1
Judyta Aniśko-Słomińska
SKANINGOWA LASEROWA MIKROSKOPIA KONFOKALNA W WYBRANYCH POSTACIACH
DYSTROFII ROGÓWKI
Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych
Klinika Okulistyki
Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego Promotor: prof. dr hab. med. Krystyna Raczyńska
Gdańsk 2014
2
Składam serdeczne podziękowania
Szanownej Pani Profesor Krystynie Raczyńskiej
za wyjątkową życzliwość, opiekę i cenne uwagi
3
Pracę tę dedykuję moim ukochanym Rodzicom
4
SPIS TREŚCI
I. OBJAŚNIENIA STOSOWANYCH SKRÓTÓW I SYMBOLI………..
II. WSTĘP………...
II.1. Rogówka………..
II.1.1. Rys historyczny……….
II.1.2. Embriologia rogówki………
II.1.3. Fizjologia rogówki………
II.1.4. Budowa rogówki………...
II.1.5. Metody obrazowania rogówki………
II.2. Mikroskopia konfokalna rogówki………
II.2.1. Wstęp, definicja………
II.2.2. Historia rozwoju mikroskopu konfokalnego………
II.2.3. Typy współcześnie stosowanych mikroskopów konfokalnych………
II.2.3.1. TSCM, SSCM, LSCM-RCM………..
II.2.4. Obraz zdrowej rogówki w mikroskopie konfokalnym……….
II.2.5. Kliniczne wskazania do badania rogówki za pomocą mikroskopu
konfokalnego……….
II.3. Dystrofie rogówki
II.3.1. Definicja………
II.3.2. Klasyfikacja IC3D……….
II.3.3. Postępowanie w dystrofiach………..
III. CEL PRACY………..
IV. MATERIAŁ I METODY………
IV.1. Materiał………
IV.1.1. Kryteria włączenia i wyłączenia Grupa I (badana)………..
Podgrupy I a, I b, I c……….
IV.1.2. Kryteria włączenia i wyłączenia Grupa II (kontrolna)……….
IV.2. Metody badawcze……….
IV.2.1. Badanie okulistyczne……….
IV.2.2. Aparatura………
IV.2.3. Technika badania w skaningowym laserowym mikroskopie konfokalnym in vivo (RCM, Rostock Cornea Module)……….
IV.2.4. Analiza obrazu RCM w Grupie I………..
IV.2.4.1. Podgrupa I a: dystrofie przednie……….
IV.2.4.2. Podgrupa I b: dystrofie istoty właściwej……….
IV.2.4.3. Podgrupa I c: dystrofie tylne………
IV.2.5. Analiza obrazu RCM w Grupie II………..
IV.3. Metody statystyczne……….
V. DYSKUSJA I OMÓWIENIE WYNIKÓW………...
5 VI. WNIOSKI………
VII. STRESZCZENIE………..
VIII. SUMMARY……….
IX. PIŚMIENNICTWO……….
X. SPIS RYCIN I TABEL……….
XI. UZUPEŁNIENIE………
6
I. OBJAŚNIENIA STOSOWANYCH SKRÓTÓW I SYMBOLI
AMD - zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (age related macular degeneration) BVCA - najlepsza skorygowana ostrość wzroku (best corrected visual aquity)
CCD - matryca do detekcji obrazów (couple charged device) CCDF - dystrofia François (Central Cloudy Dystrophy of François) CHED 1,2 - wrodzona dziedziczna dystrofia śródbłonka typ 1 i 2 (Congenital Hereditary Endothelial Dystrophy 1,2) CHST6 - gen sulfotransferazy rogówkowej 6
CM - mikroskopia konfokalna (confocal microscopy)
CMTF - mikroskopia konfokalna poprzez ogniskowanie (confocal microscopy through focusing) COL8A2 - gen kolagenu
CSCD - wrodzona dystrofia istoty właściwej (Congenital Stromal Corneal Dystrophy) D - dioptria
DNA - kwas dezoksyrybonukleinowy
EBMD - dystrofia błony podstawnej nabłonka (Epithelial Basement Corneal Dystrophy) ERED - dystrofia nawracających ubytków nabłonka (Epithelial Reccurent Erosion Dystrophy) FCD - dystrofia Flecka (Fleck Corneal Dystrophy)
FECD - dystrofia Fuchsa (Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy) FOV - pole widzenia (field of view)
GCD - dystrofia ziarnista (Granular Corneal Dystrophy)
GDCL - galaretowata dystrofia kropelkowa (Gelatinous Drop-Like Corneal Dystrophy) GSN - gelsolina
GWCD - dystrofia Graysona-Wilbrandta (Grayson-Wilbrandt Corneal Dystrophy) HRT - Heidelberg Retina Tomograph
IC3D - międzynarodowa klasyfikacja dystrofii rogówki
(International Classification of the Corneal Dystrophies)
7 IOP - ciśnienie wewnątrzgałkowe (intra ocular pressure)
IP - ciśnienie nasiąkania zrębu (inhibition pressure)
IVCM - przyżyciowa mikroskopia konfokalna (in vivo confocal microscopy) KRT3,12 - gen keratyny 3,12
LCAT - gen aminotransferazy lecytynowo-cholesterolowej LCD - dystrofia siateczkowata (Lattice Corneal Dystrophy)
LECD - dystrofia nabłonkowa Lischa (Lisch Epithelial Corneal Dystrophy)
LSCM - skaningowa laserowa mikroskopia konfokalna (laser scanning confocal microscope) MCD - dystrofia plamkowata (Macular Corneal Dystrophy)
MECD - dystrofia Meesmanna (Meesmann Corneal Dystrophy)
OCT - optyczna koherentna tomografia (Optical Coherence Tomography) PACD - dystrofia amorficzna tylna (Posterior Amorphous Corneal Dystrophy) PIP5K3 - gen kinazy lipidowej
P450 CYP4V2 - gen enzymu cytochromu 450
PDCD - dystrofia pre-Descemetalna (Pre-Descemet Corneal Dystrophy) PMMA - polimetakrylan metylu
PPCD - Posterior Polymorphous Corneal Dystrophy
RCM - moduł rogówkowy Rostock (Rostock Cornea Module)
RBCD - dystrofia Reisa-Bücklersa (Reis-Bücklers Corneal Dystrophy) RKM - rąbkowe komórki macierzyste
SCD - dystrofia krystaliczna Schnydera (Schnyder Corneal Dystrophy)
SMCD - śluzowa, podnabłonkowa dystrofia rogówki (Subepithelial Mucinous Corneal Dystrophy) SP - ciśnienie obrzękowe (swelling pressure)
SSCM - szczelinowy skaningowy mikroskop konfokalny (slit scanning confocal microscope) TACSTD2 – przekaźnik sygnału wapniowego związany z guzem
(tumor associated calcium signal transducer)
8 TBCD - dystrofia Thiel-Behnke (Thiel-Behnke Corneal Dystrophy)
TGFBI, BIGH3 - transformujący czynnik wzrostu beta (transforming growth factor beta-induced) TSCM - jednorzędowy skaningowy mikroskop konfokalny (tandem scanning confocal
microscope)
USG - ultrasonografia VSX1 - gen homeotyczny
XECD - dystrofia śródbłonka rogówki związana z chromosomem X (X-linked Endothelial Corneal Dystrophy)
9
II. WSTĘP
II.1. Rogówka
II.1.1. Rys historyczny
Pierwsze pisemne wzmianki o oku oraz o leczeniu chorób oczu pochodzą z okresu około 2500 lat p.n.e., jednak zachowany posąg pierwszego okulisty faraonów VI dynastii, Pepi-Ankh-Or-Iri, świadczy o tym, że schorzeniami okulistycznymi zajmowano się już wcześniej, bo 3000 lat p.n.e.
W egipskim papirusie z okresu ok. 1500 lat p.n.e. a znalezionym przez Georga Ebersa w 1873 roku zapisano między innymi informacje o nieżycie spojówki, zapaleniu powiek i rzęs oraz pierwszy raz w dziejach opisano bielmo, czyli chorobę dotyczącą rogówki.
Późniejsze zapisy dotyczące rogówki pochodzą z Indii, sprzed 1000 lat p.n.e. W księgach Atharwawedy widnieją opisy siedemdziesięciu czterech chorób oczu, w tym czterech chorób dotyczących rogówki oka. W księgach Charaki i Susruty - słynnych hinduskich lekarzy, oko przedstawiano jako najszlachetniejszy narząd. Sądzono, że posiada ono pięć osłon: brwi z powiekami, powieki z białkiem, białko z przejrzystą tkanką - rogówką, źrenicę oraz soczewkę, która styka się z tymi pięcioma podstawowymi elementami poprzez naczynia oka.
Nie tylko w Egipcie i Indiach zajmowano się narządem wzroku. Czynili to również Grecy. Już w V w. p.n.e. Hipokrates w swoich księgach opisywał między innymi różne typy plamek na rogówce.
W późniejszych epokach także zajmowano się chorobami rogówki. Pisał o nich w swych dziełach Jan Jonston (1603-1675), a Syreniusz - polski lekarz i botanik, w ilustrowanej księdze „Zielnik”
wydanej w 1613 roku podawał informacje o sposobie leczenia bielma rogówki za pomocą odpowiednio dobranych ziół. Niektóre z historycznych odkryć znacznie różniły się od współczesnej wiedzy. Szwajcarski uczony Albrecht von Haller, profesor anatomii, chirurgii i botaniki napisał w okresie Oświecenia, iż mimo połączenia i skrzyżowania ze sobą nerwów wzrokowych rogówka ich nie posiada. Francuski lekarz i botanik Jean Descemet (1732-1810) około roku 1758, opisał jednolitą, tylną błonę rogówki, oznaczoną później jego nazwiskiem, natomiast Johann Gottfried Zinn (1727-1759) w swojej pracy „Descriptio anatomica oculi humani iconibus illustrata” omówił warstwową budowę rogówki.
