pROBLEMY KRYMINALISTYKI 282(4) 2013 17
Wstęp
W ostatnim dziesięcioleciu polimorficzne mikrosateli- tarne sekwencje typu STR znalazły zastosowanie w ba-daniach dotyczących identyfikacji sprawców przestępstw, identyfikacji osobniczej oraz profilowaniu śladów biolo-gicznych dla potrzeb wymiaru sprawiedliwości i organów ścigania. Automatyczna analiza loci STR jest najszyb-szym i najskuteczniejnajszyb-szym sposobem indywidualizacji materiału biologicznego w genetyce sądowej. Jednym z używanych komercyjnych zestawów do genotypowania jest zestaw AmpFlSTRSGM PlusTM firmy Applied Bio-systems. Zestaw kompleksowej (multipleksowej) reakcji PCR pozwala na jednoczesną szybką amplifikację 10 loci mikrosatelitarnych STR z różnych miejsc ludzkiego DNA jądrowego.
Badania populacyjne 10 loci STR prowadzono w wielu regionach Europy, Azji, Australii i obu Ameryk [1]. W Pol-sce oznaczano polimorfizm 10 loci STR mieszkańców następujących regionów: Polska zachodnia [2], centralna Polska (region łódzki) [3, 4], centralna Polska [5], centralna Polska [6], Warmia i Mazury (Polska północno-wschodnia) [7], Podlasie (Polska północno-wschodnia) [8], południo-wa Polska [9], oraz grup etnicznych: Romowie z obszaru Polski [10], polscy Tatarzy [11].
W pracy przedstawiono wyniki badań polimorfizmu DNA komercyjnym zestawem AmpFlSTRSGM PlusTM firmy Applied Biosystems: D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, AMEL, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01 i FGA w populacji Polski południowej.
Cele pracy
określenie częstości występowania alleli w zakresie –
loci autosomalnych STR: D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, AMEL, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01 i FGA w populacji Polski południowej; ocena zgodności rozkładu alleli poszczególnych loci – z prawem Hardy’ego–Weinberga obliczenie parametrów oceniających przydatność po-– szczególnych loci STR w genetyce sądowej.
Materiał i metodyka
Materiał do badań stanowiły krew lub wymazy z jamy ustnej 704 dorosłych niespokrewnionych osobników płci męskiej (354 osoby) i żeńskiej (350 osób) zamieszkujących obszar Polski południowej. DNA izolowano zestawem do izolacji DNA – Blood DNA Prep Plus firmy A&A Biotech-nology [12] oraz zestawem EZ1 Tissue DNA Kit w BIO- ROBOCIE EZ firmy QIAGEN [13]. Stężenie DNA określa-no metodą spektrofotometryczną w aparacie NanoDrop ND-1000 Spectrofotometr firmy Thermo Fisher Scientific TK Biotech. Reakcję PCR prowadzono w termocyklerze GeneAmp PCR System 2700 i 9700 firmy Applied Bio-systems zgodnie z rekomendacją producenta zestawu do typowania próbek AmpFlSTRSGM PlusTM [1]. Produkty amplifikacji PCR rozdzielano techniką elektroforezy kapi-larnej na automatycznym analizatorze genetycznym 3130 Genetic Analyzer firmy Applied Biosystems, jako stan-dardu wielkości DNA użyto markera GeneScan-500 LIZ (Applied Biosystems). Allele określano w odniesieniu do drabin allelicznych i definiowano zgodnie z międzynarodo- wym nazewnictwem przy użyciu programu komputerowe-go GeneMapper ID v.3.2 software (Applied Biosystems). Określano profile 10 loci autosomalnych DNA i genu ame-logeniny charakterystycznego dla płci badanych osób. Opracowanie wyników stanowiło wyliczenie obserwo-wanych i oczekiwanych liczebności i częstości genotypów oraz częstości alleli przy zastosowaniu równania Hardy’e-go–Weinberga. W badaniach statystycznych ocenę zgodności między oczekiwanymi i obserwowanymi genotypami – ocenę rów-nowagi Hardy’ego–Weinberga – obliczono z zastosowa-niem testu χ2 i testu Exact z użyciem programu TFPGA [14, 15]. Charakterystykę statystyczną poszczególnych loci wykonano, stosując program FatRec. Wyliczono: siłę dys-kryminacji PD, heterozygotyczność obserwowaną Htobs.,Badania populacyjne mieszkańców Polski południowej
zestawem AmpFlSTRSGM PlusTM
Kornelia Droździok, Jadwiga Kabiesz, Marcin Tomsia, Joanna Nowicka, Joanna Kulikowska
Katedra i Zakład Medycyny Sądowej i Toksykologii Sądowo-Lekarskiej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
Z PRAKTYKI
18 pROBLEMY KRYMINALISTYKI 282(4) 2013
heterozygotyczność oczekiwaną Htocz., prawdopodobień-stwo przypadkowej zgodności profili genetycznych PM, siłę wykluczeniową układu MEC, współczynnik informacji polimorficznej PIC, średnie prawdopodobieństwo wyklu-czenia MEP.
