induceadistinctivetranscriptional proﬁlingandreﬁnetheintermediateprognosisof+12CLL.

Haematologica2012;97:437–441.

[6] DöhnerH,StilgenbauerS,JamesMR,etal.11qdeletions identifyanewsubsetofBcellchroniclymphocytic leukemiacharacterizedbyextensivenodal involvementandinferiorprognosis.Blood1997;89:

2516–2522.

[7] KieferY,SchulteC,TiemannM,BullerdiekJ.Chronic lymphocyticleukemia-associatedchromosomal

abnormalitiesandmiRNAderegulation.TheApplicationof ClinicalGenetics2012;5:21–28.

[8] CalinGA,DumitruCD,ShimizuM,etal.Frequentdeletions anddown-regulationofmicro-RNAgenesmiR-15andmiR- 16at13q14inchroniclymphocyticleukemia.ProcNatl AcadSciUSA2002;99:15524–15529.

[9] HernándezJA,RodríguezAE,GonzálezM,etal.Ahigh numberoflossesin13q14chromosomebandisassociated withaworseoutcomeandbiologicaldifferencesinpatients withB-cellchroniclymphoidleukemia.Haematologica 2009;94:364–371.

[10] LauLC,LimP,LimYC,etal.Occurrenceoftrisomy12,t (14;18)(q32;q21),andt(8;14)(q24.1;q11.2)inapatientwithB- cellchroniclymphocyticleukemia.CancerGenetCytogenet 2008;185:95–101.

[11] MichauxL,WlodarskaI,RackK,etal.Translocationt(1;6) (p35.3;p25.2):anewrecurrentaberrationin‘‘unmutated’’B- CLL.Leukemia2005;19:77–82.

[12] ZenzT,HäbeS,DenzelT,etal.Detailedanalysisofp53 pathwaydefectsinﬂudarabine-refractorychronic lymphocyticleukemia(CLL):dissectingthecontributionof 17pdeletion,TP53mutation,p53-p21dysfunction,and miR34ainaprospectiveclinicaltrial.Blood2009;114:

2589–2597.

[13] ZenzT,HäbeS,KröberA,etal.TP53Mutationand17p deletionareassociatedwithpoorsurvivalinpatientswith CLLirrespectiveoftheinactivationoftheotheralleleby deletionorTP53mutation:Resultsfromasinglecenter analysis.Haematologica2007;92:35.

(8)

[14] ZenzT,EichhorstB,BuschR,etal.TP53mutationand survivalinchroniclymphocyticleukemia.JClinOncol 2010;28:4473–4479.

[15] ZenzT,GribbenJG,HallekM,etal.Riskcategoriesand refractoryCLLintheeraofchemoimmunotherapy.Blood 2012;119:4101–4107.

[16] RossiS,ShimizuM,BarbarottoE,etal.microRNA ﬁngerprintingofCLLpatientswithchromosome17p deletionidentifyamiR-21scorethatstratiﬁesearly survival.Blood2010;116:945–952.

[17] AsslaberD,PiñónJD,SeyfriedI,etal.microRNA-34a expressioncorrelateswithMDM2SNP309polymorphism andtreatment-freesurvivalinchroniclymphocytic leukemia.Blood2010;115:4191–4197.

[18] StamatopoulosB,MeulemanN,Haibe-KainsB,etal.

microRNA-29candmicroRNA-223down-regulationhasin vivosigniﬁcanceinchroniclymphocyticleukemiaand improvesdiseaseriskstratiﬁcation.Blood2009;113:

5237–5245.

[19] ZhouK,YiS,YuZ,etal.MicroRNA-223expressionis uniformlydown-regulatedinBcelllymphoproliferative disordersandisassociatedwithpoorsurvivalinpatients withchroniclymphocyticleukemia.LeukLymphoma 2012;53:1155–1161.

[20] PekarskyY,SantanamU,CimminoA,etal.Tcl1expression inchroniclymphocyticleukemiaisregulatedbymiR-29 andmiR-181.CancerRes2006;66:11590–11593.

[21] PekarskyY,ZanesiN,CroceCM.MolecularbasisofCLL.

SeminCancerBiol2010;20:370–376.

[22] StilgenbauerS,LiebischP,JamesMR,etal.Molecular cytogeneticdelineationofanovelcriticalgenomicregionin chromosomebands11q22.2-q23.1inlymphoproliferative disorders.ProcNatlAcadSciUSA1996;93:11837–11841.

[23] Martín-GuerreroI,EnjuanesA,RichterJ,etal.Aputative

‘‘hepitype’’intheATMingeneassociatedwithchronic lymphocyticleukemiarisk.GenesChromosomesCancer 2011;11:887–895.

[24] OscierDG,Rose-ZerilliMJ,WinkelmannN,etal.Theclinical signiﬁcanceofNOTCH1andSF3B1mutationsintheUKLRF CLL4trial.Blood2013;121:468–475.

[25] PalomeroT,LimWK,OdomDT,etal.NOTCH1directly regulatesc-MYCandactivatesafeed-forward-loop transcriptionalnetworkpromotingleukemiccellgrowth.

ProcNatlAcadSciUSA2006;103:18261–18266.

[26] HanssonEM,LendahlU,ChapmanG.Notchsignalingin developmentanddisease.HanssonSeminCancerBiol 2004;14:320–328.

[27] BraySJ.Notchsignaling:asimplepathwaybecomes complex.MolecularCellBiology2006;7:678–689.

[28] FabbriG,RasiS,RossiD,etal.Analysisofthechronic lymphocyticleukemiacodinggenome:roleofNOTCH1 mutationalactivation.JExpMed2011;208:1389–1401.

[29] RossiD,RasiS,FabbriG,etal.MutationsofNOTCH1arean independentpredictorofsurvivalinchroniclymphocytic leukemia.Blood2012;119:521–529.

[30] LópezC,DelgadoJ,CostaD,etal.Differentdistributionof NOTCH1mutationsinchroniclymphocyticleukemiawith isolatedtrisomy12orassociatedwithotherchromosomal alterations.GenesChromosomesCancer2012;23:1–9.

[31] RossiD,FangazioM,RasiS,etal.DisruptionofBIRC3 associateswithﬂudarabinechemorefractorinessinTP53 wild-typechroniclymphocyticleukemia.Blood

2012;119:2854–2862.

[32] RossiD,RasiS,SpinaV,etal.Integratedmutationaland cytogeneticanalysisidentiﬁesnewprognosticsubgroupsin chroniclymphocyticleukemia.Blood2013;121:1403–1412.