W XIX wieku James Wardrop w swoim dziele „Morbid anatomy of the eye” zawarł informacje o miąższowym zapaleniu rogówki w przebiegu kiły (a było to prawie 30 lat przed uznanym
za klasyczny, opisem Jonathana Hutchinsona). Dodatkowo doskonale opisał plamki rogówki oraz jej stożkowatość (za dziełem Antoniego Scarpy z 1802 roku), zwracając uwagę na ścieńczenie rogówki na wierzchołku stożka.
W XIX wieku lekarze okuliści zainteresowali się możliwościami przeszczepiania rogówki,
a pierwsze wzmianki o zastąpieniu zmętniałej rogówki sztucznym, przejrzystym materiałem pojawiły się już w 1789 roku. Był to pomysł francuskiego okulisty Pelliera de Quengsy. Natomiast Franz Reisinger zasugerował, aby wykorzystać w tym celu rogówkę zwierzęcą i po raz pierwszy tego typu zabieg chirurgiczny nazwał keratoplastyką.
W połowie XIX w. William Bowman (1816-1892), wybitny angielski lekarz, członek Kolegium Królewskiego w Londynie oraz chirurg w szpitalu Moorfields, zasłynął wykładami o operacjach ocznych i budowie oka. Przekazywał w nich informacje anatomiczne, które zdobył dzięki własnym doświadczeniom podczas przeprowadzonych operacji. Pisał między innymi o istnieniu rąbka rogówki oraz sprężystej blaszki przedniej. Bowman stosował też metodę chirurgicznego leczenia powierzchownych plamek rogówki poprzez ich wycinanie, dzięki czemu uzyskiwał znaczną poprawę ostrości widzenia. W 1872 roku, na IV Międzynarodowym Kongresie Okulistycznym w Londynie, szczególne zainteresowanie wzbudził referat Henry’ego Powera o przeszczepianiu rogówki. Również znakomity okazał się wykład Evariste’a Warlomonta, Hansena Gruta oraz Elkanaha Williamsa o szwach rogówkowych. Natomiast Walenty Hieronim Kamocki (1858-1923)
10 w 1893 roku napisał artykuł pt. „O stłuszczeniu rogówki” [1].
W XIX w wykonano wiele eksperymentalnych operacji na zwierzętach i stwierdzono, że aby uniknąć następczego zmętnienia przeszczepionej rogówki, należy zastosować tkankę homologiczną (ludzką).
Pierwszy udany homologiczny przeszczep rogówki przeprowadził w roku 1905 Austriak Edward Zirm (1863-1944). Operowany pacjent widział tym okiem do końca życia.
W tym okresie również Anton Elschnig (1863-1939) zasłynął jako chirurg okulista, który w szczególności zajmował się przeszczepianiem rogówki [2].
W dziełach Emila Gallemaertsa z 1925 r. zostały zamieszczone zapisy o biomikroskopii rogówki oraz opracowania zagadnień z zakresu dziedziczności w okulistyce.
Josef Schöbl (1857-1902) zaobserował i opisał między innymi nowo powstałe naczynia krwionośne w rogówce. Na przełomie wieku XIX/XX autorami wielu prac dotyczących keratoplastyki oraz leczenia tkankowego byli Wiktor Pietrowicz Odincow (1876-1938) - wybitny anatomopatolog z Czechosłowacji, Władimir Fiłatow (1875-1956) i Ignatio Barraquer (1884-1965) [1].
Należy również pamiętać o oryginalnych pracach Wessely’ego, Von Szily, Breebaarta oraz polskiego okulisty, profesora Jerzego Morawieckiego (1910-1997), które dotyczyły immunopatologii rogówki [3].
Dzięki pracy lekarzy okulistów, anatomopatologów, botaników i chirurgów, prowadzących swoje wnikliwe obserwacje, dzisiejsza wiedza dotycząca anatomii, fizjologii oraz patologii gałki ocznej, w tym rogówki, jest tak obszerna. A stały rozwój nauk medycznych i technicznych będzie nadal tę wiedzę poszerzał.
Przykładem jest odkrycie w 2013 roku nowej, szóstej warstwy rogówki. Nastąpiło to w trakcie eksperymentalnych badań nad sposobem rozwarstwiania rogówki techniką „big bubble”. Ta szósta warstwa- nazwana warstwą Dua, zlokalizowana została pomiędzy tylną częścią zrębu a błoną Descemeta i prawdopodobnie stanowi dodatkową barierę ochronną przed nadmiernym uwodnieniem istoty właściwej. Dzięki temu odkryciu powstał nowy anatomiczny podział rogówki [4].
II.1.2. Embriologia rogówki
Rozwój gałki ocznej rozpoczyna się w czwartym tygodniu ciąży, początkowo tylko od uwypuklenia neuroektodermy. W 5. tygodniu życia płodowego z neuroektodermy formuje się dwuwarstwowy kielich oczny, a z powierzchownej ektodermy tworzy się płyta soczewkowa. W tym okresie zaczyna powstawać nabłonek rogówki, spojówki oraz naskórek powiek. Jednocześnie w 5. tygodniu pierwsza grupa komórek mezenchymalnych (z grzebienia nerwowego powierzchownej ektodermy) wnika od strony rąbka pod nabłonek i zaczyna formować śródbłonek rogówki. W 6. tygodniu kolejna grupa komórek mezenchymalnych rozpoczyna formowanie zrębu rogówki oraz twardówki.
W drugim miesiącu rozwija się nabłonek spojówki i rogówki, a w miesiącu trzecim obecne są już wszystkie warstwy rogówki z wyjątkiem błony Bowmana, pojawiającej się w 4. miesiącu życia płodowego. Powieki zaczynają się otwierać w 6. miesiącu. W okresie poporodowym rogówka i twardówka są dosyć elastyczne, ale w ciągu pierwszych lat życia stopniowo sztywnieją [5].
II.1.3. Fizjologia rogówki
Aparat ochronny oka oraz takie struktury jak: powieki, spojówka, twardówka i rogówka stanowią niezwykle ważną część ciała ludzkiego, narażoną na ciągły wpływ świata zewnętrznego.
Działanie amortyzujące tkanek okołogałkowych zapewnia ochronę gałki. Brwi oraz rzęsy wychwytują drobne zanieczyszczenia, a dodatkowo rzęsy pełnią funkcję sensorów wyzwalających odruch zamykania powiek. Mruganie wspomaga pompę łzową i przez to ułatwia spłukiwanie drobnych cząstek przez łzy. Film łzowy rozcieńcza toksyny i alergeny oraz zawiera proteiny kontrolujące naturalną florę bakteryjną worka spojówkowego. Mucyny są stabilizatorami filmu
11 łzowego i odgraniczają żywe komórki nabłonka spojówki i rogówki od otaczającego je środowiska.
Rogówka jest przezroczystą, beznaczyniową tkanką, umiejscowioną w przednim odcinku gałki ocznej [5]. Stanowi przednią 1/6 część struktury przedniego odcinka oka [2]. Zbudowana jest z sześciu warstw [4] i stanowi najważniejszą składową układu optycznego oka [5]. Nazywana jest
„oknem” oka [6]. Mierzy od 11 do12 mm w poziomie oraz od 10 do11 mm w pionie [5]. Jest cieńsza w centrum, gdzie jej grubość wynosi około 0,5-0,6 mm [2], z najcieńszym obszarem zlokalizowanym ok. 1,5 mm w kierunku skroniowym od geograficznego centrum [5], nieco grubsza jest przyrąbkowo, gdzie wynosi 6,9 mm [2]. Rogówka ma wypukły, nieco eliptyczny kształt oraz budowę asferyczną [5].
Środkowa część rogówki o średnicy około 4 mm stanowi strefę optyczną oka, która pokrywa źrenicę i jest miejscem centralnego widzenia. Jeśli centrum nie jest sferyczne (w jednym kierunku występuje inny promień krzywizny niż w drugim), pojawia się astygmatyzm. W centrum rogówki jej przednia i tylna powierzchnia są równoległe, ale obwodowo, wraz z coraz grubszą budową, powierzchnie te tracą paralelny układ [6]. Średni promień krzywizny przedniej powierzchni centralnej rogówki wynosi 7,8 mm (6,7-9,4 mm) [5], a tylnej około 6,9 mm [2]. Krzywizna ta w kierunku rąbka staje się coraz bardziej płaska. Ponieważ pozostała część gałki ocznej ma większy promień krzywizny (ok 11,5 mm), w miejscu przejścia rogówki w twardówkę powstaje małe wgłębienie przy rąbku [6].
Rogówka stanowi 74%, czyli 43,25 D całkowitej mocy łamiącej oka, wynoszącej 58,6 D [5]. Jest najsilniejszym ośrodkiem refrakcyjnym oka ze współczynnikiem refrakcji wynoszącym 1,376.
Ta właściwość wykorzystywana jest w chirurgii refrakcyjnej, gdzie dokonywana jest zmiana kształtu rogówki, która ma wpływ na ostateczną moc optyczną oka [6].
Rogówka odżywiana jest przede wszystkim dzięki glukozie, która dyfunduje z cieczy wodnistej oraz dzięki dostępowi tlenu, który dociera do rogówki poprzez film łzowy z powietrza [5]. Krew doprowadzana jest do rogówki za pośrednictwem naczyń spojówki, nadtwardówki i twardówki.
Naczynia krwionośne rąbka rogówki zaopatrują w tlen jedynie jej część obwodową. Drobne kapilary docierają do rąbka rogówki, ledwie go przekraczając, a następnie zaginają się z powrotem.