Wyniki i omówienie
Tabela 1 przedstawia częstości występowania alleli w obrębie 10 loci STR w badanej populacji południowej Pol-ski. Analiza danych w oparciu o test χ2 i test Exact wykaza-ła, że badana populacja południowej Polski w zakresie 10 loci STR znajduje się w równowadze genetycznej zgodnej z prawem Hardy’ego–Weinberga (p > 0,005) z uwagi na zgodność między danymi oczekiwanymi i obserwowanymi. W zakresie loci: D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, D8S1179, D18S51, D19S433, TH01 i FGA pojawiły się
allele występujące rzadko. Allele te były również ob-serwowane w innych rejonach Polski. W obrębie locus D21S11 pojawił się osobnik z allelem 24,2 i 35,2, w locus D18S51 z allelem 18,2 – nieopisywanymi w literaturze polskiej.
Częstości alleli w badanej populacji południowej Pol-ski nie odbiegały od danych zamieszczonych w literaturze dla innych populacji Polski. Porównanie częstości alleli występujących w zakresie 10 loci STR nie wykazało zna-miennych statystycznie różnic dla populacji południowej Polski i pozostałych regionów Polski. Natomiast znamien-ne statystycznie różnice ujawniono, porównując populację Polski południowej z populacją Romów i Tatarów. Wyjątek stanowiły loci: D8S1179, D19S433 i FGA.
Tabela 2 przedstawia parametry statystyczne 10 loci STR wskazujące na ich dużą przydatność w medycynie sądowej. We wszystkich loci z wyjątkiem D16S539 war-tość PD przekroczyła 0,9.
Tabela 1 Częstości alleli 10 loci STR w populacji Polski południowej
Allele frequencies for AmpFlSTRSGM PlusTM (10 loci STR) in South Poland
Allele D3S1358 VWA D16S539 D2S1338 D8S1179 D21S11 D18S51 D19S433 TH01 FGA
N 704 704 704 704 704 704 704 704 704 704 5 - - - 0,0021 -6 - - - 0,2237 -7 - - - 0,1442 -8 - - 0,0050 - 0,0085 - - - 0,0966 -9 - - 0,0980 - 0,0192 - - - 0,2138 -9,3 - - - 0,3111 -10 - - 0,0398 - 0,0589 - 0,0050 0,0007 0,0085 -11 0,0007 - 0,2614 - 0,0668 - 0,0170 0,0028 - -12 - - 0,3501 - 0,1605 - 0,1037 0,0888 - -13 0,0028 0,0043 0,2081 - 0,3281 - 0,0938 0,2251 - -13,2 - - - 0,0206 - -14 0,1314 0,1037 0,0369 - 0,2237 - 0,1520 0,3743 - -14,2 - - - 0,0156 - -15 0,2422 0,0966 0,0007 - 0,1023 - 0,1648 0,1683 - -15,2 - - - 0,0291 - -16 0,2450 0,1790 - 0,0511 0,0270 - 0,1768 0,0305 - 0,0007 16,2 - - - 0,0263 - -17 0,2159 0,2813 - 0,1882 0,0043 - 0,1122 0,0064 - 0,0014 17,2 - - - 0,0092 -18 0,1477 0,2379 - 0,0810 0,0007 - 0,0874 - - 0,0121 18,2 - - - 0,0007 0,0014 - -19 0,0128 0,0817 - 0,1286 - - 0,0447 - - 0,0852 19,2 - - - 0,0007 - -20 0,0014 0,0135 - 0,1413 - - 0,0178 - - 0,1470 20,2 - - - 0,0014 21 - 0,0021 - 0,0327 - - 0,0163 - - 0,1825 21,2 - - - 0,0043 22 - - - 0,0213 - - 0,0057 - - 0,1882 22,2 - - - 0,0114 23 - - - 0,0930 - - 0,0021 - - 0,1349 23,2 - - - 0,0121
pROBLEMY KRYMINALISTYKI 282(4) 2013 19 Z PRAKTYKI
Tabela 2 Porównanie własności statystycznych poszczególnych systemów STR zestawu
AmpFlSTRSGM PlusTM w populacji Polski południowej