Dlatego prawidłowa rogówka jest strukturą beznaczyniową [6].
Należy zwrócić uwagę, iż gęstość zakończeń nerwowych rogówki jest jedną z najwyższych w ludzkim ciele. Czułość rogówki jest 100-krotnie wyższa niż spojówki [5]. Unerwienie pochodzi z gałęzi ocznej nerwu trójdzielnego. Nerwy wnikają w rogówkę od strony twardówki, głównie przez długie nerwy rzęskowe tylne. Niewielki procent nerwów przechodzi przez nadtwardówkę.
Po przejściu 2-3 mm od rąbka tracą one osłonki mielinowe i stają się bardzo cienkie, dzięki czemu nie zaburzają jej przezroczystej struktury w centrum [6]. Czuciowe włókna nerwowe rogówki tworzą splot podnabłonkowy. Neuroprzekaźnikami są acetylocholina, katecholaminy, substancja P oraz peptyd zależny od genu kalcytoniny [5].
Tkanka rogówkowa cechuje się słabym uwodnieniem, z wyjątkiem jej wewnętrznej i zewnętrznej powierzchni. Jeśli rogówka ulega silnemu uwodnieniu, traci swą przezierność [6].
12 Ryc. 1. Anatomia gałki ocznej
II.1.4. Budowa rogówki
Ryc. 2. Budowa rogówki
13 Dotychczas rogówka w swej budowie zawierała pięć warstw. Od 2013 roku i dość przełomowej publikacji dra Harmindera Dua [4] uważa się, że zbudowana jest z warstw sześciu: nabłonka, warstwy Bowmana, istoty właściwej in. zrębu, warstwy Dua, błony Descemeta oraz środbłonka.
Nabłonek i film łzowy tworzą jednolitą powierzchnię pod względem optycznym. Komórki nabłonka posiadają ścisłe połączenia, co zapobiega wnikaniu wydzieliny łzowej w istotę właściwą rogówki [5].
Nabłonek rogówki składa się z 5 - 6 warstw nabłonka wielowarstwowego płaskiego, nierogowaciejącego. Całkowita grubość nabłonka rogówki wynosi około 50-60 μm, co stanowi 5 % całkowitej grubości rogówki. W okolicy rąbka nabłonek staje się grubszy i może składać się nawet z 10 warstw, a w rąbku rogówki w sposób ciągły przechodzi w nabłonek spojówki.
Komórki nabłonka rogówki nie zawierają melanocytów, z wyjątkiem nabłonka w rąbku u osób o ciemniejszej karnacji. Większa część komórek nabłonka pozbawiona jest również komórek immunokompetentnych Langerhansa (drzewkowatych), ale występują one w jego obwodowych częściach. Warstwę nabłonka tworzą: komórki nabłonka powierzchownego, komórki nabłonka strefy pośredniej (skrzydłowate), komórki walcowate oraz błona podstawna.
Powierzchowne komórki nabłonka to komórki o płaskiej budowie, posiadające poziome jądra komórkowe. Ściśle do siebie przylegają dzięki desmosomom. Badania ultrastrukturalne zewnętrznej powierzchni komórek powierzchownych wykazały obecność mikrokosmków i mikrofałd, które są zanurzone w filmie łzowym. Niektóre komórki obserwowane w mikroskopie elektronowym są jaśniejsze i posiadają liczne mikrokosmki, natomiast inne - ciemniejsze mają niewielką ilość centralnie umiejscowionych mikrokosmków. Uważa się, że mikrokosmki i mikrofałdy powierzchownych komórek nabłonka rogówki zatrzymują film łzowy, zapewniając im odpowiednie nawilżenie.
Komórki skrzydłowate, inaczej komórki nabłonka rogówki strefy pośredniej, mają kształt wieloboczny, posiadają okrągłe bądź owalne jądra komórkowe oraz są wypukłe na przednich, a wklęsłe na tylnych powierzchniach. Połączone są ze sobą za pomocą desmosomów. Boczne ściany komórek skrzydłowatych posiadają liczne wypustki cytoplazmatyczne oraz połączenia szczelinowate (gap junctions), które umożliwiają przenikanie małych cząsteczek pomiędzy komórkami.
Komórki walcowate, inaczej komórki podstawne nabłonka rogówki, są najgłębiej położoną warstwą nabłonka. Ich boczne ściany posiadają liczne desmosomy, wypustki cytoplazmatyczne oraz połączenia szczelinowate służące do komunikacji pomiędzy komórkami tej warstwy.
Przytwierdzone są do błony podstawnej za pomocą hemidesmosomów. Te natomiast przymocowane są również do istoty właściwej przy pomocy włókien kotwiczących, przenikających błonę podstawną oraz warstwę Bowmana.
Włókna kotwiczące, inaczej mocujące, zbudowane są z typu VII kolagenu, a dzięki licznym odgałęzieniom w istocie właściwej wnikają w siatkę włókien zbudowanych z typu VI kolagenu, nazywanych płytkami kotwiczącymi [2].
Błona podstawna nabłonka rogówki jest wyraźnie zaznaczoną warstwą, a jej grubość wynosi ok. 50 nm. Mocno przylega do leżącej poniżej warstwy Bowmana, a wybarwia się metodą PAS.
Pomiędzy komórkami nabłonka znajdują się obnażone czuciowe zakończenia nerwowe, tworzące splot podnabłonkowy. Włókna te są wrażliwe głównie na ból.
Całkowity cykl odnowy komórek nabłonka rogówki wynosi 7 dni [2]. Inne źródła podają, iż proces różnicowania trwa od 7do 14 dni [5]. Nowe komórki wytwarzane są poprzez podziały mitotyczne komórek podstawnych rąbka rogówki. Komórki te układają się w rąbku w promieniste fałdy, tworząc palisady Vogta i zwiększając tym samym liczbę komórek podstawnych.
W obrębie palisad Vogta znajdują się rąbkowe komórki macierzyste (RKM) odpowiedzialne
14 za odnowę komórek nabłonka oraz za zachowanie granicy rogówka-spojówka [2].
Nieustanna proliferacja okołorąbkowych komórek podstawnych nabłonka daje początek innym warstwom, które różnicują się w komórki powierzchowne. Następnie, w miarę dojrzewania komórki te pokrywają się mikrokosmkami na zewnętrznej powierzchni, złuszczają się i są spłukiwane przez łzy [5]. Należy podkreślić fakt, iż nabłonek rogówki jest najszybciej regenerującą się tkanką organizmu ludzkiego [6]. Powierzchowne, niewielkie ubytki mogą się zregenerować w czasie od kilku do kilkunastu godzin.
Warstwa Bowmana, inaczej blaszka graniczna przednia, zlokalizowana jest tuż pod błoną podstawną nabłonka. Jej grubość wynosi 8-12 μm. To bezkomórkowa warstwa, zbudowana z przeplatających się włókien kolagenowych, głównie typu I i II, które zanurzone są w substancji międzykomórkowej.
W badaniu mikroskopem elektronowym wykazano, iż kolagen tej warstwy rogówki jest delikatniejszy i ułożony bardziej przypadkowo w porównaniu do istoty właściwej.
Warstwa ta kończy się ostro w rąbku rogówki, a jej tylna powierzchnia zlewa się z istotą właściwą.
Istota właściwa rogówki (zrąb rogówki) stanowi około 90 % grubości rogówki. Jest strukturą przezroczystą, włóknistą i zwartą. Zbudowana jest z macierzy pozakomórkowej, keratocytów, czyli fibroblastów rogówkowych oraz włókien nerwowych. Należy podkreślić, iż komórki tej warstwy rogówki zajmują jedynie 2 - 3 % całkowitej objętości zrębu. Pozostałą część stanowią kolagen i glikozaminoglikany (głównie dekoryna i lumikan), wchodzące w skład macierzy pozakomórkowej. Wytwarzane są one przez keratocyty. Włókna kolagenowe ułożone są równolegle do powierzchni i tworzą blaszki istoty właściwej. Zbudowane są głównie z t. I kolagenu
i częściowo z typu III, V i VI. Każda blaszka ma grubość ok. 2 µm, a ich liczba w zrębie rogówki sięga od 200 do 250. Kierunek ułożenia włókien kolagenowych w obrębie danej blaszki jest taki sam, ale włókna te przebiegają pod kątami prostymi do włókien sąsiednich blaszek. Średnica włókien kolagenowych, które są nieco większe w tylnej części rogówki wynosi ok 21-65 nm.
Włókna te są zanurzone w glikozaminoglikanach, a pomiędzy sąsiadującymi blaszkami obecne są spłaszczone, wrzecionowate fibroblasty, o licznych, cienkich wypustkach komórkowych.
Sąsiadujące keratocyty stykają się ze sobą za pomocą wypustek i połączeń szczelinowatych, formując spiralną, trójwymiarową sieć komórkową. Czasami uwidocznić można również makrofagi, limfocyty oraz leukocyty wielojądrzaste [2].
Zagęszczenie oraz wzajemny stosunek ilościowy poszczególnych preteoglikanów w przedniej i tylnej części zrębu są różne. Również tylna część zrębu jest silniej uwodniona niż przednia.
Blaszki przedniej części zrębu są krótkie i wąskie z rozległymi połączeniami między warstwami, podczas gdy tylna część zrębu ma grube, szerokie i długie blaszki rozciągające się od rąbka
do rąbka z nikłymi połączeniami między blaszkami.
Ludzka rogówka w warunkach normalnych wykazuje małą elastyczność i rozciąga się zaledwie o 0,25 % przy prawidłowym ciśnieniu wewnątrzgałkowym.
Sposób ułożenia włókien kolagenowych w macierzy pozakomórkowej jest częściowo odpowiedzialny za przejrzystość rogówki. Kraciaste ułożenie włókien zachowuje się jak siatka dyfrakcyjna. Redukuje rozproszone światło przez wygaszanie interferujących się fal. Większe rozproszenie dotyczy przedniej części rogówki z powodu większego czynnika refrakcji, który maleje od 1,401 na poziomie nabłonka poprzez 1,380 w zrębie do 1,373 w tylnej części. Rogówka zachowuje swą przezroczystość, ponieważ rozmiary elementów tworzących siatkę są mniejsze niż długość fali światła widzialnego.
Na przejrzystość rogówki wpływa również w dużym stopniu stan jej uwodnienia. Prawidłowa zawartość wody w zrębie wynosi 78 %. Uwodnienie jest w dużym stopniu kontrolowane przez prawidłową barierę, którą stanowi nabłonek i śródbłonek rogówki oraz dzięki prawidłowo funkcjonującej pompie śródbłonkowej. Pompa ta powiązana jest z systemem transportu jonów kontrolowanym przez zależne od temperatury enzymy, takie jak ATP-aza Na-K. Dodatkowo,
15 glikozaminoglikany zrębu, mające ujemny ładunek, odpychają się wzajemnie, wytwarzając ciśnienie obrzękowe (swelling pressure- SP). Ponieważ ciśnienie wewnątrzgałkowe (intra ocular pressure-IOP) ma tendencję do ściskania rogówki, ogólne ciśnienie nasiąkania zrębu (IP-inhibition pressure) otrzymuje się z odjęcia IOP-SP.
Całkowite śródbłonkowe ciśnienie osmotyczne jest obliczane przez dodanie ciśnienia nasiąkania i gradientu elektrolitów, wytworzonych dzięki śródbłonkowym kanałom transportowym [5].
W prawidłowej, nieuszkodzonej rogówce keratocyty zawierają małe ilości szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. Podczas urazu następuje zniszczenie sieci keratocytów oraz połączeń między nimi w okolicy uszkodzenia. Keratocyty stają się wówczas „aktywowanymi” fibroblastami i pełnią kluczową rolę w gojeniu ran istoty właściwej, a także w patogenezie owrzodzeń rogówki. Niektóre z „aktywowanych” fibroblastów mogą różnicować się w miofibroblasty posiadające duże ilości α- aktyny w obrębie cytoplazmy (charakterystycznej dla mięśni gładkich), umożliwiającej kurczenie otaczającej macierzy. Gojenie ran istoty właściwej rogówki następuje wolniej niż w przypadku innych rodzajów tkanki łącznej. Spowodowane jest to prawdopodobnie brakiem naczyń krwionośnych. W następstwie rany ciętej zrębu rogówki pozakomórkowa macierz pochłania wodę i staje się obrzęknięta w okolicy rany. Keratocyty, zlokalizowane na brzegu rany na głębokości ok.
200 mikronów, giną w mechanizmie apoptozy. Poza strefą keratolizy keratocyty stają się
„aktywowane”: przekształcają się w komórki o dużych ilościach szorstkiego retikulum endoplazmatycznego, wytwarzają większe ilości białek i DNA oraz migrują w kierunku miejsca uszkodzenia. Takie keratocyty mogą przyczyniać się do rozmiękania istoty właściwej rogówki poprzez zwiększenie produkcji i wydzielania enzymów proteolitycznych. Mają też zdolność
do fagocytowania obcych cząsteczek.
Warstwa Dua
W 2013 r., badania dra Hermindera Dua wykazały obecność dodatkowej, nowej, predescemetalnej warstwy rogówki, zlokalizowanej za ostatnim rzędem keratocytów tylnej stromy. Warstwa ta opisana została jako dobrze odgraniczona i bezkomórkowa. Wykryta została przypadkowo podczas rozwarstwiania rogówki techniką „big bubble”. Uważa się, że odkrycie to będzie miało znaczący wpływ na techniki operacyjne w obrębie tylnych warstw rogówki oraz pozwoli lepiej zrozumieć biomechanizmy i patologie tylnej rogówki, takie jak ostry wodniak, descemetocoele czy dystrofie predescemetalne [4].
16 Ryc. 3. Warstwa Dua
Błona Descemeta, inaczej blaszka graniczna tylna, położona jest na tylnej granicy istoty właściwej rogówki i stanowi błonę podstawną dla komórek śródbłonka. Jest warstwą jednorodną i mocną oraz ostro odgranicza się od zrębu. W początkowym okresie życia błona Descemeta wraz ze śródbłonkiem ma grubość 3 - 4 μm. W ciągu życia grubość błony wzrasta do 10 - 11 µm. Posiada duże właściwości elastyczne, a po pęknięciu wykazuje tendencję do zwijania się w specyficzne zwoje. Cecha ta jest histologicznie patognomoniczna i pozwala na rozpoznanie wcześniejszego uszkodzenia błony Descemeta. Zbudowana jest z delikatnych włókien kolagenu t. IV, ułożonych w sześciokątny układ i zanurzonych w macierzy pozakomórkowej.
Błona Descemeta posiada właściwości regeneracyjne, w przeciwieństwie do błony Bowmana.
Na obwodzie rogówki można zaobserwować małe, pokryte śródbłonkiem wypukłości błony, skierowane ku komorze przedniej, występujące częściej wraz z wiekiem. Są to ciałka Hassalla- Henlego. Błona Descemeta kończy się ostro na poziomie linii Schwalbego i płynnie przechodzi w tkankę beleczkowania. Linia Schwalbego stanowi przedni, graniczny pierścień beleczkowania [2].
Śródbłonek rogówki zbudowany jest z pojedynczej warstwy ściśle przylegających do siebie komórek o heksagonalnym kształcie, tworzących regularną mozaikę [5].
Błona komórkowa tych wielobocznych komórek posiada wypustki łączące je ze sobą.
Cytoplazma komórek śródbłonka zawiera liczne mitochondria, wyraźne retikulum endoplazmatyczne oraz aparat Golgiego. Obecność wielu organelli komórkowych wskazuje, że śródbłonek rogówki pełni aktywną rolę w syntezie i transporcie płynu. Komórki śródbłonka powiązane są ze sobą za pomocą połączeń zamykających (tight junctions), a na ich wolnych powierzchniach znajdują się pojedyncze mikrokosmki, które pełnią kluczową rolę w kontrolowaniu stanu uwodnienia rogówki poprzez ograniczanie wnikania wody z cieczy wodnistej do zrębu oraz przez mechanizm aktywnego transportu. Przytwierdzone są do błony Descemeta za pomocą hemidesmosomów. Liczba komórek śródbłonka maleje po urodzeniu proporcjonalnie
do powiększania się powierzchni rogówki i osiąga gęstość ok. 3000 komórek na mm² [2].
Prawidłowa gęstość komórek śródbłonka jest największa na obwodzie. Wraz z wiekiem liczba komórek zmniejsza się na skutek apoptozy lub mikrourazów. Komórki ludzkiego śródbłonka nie
17 mają zdolności do proliferacji in vivo [5]. Niektóre źródła podają jednak, że posiadają niewielką zdolność do odnowy, która jednak maleje wraz z wiekiem [2]. Utrata którejś z komórek śródbłonka powoduje, że komórki sąsiednie powiększają się i nachodzą na pozbawione śródbłonka miejsce, starając się je pokryć [5]. Czasem dochodzi do podziałów mitotycznych. Urazy, zwłaszcza
w starszym wieku, prowadzą do znacznego zmniejszenia liczby komórek oraz zaburzenia ich kształtu. Może to doprowadzić do dekompensacji rogówki i jej obrzęku.
Rąbek rogówki zajmuje obszar 1,5 - 2,0 mm szerokości na granicy rogówki i twardówki oka. Jest to okolica bogato unerwiona i unaczyniona, która może być chroniona przed potencjalnymi uszkodzeniami UV dzięki obecności barwnika melaniny. Od zewnętrznej strony widoczny jest płytki rowek nazywany zewnętrzną bruzdą twardówki, a od wewnętrznej strony znajduje się podobny rowek - bruzda twardówki wewnętrzna, zawierająca beleczkowanie i zatokę żylną twardówki (kanał Schlemma). Tylny brzeg bruzdy wewnętrznej tworzy wystającą krawędź tkanki twardówki, nazywaną ostrogą twardówki. W rąbku rogówki obserwuje się morfologiczną zmianę poszczególnych warstw rogówki, które kończą się w tym miejscu i przechodzą w inne tkanki.
I tak: nabłonek rogówki przechodzi płynnie w nabłonek spojówki, warstwa Bowmana zlewa się z istotą właściwą spojówki oraz torebką Tenona. Istota właściwa traci stopniowo swoją jednolitą i uporządkowaną budowę oraz przeobraża się w tkankę twardówki. Błona Descemeta kończy się ostro na poziomie linii Schwalbego i w sposób płynny przechodzi w tkankę beleczkowania.
Śródbłonek rogówki zmienia się w śródbłonek beleczkowania [2].
II.1.5. Metody badania i obrazowania rogówki
Biomikroskopia to badanie w lampie z oświetleniem szczelinowym. Przeprowadza się je
za pomocą binokularnego teleskopu Galileusza, który charakteryzuje się możliwością regulacji powiększenia. Dodatkowo można też zastosować oświetlenie bezpośrednie takie jak: światło rozproszone, szczelinowe, odbicie lustrzane oraz oświetlenie pośrednie, na które składają się oświetlenie bliskie, rozproszenie twardówkowe oraz retroiluminacja.
Badanie rogówki w lampie szczelinowej może być dokładniejsze dzięki zastosowaniu barwników hydroksyksantynowych, takich jak: fluoresceina stosowana do wykrywania połączeń międzykomórkowych, róż bengalski uwidaczniający nieprawidłowe komórki nabłonka oraz paski z zielenią lizaminy.