Comparison of statistical parameters of STR system AmpFlSTRSGM PlusTM in South Poland
Układ system pD pIC MEC pM Hobs. MEp
D3S1358 0,9239 0,7636 0,5920 0,0761 0,8068 0,6118 VWA 0,9334 0,7781 0,6178 0,0666 0,7940 0,5880 D16S539 0,8997 0,7140 0,5306 0,1003 0,7472 0,5049 D2S1338 0,9727 0,8687 0,7585 0,0273 0,8750 0,7571 D8S1179 0,9312 0,7706 0,6119 0,0688 0,8026 0,6038 D21S11 0,9711 0,8769 0,7722 0,0289 0,8667 0,7280 D18S51 0,9705 0,8630 0,7490 0,0295 0,8835 0,7619 D19S433 0,9165 0,7398 0,5727 0,0835 0,7472 0,5049 TH01 0,9132 0,7422 0,5640 0,0868 0,7798 0,5622 FGA 0,9658 0,8488 0,7255 0,0342 0,8594 0,7134
Allele D3S1358 VWA D16S539 D2S1338 D8S1179 D21S11 D18S51 D19S433 TH01 FGA
24 - - - 0,1151 - - - 0,1179 24,2 - - - 0,0007 - - - 0,0014 25 - - - 0,1200 - - - 0,0739 26 - - - 0,0234 - 0,0021 - - - 0,0220 27 - - - 0,0028 - 0,0291 - - - 0,0036 28 - - - 0,0014 - 0,1733 - - - -29 - - - 0,2131 - - - -30 - - - 0,2223 - - - -30,2 - - - 0,0547 - - - -31 - - - 0,0611 - - - -31,2 - - - 0,0959 - - - -32 - - - 0,0128 - - - -32,2 - - - 0,0909 - - - -33 - - - 0,0007 - - - -33,2 - - - 0,0384 - - - -34,2 - - - 0,0043 - - - -35,2 - - - 0,0007 - - - -χ2 df test
χ
236 27,345χ
236 28,112χ
228 24,773χ
278 66,502χ
255 45,749χ
2105116,458χ
2105 97,541χ
2105 65,721χ
221 55,438χ
2136137,838 p 0,8499 0,8234 0,6402 0,8203 0,8087 0,2091 0,6849 0,7834 0,6310 0,4398 Źródło: (tab. 1–2) opracowanie własneWnioski
Badana populacja znajduje się w równowadze genetycz- nej zgodnej z prawej Hardy’ego–Weinberga. Zgodność czę-stości alleli dla 10 loci STR w badanej populacji pozwala na zastosowanie markerów w badaniach kryminalistycznych.Parametry statystyczne charakteryzujące dziesięć analizowanych loci STR wskazują na wysoką przydatność markerów w identyfikacji sprawców przestępstw oraz pro- filowaniu śladów biologicznych na potrzeby wymiaru spra-wiedliwości i organów ścigania. Argumentem przemawiającym za stosowaniem zesta- wu 10 loci STR w praktyce genetyka sądowego w bada-niu śladów biologicznych jest niski koszty analizy, co ma znaczenie w badaniach przesiewowych przy dużej liczbie próbek.
BIBLIOGRAFIA
Applied Biosystems, AmpFlSTR IdentifilerTM PCR Amplification Kit User’s Manual, Foster City, CA, P/N 4323291, 08/2006.
Sołtyszewski I, Pepiński W., Piątek J., Żuk J., Jóźwiak R., Janica J.: Genetic data on 10 STR loci a population of western Poland. Forensic Sci. Int. 2006, 161, 69–71.
Z PRAKTYKI
20 pROBLEMY KRYMINALISTYKI 282(4) 2013
Jacewicz R., Berent J., Prośniak A., Kadłubek M., Szram S.: Genetic diversity and forensic evaluation of 10 STR loci In Łódź region of Poland. Forensic Sci. Int. 2003, 137, 94–96. Jacewicz R., Berent J., Bąbol K., Szram S.: Rozkład częstości alleli w 10 loci STR w regionie centralnej Polski. Arch. Med. Sąd. Krym. Kuźniar P., Sołtyszewski I., Płoski R.: Population ge-netics of 10 STR loci in a population of Central Poland. Forensic Sci. Int. 2002, 130, 55–57.