Pachymetria rogówkowa służy do badania grubości rogówki. Badanie to jest bardzo istotne
w diagnostyce pacjentów z jaskrą oraz w chirurgii refrakcyjnej. Pomiar ten można uzyskać za pomocą pachymetrii optycznej, ultradźwiękowej, koherentnej tomografii optycznej przedniego odcinka oka (OCT) oraz mikroskopii konfokalnej.
Estezjometria jest badaniem czucia rogówki. Ma zastosowanie głównie przy ocenie keratopatii neurotroficznej oraz m.in. u pacjentów z obniżonym czuciem rogówkowym spowodowanym cukrzycą. Stosowana jest głównie podczas badań naukowych, ponieważ umożliwia pomiar ilościowy. Natomiast ocena jakościowa czucia rogówki nie wymaga specjalnych instrumentów.
Fotografia przedniego odcinka oka. W celu pozyskiwania dokumentacji zmian przedniego odcinka gałki ocznej, w tym rogówki, stosuje się fotografię lub wideofotografię z użyciem lampy szczelinowej sprzężonej z aparatem fotograficznym.
Fotomikroskopia lustrzana wykorzystywana jest do dokładnej oceny komórek śródbłonka rogówki. Badanie to ma ogromna wartość przy ocenie stanu śródbłonka przed zabiegami wewnątrzgałkowymi oraz przy ocenie śródbłonka rogówki dawcy przed planowanym jej przeszczepieniem. W mikroskop lustrzany bywa też często wbudowany pachymetr [5].
18 Topografia rogówki umożliwia pomiar krzywizny całej rogówki, dzięki czemu uzyskuje się jej komputerową mapę. Metodę tę stosuje się głównie w chirurgii refrakcyjnej, w monitorowaniu pacjentów ze stożkiem rogówki oraz w doborze soczewek kontaktowych.
Również keratometr służy do pomiaru krzywizny rogówki, lecz jest to badanie mniej dokładne niż topografia. Używany jest głównie w kontaktologii, przy ocenie mocy planowanego wszczepu wewnątrzgałkowego oraz w refraktometrii.
Keratoskopia (keratoskop Placido) pozwala ocenić odbicia koncentrycznych linii na rogówce badanego, ich podobieństwo w każdym oku oraz ich kształt. Służy do badania wypukłości rogówki, ale nie w sposób ilościowy [6], gdyż daje jedynie ich obraz.
Optyczna koherentna tomografia (OCT) przedniego odcinka oka umożliwia obrazowanie zmian rogówki, m.in. po keratoplastyce warstwowej, drążącej, po zabiegach chirurgii refrakcyjnej oraz ocenę stożka rogówki, zmian w dystrofiach oraz pomiar grubości rogówki.
UBM - ultrabiomikroskopia odcinka przedniego. UBM służy do badania rogówki, komory przedniej, kąta przesączania, tęczówki, soczewki oka oraz ciała rzęskowego. Umożliwia również ocenę głębszych struktur oka przy zmętniałej rogówce.
Mikroskopia konfokalna in vivo (IVCM- in vivo confocal microscopy) jest wyjątkowo szczegółowym badaniem rogówki, obrazującym jej poszczególne warstwy na poziomie histologicznym. Może być stosowana również do wykonywania pomiarów pachymetrycznych oraz do oceny liczby komórek śródbłonka rogówki.
II.2. Mikroskopia konfokalna rogówki in vivo II.2.1. Wstęp, definicja
Mikroskopia konfokalna in vivo jest nieinwazyjnym badaniem rogówki, pozwalającym
na przyżyciową ocenę jej struktury. Umożliwia dokumentację i diagnozowanie zmian o niejasnej etiologii. Pozwala na dokładną ocenę wszystkich warstw rogówki i obserwację występujących patologii bez konieczności wykonywania preparatów histologicznych [7].
Specjalistyczny mikroskop nazywany jest konfokalnym ze względu na to, iż soczewka kondensatora i soczewka obiektywu mają ten sam punkt skupiający [8].
W ciągu ostatnich trzydziestu lat dzięki rozwojowi mikroskopii lustrzanej, topografii rogówki, OCT przedniego odcinka, USG o wysokiej rozdzielczości szeroko rozwinęły się kliniczne techniki przyżyciowego badania rogówki na poziomie globalnym oraz komórkowym [9].
Metody badania rogówki umożliwiające ocenę na poziomie komórkowym lub mikrostrukturalnym są niezwykle ważne dla specjalistów zajmujących się schorzeniami rogówki. Dzięki zastosowaniu mikroskopii konfokalnej in vivo uzyskano obrazowanie cienkich optycznych sekcji przezroczystych struktur rogówki, które odbijają jedynie 1% światła. Jednak, mimo że mikroskopia świetlna
i elektronowa dostarcza wielu ważnych informacji dotyczących rogówki, istnieją ograniczenia spowodowane przez efekty degeneracji tkanek, obecność artefaktów, jak również w dostępności do właściwych warstw rogówki.
19
II.2.2. Historia rozwoju mikroskopu konfokalnego
Mikroskop konfokalny jako pierwszy opisał Hans Goldmann w 1940 r., a w 1955 r. opatentował go Marvin Minsky [10-12]. Jego prototyp, zwany podwójnie skupiającym etapowym mikroskopem skaningowym, umożliwiał przekrojowe badanie próbek tkanek i zbudowany był z napędzanego elektrycznie kamertonu.
W 1968 r. skonstruowano pierwszy TSCM (Tandem Scanning Confocal Microscope) - jednorzędowy skaningowy mikroskop konfokalny (Petran i wsp.). W tym modelu pole obrazu utworzone było przez jednoczesne skanowanie licznych punktów stacjonarnej próbki, przy użyciu obrotowego dysku Nipkowa. Mikroskop ten używany był do obrazowania tkanki mózgowej oraz komórek zwojowych u salamander i żab [13]. Musiało minąć jednak kolejnych 20 lat, aby TSCM został użyty do zbadania tkanki ocznej [9].
W 1985 r. po raz pierwszy zobrazowano pełną grubość ludzkiej rogówki ex vivo oraz rogówki królików in situ (Lemp i wsp.) [14].
Kliniczna wersja tego typu mikroskopu została wyprodukowana przez Tandem Scanning Corporation, ale obecnie nie jest już on w sprzedaży [15].
Równolegle z TSCM udoskonalano szczelinowy skaningowy mikroskop konfokalny SSCM (Slit Scanning Confocal Microscope).
W roku 1969 Svishcher wyprodukował skaningowy mikroskop konfokalny obustronnego lustra (Scanning Two-Sided Mirror Confocal Microscope). Zbudowano go przy użyciu oscylacyjnych obustronnych luster służących do jednoczesnego skaningu i deskaningu badanej próbki. Mikroskop ten używany był do obserwacji żywych tkanek neuronalnych [16]. Model ten został następnie zmodyfikowany w celu umożliwienia skanowania w czasie rzeczywistym (Thaer) [17].
Najbardziej współczesnym odkryciem jest użycie koherentnego światła, które ma zastosowanie w laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym in vivo (Rostock Cornea Module, HRT II).
Obecnie używane szczelinowe skaningowe mikroskopy konfokalne in vivo to Confoscan P4 (Tomey Corporation, Cambridge, MA, USA), Confoscan 4 (Nidek Technologies, Gamagori, Japan) i Microphthal (Helmut Hund, Wetzlar, Germany). Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny in vivo dostępny jest jako Heidelberg Retina Tomograph II, Rostock Cornea Module (RCM, Heidelberg Engineering, GmBH, Germany) [9].
Zasada działania
Wszystkie mikroskopy konfokalne posiadają tę samą zasadę działania - światło przechodzi przez szczelinę i skupia się dzięki soczewce obiektywu na małym obszarze badanej próbki. Następnie światło odbite od próbki przechodzi przez kolejną soczewkę obiektywu, gdzie ponownie zostaje skupione dzięki drugiej szczelinie, ułożonej tak, że część światła (poza tym skupiającym) jest eliminowana [9, 18]. Zapobiega to rozmazywaniu obrazu, które zwykle jest wynikiem jednoczesnego oświetlania wielu punktów oglądanego obiektu.
Ścieżki oświetlenia i detekcji dzielą tę samą płaszczyznę odwzorcowania obiektywu (focal plane), dlatego używany jest termin mikroskopii konfokalnej (confocal -having the same foci, czyli konfokalny - mający to samo skupienie, ogniskową). Zdolność tego systemu do rozróżniania światła, które nie jest w płaszczyźnie odwzorcowania obiektywu, dostarcza obrazy o wyższej bocznej i osiowej rozdzielczości w porównaniu z mikroskopią świetlną. Taki system jest jednak ograniczony z powodu małego pola obrazowania. Większe pole obrazu może być uzyskane poprzez skanowanie próbki. Uzyskuje się to albo przez poruszanie próbki badanej, podczas gdy mikroskop pozostaje stacjonarny, albo przez poruszanie systemu konfokalnego nad stacjonarną próbką badaną [19]. Nowoczesny mikroskop konfokalny wykorzystuje tę drugą technikę. Ostatecznie prędkość, z jaką pojedynczy obraz z badanego pola zostaje uzyskany, determinuje czasową rozdzielczość. Jest to ważne, ponieważ słaba czasowa rozdzielczość połączona jest ze wzrostem ilości artefaktów ruchu, gdyż podczas badania pacjentów występują ruchy mimowolne, puls, ruchy oddechowe oraz
20 ruchy oczu [9]. Sygnały produkowane przez odbite światło przyżyciowych mikroskopów konfokalnych są zazwyczaj wykrywane przez detektory elektroniczne, takie jak kamery oparte na CCD (Charge Coupled Device), czyli przetworniku obrazu w kamerze TV. Dostępne jest ujęcie obrazu w formie video lub obrazu cyfrowego, z częstością uzyskiwania zdjęć co najmniej 25 klatek na sekundę [20].
Fotografie wykonywane mikroskopem konfokalnym dokumentują optyczne przekroje tkanki, dzięki rejestracji obrazów niezakłóconych przez światło odbite poza badaną głębokością, które zaburzałoby obraz w klasycznym mikroskopie świetlnym czy biomikroskopie. Efekt ten uzyskiwany jest w różny sposób w przypadku każdego z trzech obecnie sprzedawanych na świecie aparatów do przyżyciowej mikroskopii konfokalnej rogówki [21].
II.2.3. Typy współcześnie stosowanych mikroskopów konfokalnych
TSCM (Tandem Scanning Confocal Microscope) - jednorzędowy mikroskop konfokalny, który zawiera rotujący dysk Nipkowa, posiadający 64000 otworków ułożonych w spiralę Archimedesa.
Otworki mają 20 - 60 µm średnicy, w zależności od modelu mikroskopu. Dysk obraca się
z prędkością 900 obrotów/min, z jednoczesną iluminacją światła przez ok. 100 otworków. Odbite światło przechodzi przez sprzężone otworki na drugiej, przeciwległej stronie dysku. Szybki ruch rotacyjny dysku umożliwia skanowanie całej badanej próbki. Stosunek obszaru dysku do otworków determinuje transmisję światła, która sięga od 0,5% - 1% (0,5% dla 20 µm otworków).
Aby wyrównać stosunkowo słabą transmisję światła mikroskopu konfokalnego, TSCM wymaga bardzo jasnego źródła iluminacji, takiego jak lampa ksenonowa lub rtęciowa, o wyładowaniu łukowym [22, 23].
SSCM (Slit Scanning Confocal Microscope) - szczelinowy mikroskop konfokalny, w którym zastosowano dwie optycznie sprzężone szczeliny służące do iluminacji i detekcji odbitego światła.
Szybko oscylujące dwustronne lustro skanuje obraz ze szczeliny na obiektyw mikroskopu
i deskanuje odbite światło z obiektu. Użycie oświetlenia szczelinowego posiada dwie główne zalety, w przeciwieństwie do punktowego. Pierwsza dotyczy przepustowości światła, która jest znacząco wyższa niż w TSCM, co oznacza, iż użyte źródło oświetlenia może być słabsze (12-V lampa halogenowa) i pozwala na kontynuowanie badania przez ok. 30 min, bez indukowania powidoków [17]. Druga zaleta polega na równoległym skanowaniu bardzo wielu punktów, co znacznie skraca czas badania. Jednakże należy zaznaczyć, iż użycie szczeliny oznacza również to, że mikroskop ten jest rzeczywiście konfokalny jedynie w osi prostopadłej do wysokości szczeliny [18, 23].
LSCM (Laser Scanning Confocal Microscope) - laserowy skaningowy mikroskop konfokalny, RCM - Rostock Cornea Module, Heidelberg Retina Tomograph II).
LASEROWY SKANINGOWY MIKROSKOP KONFOKALNY wykorzystuje źródło lasera czerwonego o długości fali 670 nm (podczerwień, dioda helowo-neonowa). Oświetlenie następuje pojedynczą, koherentną długością fali. System ten nie stwarza żadnego ryzyka dla bezpieczeństwa narządu wzroku. Jednakże, aby zagwarantować bezpieczeństwo operatora i podmiotu, producenci narzucili limit dotyczący maksymalnego czasu ekspozycji wynoszący 3000 s (50 min) na pojedyncze badanie.
Wiązka promieni lasera skanowana jest sekwencyjnie nad każdym punktem badanego obszaru.
Aby zeskanować obraz, wiązka lasera musi być ugięta w dwóch przeciwległych kierunkach. Jest to możliwe do osiągnięcia dzięki 2 skanującym lustrom: okulistyczny analizator skanuje wiązkę poziomo, aby wyprodukować linię skanu, a galwanometryczny analizator skanuje tę linię pionowo, aby stworzyć obszar skanu. Deskanowanie odbitego światła wykonywane jest również przez te dwa lustra. Odbite światło jest załamane w kierunku detektora, którym jest fotograficzna dioda
lawinowa. Sygnał z diody fotograficznej zostaje przekształcony w formę cyfrową i w ten sposób
21 uzyskuje się dane cyfrowe obrazu [9, 23].
Ryc 4. Mikroskop konfokalny - budowa.
Ryc. 5. Rostock Cornea Module (RCM), HRT II.
22 Obraz w mikroskopii konfokalnej
Jakość obrazu zależy głównie od dwóch czynników: od kontrastu i rozdzielczości. Rozdzielczość z kolei uzależniona jest od apertury numerycznej soczewki obiektywu, poziomu oświetlenia, refleksywności badanej struktury i długości fali iluminowanego światła. Rozdzielczość osiowa zależy od szerokości szczeliny w przypadku SSCM lub średnicy otworków w przypadku TSCM.
Obecnie wszystkie dostępne mikroskopy konfokalne wymagają pewnej formy kontaktu z rogówką.
Obiektywy TSCM i SSCM podczas badania są optycznie połączone z rogówką za pomocą żelu.
Dystans zależy od użytej soczewki obiektywu. RCM wymaga użycia specjalnego kapturka, który spłaszcza rogówkę podczas badania. Wszystkie mikroskopy konfokalne in vivo obrazują rogówkę en face. Obrazy z RCM mają lepszy kontrast niż w SSCM. Na dodatek kontrast pozostaje
na wysokim poziomie również na obwodzie obrazu w RCM, ale znacząco spada w bocznych obszarach obrazu w SSCM [9]. Badania JP Szaflika wykazały iż nabłonek rogówki dokładniej obrazuje SSCM niż LSCM, natomiast śródbłonek rogówki lepiej uwidacznia LSCM, a efektem aplanacji rogówki za pomocą kapturka w RCM mogą być ciemne striae w tylnych warstwach istoty właściwej [24].
Należy wyciągnąć z tego wniosek taki, iż kolejne badania powinny być porównywane ze sobą jedynie wtedy, gdy zostały wykonane tym samym rodzajem mikroskopu konfokalnego.
II.2.4. Obraz zdrowej rogówki w module rogówkowym RCM (Rostock Cornea Module)
Mikroskopia konfokalna obrazuje rogówkę en face. Tego rodzaju optyczne przekroje ukazują więc odmienny obraz prawidłowej, typowej rogówki od tego, widocznego w sekcji histopatologicznej [8]. Prawidłowa ludzka rogówka składa się z sześciu warstw: z nabłonka rogówki, warstwy Bowmana, istoty właściwej, warstwy Dua, błony Descemeta oraz śródbłonka rogówki. Wszystkie te warstwy, z wyjątkiem prawidłowej błony Descemeta i nowo opisanej warstwy Dua, są widoczne w mikroskopii konfokalnej. Rozdzielczość oraz powiększenie mikroskopów konfokalnych in vivo pozwala na szczegółowe obrazowanie komórek rogówki oraz ich jąder, ale nie uwidacznia organelli komórkowych [9].
Nabłonek rogówki zbudowany jest z komórek powierzchownych, komórek skrzydłowatych, komórek podstawnych nabłonka rogówki (walcowatych) oraz błony podstawnej nabłonka.
Komórki powierzchowne mają ok. 20-30 µm długości i prawie 5 µm grubości [25], według innych autorów dochodzą do długości 40-50 µm [8]. Widoczne są jako wielokątne komórki z obecnym jądrem komórkowym, o różnym rozmiarze i refleksywności, otoczone ciemniejszą, cienką granicą [9], niekiedy opisywaną jako halo [8].
Komórki skrzydłowate posiadają najniższą reflektywność ze wszystkich komórek rogówki
i wykazują różnice w rozmiarze. Charakteryzują się jasną granicą komórki, jasnym jądrem komórkowym i brakiem ciemnej obwódki jądra, która obecna jest w komórkach powierzchownych [25].
Komórki podstawne nabłonka mają średnicę 10-15 µm [26], a według innych autorów 8-10µm [8]
i formują regularną mozaikę ciemnych komórek o jasnych granicach [9]. Granice te są często bardziej widoczne u osób z obrzękiem rogówki [8]. Średnia gęstość komórek powierzchownych i podstawnych nabłonka nie ulega zmianie wraz z wiekiem [9, 27, 28].
Komórki Langerhansa to komórki prezentujące antygen, odgrywające nieocenioną rolę w aktywacji odpowiedzi immunologicznej i indukcji tolerancji. Mogą się różnić wyglądem,
w zależności od stadium dojrzałości lub aktywności. Są to jasne cząsteczki dochodzące do 15 µm średnicy występujące w trzech formach morfologicznych: jako pojedyncze ciała komórkowe bez wyrostków, komórki z dendrytami oraz komórki zaaranżowane w sieć długich, palczastych
23 dendrytów.
Badania przy użyciu RCM udokumentowały w centrum rogówki hyperrefleksyjne struktury na poziomie nabłonka podstawnego i błony Bowmana, u 12,5 - 31,3 % prawidłowych oczu.
Komórki Langerhansa widoczne były w centralnej i dolnej części rogówki u 85,7% normalnych przypadków a ograniczały się do dolnego obwodu u 14,3 % badanych. Średnia gęstość komórek Langerhansa wynosiła ~34 komórek/mm² w centrum i ~98 kom/mm² na dolnym obwodzie.
Podobne dendrytyczne struktury obserwowane były w prawidłowych, przeciwstronnych oczach dwóch pacjentów z wywiadem w kierunku herpetycznego zapalenia rogówki.