Tucholska-Lenart A., Wujec J., Samborski J., Gre-jcz Jakubowska E.: Allele frequencies for 10 STR loci In a population from central Poland. Forensic Sci. Int. 2002, 129, 131–133.
Sołtyszewski I., Pepiński W., Skowrońska M., Koc-Żorawska E., Niemcunowicz-Janica A., Janica J.: STR data for the AmpFlSTR SGM Plus loci from Warmia and Mazury (NE Poland). Forensic Sci. Int. 2004, 141, 69–71.
Pepiński W., Skowrońska M., Janica J., Niemcuno-wicz-Janica A., Sołtyszewski I., Wardaszka Z.: Genety-ka populacyjna 10 loci typu STR w próbce populacyjnej Podlasia (Polska północno-wschodnia). Arch. Med. Sąd. Krym. 2003,
Wolańska-Nowak P., Branicki w., Kupiec T.: STR data for SGM Plus and penta E and D loci in a population sample from south Poland. Forensic Sci. Int. 2002, 127, 237–239.
Michalczak R., Kałużewski B., Berent J.: Genetyczny polimorfizm 10 loci STR (AmpFlSTR SGM PlusTM Sys-tem) w populacji Romów z obszaru Polski. Ann. Ac. Med. Stet 2007, 53, suppl.2, 136–138.
Pepiński W., Janica J., Aleksandrowicz-Bukin M., Skawrońska M., Koc-Żórawska E., Niemcunowicz-Janica A.: Population genetics of 10 short tandem repeat (STR) loci In a population sample of ethnic group Polish Tatars living In the Podlasie area (Northeastern Poland). Fol. Morphol. 2004, 63, 249–252. A&A Biotechnology, 2004, Uniwersalny zestaw do izo-lacji DNA z krwi. Qiagen EZ1 DNA Handbook, 02, 2004. Brenner C., Morris J.,W.: Paternity index calculations in single locus hypervariable DNA probes validation and oth-er studies. Proceedings from International Symposium of Human Identification. Promega Corporation, 1989, 21–53. Miller M.: Tools for population Genetic Analyses (TF-PGA). 1997, 3, Free program distributed by author over the internet at http:/herb.bio.nau.edu/~mille/tfpga.thtm.
Streszczenie
Praca przedstawia wyniki badań populacyjnych w obrębie 10 loci STR na podstawie komercyjnego zestawu AmpFlSTRSGM PlusTM
fir-my Applied Biosystems: D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, AMEL, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01 i FGA w populacji Polski południowej. Badania przeprowadzono w grupie 704 osobników
doro-słych, niespokrewnionych, płci męskiej i żeńskiej, zamieszkujących na terenie Polski południowej. Cele niniejszej pracy to: określenie częstości występowania alleli 10 autosomalnych loci STR w populacji Polski po-łudniowej, ocena zgodności rozkładu alleli z prawem Hardy’ego–We-inberga, obliczenie parametrów oceniających przydatność markerów w genetyce sądowej i ich porównanie. Na podstawie uzyskanych często-ści alleli wyliczono wybrane parametry statystyczne (PD, PIC, MEC, PM, Ht i MEP) wskazujące na wysoką przydatność analizowanych loci w medycynie sądowej.
Słowa kluczowe: AmpFlSTRSGM PlusTM , loci STR, populacja
południowej Polski, genetyka populacyjna, analiza statystyczna
Summary
In the paper the authors show the results of the population research on STR loci: D3S1358,VWA,D16S539, D2S1338, AMEL, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, THO1 and FGA in a representative sam-ple of 704 unrelated men and women coming from South Poland with the use of an AmpFISTR®SGM PlusTM kit (A&A Biotechnology).
The aim of the research was to study the distribution of allele fre-quencies of 10 autosomal STR loci in south Poland population, show genetic balance in agreement with Hardy-Weinberg’s law as well as to calculate and compare statistical parameters (PD,PIC, MEC, PM, Ht and MEP) which allowed to assess the usefulness of the genetic markers for paternity testing and forensic identification purposes.
Keywords: AmpFlSTRSGM PlusTM, loci STR, population of