Jednakże, struktury te nie zostały potwierdzone w żadnym dużym badaniu prospektywnym prawidłowej rogówki obrazowanej w mikroskopie konfokalnym [8, 9].
Splot nerwowy pod-podstawny to zwój nerwowy zlokalizowany pod warstwą komórek podstawnych, czyli pomiędzy błoną Bowmana a warstwą komórek podstawnych nabłonka rogówki.
Te zwoje nerwów składają się z prostych oraz położonych na zewnętrznych częściach zwoju, paciorkowatych włókien. Zakończenia paciorkowate zostały zidentyfikowane jako aksony przewodzące odśrodkowo zakończenia czuciowe i wykazano, że składają się z nagromadzenia mitochondriów i glikogenu [29-31]. W obrazie mikroskopii konfokalnej włókna te widoczne są jako poskręcane, dobrze odgraniczone linijne struktury o jednakowej, homogenicznej refleksywności.
Zaobserwowano gałęzie Y (rozgałęzione na dwie części) oraz cieńsze kłębki włókien nerwowych w kształcie litery H [32]. Badanie przy użyciu RCM objaśniło architekturę tych włókien nerwowych, demonstrując promienisty wzór zbiegających się ok. 1-2 mm poniżej szczytu rogówki o kształcie spirali [33]. Warstwa ta nie zmienia się z upływem wieku, według obecnych badań.
Opisana została również skala krętości, paciorkowatości i gęstości włókien nerwowych (turtuosity) [32]. Według innych autorów kłębczasty wzór splotu posiada wyższą gęstość nerwów w dolno - centralnej hemisferze niż centralnie [33].
Masters i Thaer wielokrotnie obrazowali identyczne pola zwojów podpodstawnych, podnabłonkowych oraz nabłonka. Badanie to ukazało dośrodkowy wzrost i przesuwanie się włókien splotu o ok. 10-20 µm na dzień [8]. Inne badanie ukazało, że nerwy istoty właściwej i ich punkty perforacji w kierunku błony Bowmana pozostają niezmienne. Komórki podstawne nabłonka i zwoju podpodstawnego pełzają dośrodkowo z różną szybkością od 1,7-32 µm/dzień [8, 34].
W 2008 roku Patel i McGhee zbudowali mapę zwoju złożoną z bardzo wielu obrazów IVCM, a migracja włókien badana była co tydzień przez 6 tygodni. Wyniki porównano z obrazem badania sprzed 2 lat. Zaobserwowano migrację dośrodkową w kierunku zwoju dolno-środkowego. Migracja ta wynosiła od 5,6 µm-25,9 µm/tydzień [8], a nerwy położone bardziej obwodowo migrowały szybciej.
Błona Bowmana, in. blaszka graniczna przednia, widoczna jest w mikroskopii konfokalnej prawidłowej rogówki jako amorficzna, jednorodna warstwa [27, 28]. Na jej poziomie mogą występować opisane wcześniej komórki Langerhansa.
Istota właściwa, in. stroma, zrąb rogówki. Mikroskopia konfokalna in vivo pozwala na obrazowanie jąder keratocytów istoty właściwej, które widoczne są jako hiperrefleksyjne jądra komórkowe. Jednakże ciała komórek, procesy komórkowe i kolagen istoty właściwej nie są zazwyczaj widoczne w prawidłowym obrazie SSCM i TSCM [20, 27, 28]. Łatwiej je zobrazować w przypadkach obrzęku rogówki lub na przykład podczas gojenia się ran rogówkowych.
Keratocyty przedniej stromy widoczne są jako dobrze odgraniczone, jasne, o owalnym lub okrągłym kształcie obiekty, rozmieszczone w różnych kierunkach na tle ciemnego tła [35].
Ich gęstość może różnić się w poszczególnych badaniach z powodu różnic osiowej rozdzielczości, kontrastu lub z powodu odmiennego podziału na części zrębu przez różnych badaczy [8].
W środkowej części istoty właściwej keratocyty mają bardziej regularny, owalny kształt, a w tylnych jej warstwach są bardziej wydłużone, o wrzecionowatym kształcie [35].
Wszystkie publikacje dotyczące gęstości keratocytów opierały się jedynie na badaniu centrum
24 rogówki. Może być ona wyrażona jako gęstość na jednostkę obszaru lub na jednostkę objętości.
Niektóre badania nie wykazały zmian w gęstości keratocytów w zależności od wieku, inne natomiast dowodzą, że maleje ona wraz z wiekiem o ok. 0,4 % rocznie [36].
Wykazano również, że spadek liczby keratocytów szybciej następuje w przedniej części zrębu o około 0,48 %, w tylnej natomiast w granicach 0,22 % rocznie [37]. W niektórych badaniach udowodniono, że liczba keratocytów maleje, im bardziej zbliżamy się do tylnych warstw rogówki w trakcie badania [36].
Większość badań wskazuje jednoznacznie, że największa liczba keratocytów znajduje się w przedniej części zrębu [9, 36].
Zwój podnabłonkowy znajduje się pomiędzy błoną Bowmana a przednią warstwą istoty właściwej. Stanowi on dość nieregularnie rozrzuconą sieć włókien ograniczoną do średniego obwodu rogówki, a prawdopodobnie nie występuje w jej centralnej części [34]. Nerwy te są dość mało kontrastowe, mają ziarnistą budowę i nieregularne zakończenia. 50% z tych zakończeń nerwowych wykazuje żylakowatość lub paciorkowatość. Nerwy istoty właściwej widoczne są w przedniej i pośredniej części istoty właściwej, ale nigdy w tylnej [32].
W mikroskopii konfokalnej in vivo widoczne są jako grube, refleksyjne, linijne struktury biegnące w różnych kierunkach, tworzące rozgałęziony na dwie części wzór [29]. Szczegóły wewnętrznej budowy tych nerwów nie są widoczne w mikroskopii konfokalnej in vivo [34].
Warstwa Dua dotychczas nie została udokumentowana w IVCM. Mogę jedynie podejrzewać, że z powodu braku komórek w tej warstwie, prawdopodobnie jest nie do odróżnienia w trakcie mikroskopii konfokalnej, tak jak i prawidłowa błona Descemeta.
Błona Descemeta, in. blaszka graniczna tylna, obecna jest w badaniu RCM jako komórkowa, amorficzna warstwa zlokalizowana pomiędzy tylną stromą a śródbłonkiem. Jednak prawidłowa błona Descemeta nie jest widoczna u młodych osób, a staje się nieco lepiej zaznaczona w badaniu mikroskopii konfokalnej in vivo u osób starszych [37].
Śródbłonek rogówki widoczny jest w CM jako zbiór heksagonalnych komórek, ułożonych
w regularnym szyku. Warstwa ta posiada komórki o jasnym ciele komórkowym i ciemnych granicach komórek [27, 28]. Dotychczasowe badania dowiodły, iż gęstość komórek śródbłonka spada znacząco wraz z wiekiem, około 0,33 % rocznie [28]. Wzrastanie polimegatyzmu tych komórek również jest proporcjonalne do wieku [37].
Komórki śródbłonka stanowią mozaikę regularnych, heksagonalnych komórek o wyglądzie plastra miodu [8]. Warto podkreślić, że IVCM umożliwia również obrazowanie śródbłonka w umiarkowanym obrzęku rogówki [8].
Ocena grubości rogówki
W mikroskopii konfokalnej in vivo istnieje możliwość pomiaru grubości rogówki za pomocą CMTF (Confocal Microscopy Through Focusing) - mikroskopia konfokalna poprzez ogniskowanie.
Możliwa jest również ocena grubości poszczególnych warstw. I tak, w CMTF, średnia grubość nabłonka w centrum rogówki wynosi 49 ± 5µm w TSCM i 54 ± 7µm w LSCM [8].
CMTF przy pomocy TSCM uważana jest za obiektywną technikę pomiaru grubości warstw rogówki i umożliwia stworzenie trójwymiarowej rekonstrukcji z dwuwymiarowej strefy obrazów [38].
Pomiar grubości rogówki i jej poszczególnych warstw można uzyskać poprzez pomiar odległości pomiędzy najwyższymi pikami (punktami szczytowymi), które widoczne są w komórkach nabłonka powierzchownego oraz w śródbłonku. Słabsze piki obecne są na poziomie zwoju podnabłonkowego i przedniej stromy. Badania potwierdziły pewną powtarzalność tych pomiarów, jednakże ich dokładność u ludzi jest dość niepewna.
25 W stosunku do pachymetrii ultradźwiękowej wykazano dość małą powtarzalność tych pomiarów (ze współczynnikiem korygującym 0,945) [39].
Petrol i wsp. zaprezentowali 1,67 % różnicy w pomiarze grubości rogówki przy użyciu CMTF i pachymetrii ultradźwiękowej [40], a bardziej współczesne badania podają cieńszą o 39 µm (7%) i 24 µm (4,4%) rogówkę niż w badaniu pachymetrii ultradźwiękowej i Orbscan II [41].
Głównym źródłem błędu jest mimowolny ruch przednio-tylny osoby badanej. Taki błąd może zostać zniesiony poprzez wykonanie wielu skanów w różnych kierunkach [42, 43].
SSCM ma natomiast słabą powtarzalność, jeżeli chodzi o grubość rogówki [44] z powodu zbyt dużej odległości rogówki od pracującego mikroskopu [15]. Według najnowszych wyników badań z-ring encoder poprawia znacząco dokładność pomiaru grubości rogówki przy użyciu SSCM [15].
Sprzęt ten instalowany jest na soczewce obiektywu i kontroluje dystans pomiędzy rogówką a obiektywem.
Płaszczyzna ogniskowania w aparacie RCM jest inna, co jest spowodowane ruchem soczewki obiektywu w stosunku do spłaszczającej nakładki. Płaszczyzna odwzorcowania obiektywu mierzona w µm jest automatycznie wyświetlana na obrazie komputera i nagrywana dla każdego obrazu.
Uważa się, iż pomiar grubości rogówki przy użyciu RCM jest wiarygodny [9], jednakże może na niego wpływać siła spłaszczenia rogówki podczas aplanacji.
II.2.5. Kliniczne wskazania do badania rogówki przy pomocy mikroskopii konfokalnej
Obecnie mikroskopia konfokalna rogówki in vivo stała się dostępną metodą diagnostyki zmian rogówki [7, 45, 46]. Dostarcza dodatkowych informacji wspomagających interpretację obrazu klinicznego [47]. Używana jest między innymi do oceny zmian w zespole suchego oka,
do obserwacji regeneracji tkanek po chirurgii refrakcyjnej, po przeszczepieniu rogówki [48, 49], do oceny aktywacji keratocytów po zabiegu cross-linking, czy obserwacji pęcherzyka filtracyjnego po trabeculektomii [50, 51].
Naukowcy próbują oceniać w mikroskopii konfokalnej m.in. toksyczny efekt wpływu kropli
do oczu: przeciwalergicznych czy analogów prostaglandyn, posiadających lub nie substancje konserwujące [52, 53].
Zeskrobiny rogówkowe pozostają złotym standardem w diagnostyce zapaleń rogówki, ale niektóre mikroorganizmy trudno jest wyhodować in vitro, inne natomiast mają dość powolny wzrost.
Dlatego mikroskopia konfokalna in vivo ma nieocenioną wartość w rozpoznawaniu zakażenia rogówki na tle Acanthamoeby czy grzybiczym (Fusarium) [12]. W niektórych zapaleniach na tle Herpes Simplex pozwala uwidocznić komórki Langerhansa [54].
Po zabiegach chirurgii refrakcyjnej w mikroskopie konfokalnym oceniana jest grubość płatka rogówki, haze, czy regeneracja tkanek [55-57].
Mikroskopia konfokalna in vivo umożliwia ocenę lokalizacji i głębokości zmian w dystrofiach niemal wszystkich warstw rogówki i pozwala na obserwację ich progresji w czasie [58].
Przy użyciu CM badano również zmiany w obrębie nabłonka oraz pod-podstawnego splotu nerwowego, w którym znaczące zmiany zachodzą u pacjentów z cukrzycą [59, 60] i stożkiem rogówki [33].
26
II.3. Dystrofie rogówki II.3.1. Definicja
Dystrofie rogówki to grupa pierwotnych, genetycznie uwarunkowanych chorób niezwiązanych z wcześniejszym zapaleniem, uszkodzeniem, czy chorobą układową [61-63]. Są to dziedziczne choroby rogówki występujące zazwyczaj obustronnie i symetrycznie, cechujące się dość powolną progresją, które nie mają związku z wpływem czynników środowiskowych czy układowych.
Ogólna definicja dystrofii mówi, że jest to zaburzenie genetyczne dotyczące komórki, tkanki czy organu lub struktur tych w połączeniu ze sobą [64].
Inna, bardziej szczegółowa definicja podaje, iż dystrofie są chorobami dziedzicznymi, powstającymi na skutek genetycznego uszkodzenia komórkowego. W tym przypadku ważną rolę odgrywają różne czynniki, np. przebieg dziedziczenia, umiejscowienie mutacji czy wymiana aminokwasów w określonych kodonach. Wynikające z tego zaburzenia mają charakter postępujący – zmieniają z biegiem czasu funkcję i morfologię komórek, co oddziałuje na strukturę tkanki.
Dystrofia rogówki ujawnia się klinicznie w zależności od stopnia genetycznie zmienionego metabolizmu komórki a dolegliwości występują w najróżniejszych formach. Mogą to być zaburzenia widzenia, przymglenia, bóle czy ubytki nabłonka. W szczególnie trudnych przypadkach może występować znaczne osłabienie ostrości wzroku, aż do praktycznej ślepoty włącznie [2].
Rys historyczny
Słowo dystrofia wywodzi się z języka greckiego i oznacza: dys- źle, ciężko, nieprawidłowo
i trophē- odżywianie [65]. Wprowadzone zostało do literatury medycznej w 1884 roku przez Wilhelma Erba (1840-1921) podczas opisywania choroby dotyczącej mięśni [66].
W roku 1890 Arthur Groenouw (1862-1945) opublikował artykuł opisujący dwóch pacjentów z
„guzkami rogówek”. U jednego z pacjentów opisał dystrofię ziarnistą a plamkowatą
u drugiego z nich [67]. W czasach, gdy badanie w lampie szczelinowej nie było powszechnie dostępne, rozwój badań nad rogówką był znacznie ograniczony. Jednak, mimo że Athur Grenouw niedokładnie wykazał różnice pomiędzy dystrofią ziarnistą i plamkowatą oraz nie rozpoznał predyspozycji rodzinnych, te dwie choroby stały się znane jako dystrofie rogówki.
W tym samym czasie Hugo Biber wydał pracę dotyczącą dystrofii siateczkowatej [68].
Natomiast Ernst Fuchs użył słowa dystrofia do opisania choroby okulistycznej i postulował,
iż występowanie tkanki dystroficznej wynika z braku odżywienia, hormonów, krwi czy unerwienia [69]. Wilhelm Uhthoff i później Y. Yoshida kontynuowali używanie tej terminologii w swoich badaniach [70, 71].
Dystrofie rogówki – podział
Pierwszą klasyfikację dystrofii opublikował M. Bücklers, kiedy opisał różnice pomiędzy dystrofią ziarnistą, siateczkowatą a plamkowatą [72]. Od jego nazwiska pochodzi dystrofia Reisa-Bücklersa (RBCD). Dystrofie można podzielić w zależności od sposobu dziedziczenia, częstości występowania, zmian histopatologicznych czy charakterystyki biochemicznej, ale najczęściej używaną klasyfikacją jest podział anatomiczny.
Dystrofie dzieli się w zależności od poziomu zmienionej rogówki na:
1. nabłonkowe i podnabłonkowe 2. warstwy Bowmana
3. istoty właściwej 4. błony Descemeta
27 5. śródbłonkowe [64].
Znany jest również uproszczony podział dystrofii na:
1. przednie
2. istoty właściwej 3. tylne [63].
Niektórzy autorzy do dystrofii, oprócz ww. podziału anatomicznego, zaliczają jeszcze ektazje rogówki - jako dystrofie zniekształcające rogówkę [73, 74]. Najważniejszym schorzeniem z tej grupy jest stożek rogówki (keratoconus).
Podjęto również próbę podziału dystrofii w zależności od patogenetycznie związanego z nią genu na:
1. dystrofie związane z mutacjami w genie TGFBI (Transforming growth factor beta-induced), czyli białka indukowanego przez TGF-β (in BIGH3)
2. dystrofie rogówki o znanym podłożu genetycznym innym niż mutacje w genie TGFBI [61, 75].
Według tego podziału z 2007 roku do dystrofii związanych z mutacjami w genie TGFBI należą:
1. dystrofie przedniej części rogówki: dystrofia błony podstawnej Bowmana typu I i II 2. dystrofie zrębu rogówki, tj. większość dystrofiii siateczkowatych i ziarnistych, w tym dystrofia Avellino [61].
Natomiast do dystrofii niezwiązanych z mutacjami w genie TGFBI należą geny, których produktom trudno jest przypisać wspólną rolę w funkcji i strukturze rogówki.
Dzielą się one na białka strukturalne tkanki:
1. keratyna KRT3, KRT12: dystrofia nabłonkowa Meesmanna 2. gelsolina: dystrofia siateczkowata typ II
3. kolagen (COL8A2): dystrofia Fuchsa i polimorficzna tylna
4. powierzchniowa fosfoglikoproteina: galaretowata dystrofia kropelkowa
5. białka enzymatyczne - sulfotransferaza rogówkowa (CHST6): dystrofia plamkowata t. I, Ia, II
6. kinaza lipidowa PIP5K3: dystrofia plamkowata (Fleck dystrophy)
7. enzym cytochromu P450 CYP4V2: krystaliczna dystrofia rogówkowo-siatkówkowa Biettiego
8. mutacje w genie LCAT (aminotransferaza lecytynowo-cholesterolowa)
9. gen homeotycznyVSX1: dystrofia polimorficzna tylna oraz stożek rogówki [75].
Problem nomenklatury dystrofii i jej podziału przysparzał wiele trudności aż do czasu opublikowania klasyfikacji IC3D w 2008 roku przez Weiss i wsp.
Wraz ze wzrostem wiedzy na temat dystrofii zauważono wiele wyjątków od jej definicji, jak
na przykład: większość pacjentów z dystrofią błony podstawnej nabłonka nie dziedziczy choroby od rodziców, a niektórzy pacjenci z dystrofią polimorficzną tylną manifestują jedynie zmiany jednostronne. Ponadto istnieje wiele obustronnych, dziedzicznych chorób rogówki, jak na przykład rogówka płaska, które nie zostały sklasyfikowane jako dystrofie rogówki.
W literaturze wielokrotnie opisywano dystrofie, które tak naprawdę nimi nie były, np. 50 % dystrofii krystalicznej nie było tak naprawdę dystrofią Shneidera, a jedynie złogami [76].
Rozwój analiz genetycznych zrewolucjonizował wiedzę dotyczącą dystrofii i następnie wykazał dodatkową nieścisłość w nomenklaturze dystrofii ze względu na:
1. różnorodność genetyczną: różne geny KRT 3 i KRT 12 powodują występowanie jednego fenotypu (dystrofii Meesmanna)
2. różnorodność fenotypową: jeden gen (TGFBI) powoduje występowanie różnych allelicznie
