B A R B A R A KO SIN K IEW IC Z
PRÓBA OCENY BIOM ASY M IKROORGANIZM ÓW W G LEBIE
K atedra M ik rob iologii R olniczej A k ad em ii R olniczej w e W rocław iu
Znajom ość rozm iarów m ate rii organicznej zaw artej w ciałach m ik ro - organizm ów i dynam iki jej p rzem ian je st niezm iernie w ażna. Św iadczy ona o n asilen iu biologicznej sorpcji w glebie* i m oże być w skaźnikiem szybkości pow staw ania próchnicy.
Biomasę m ikroorganizm ów w glebie m ożna określić znając liczebność m ikroorganizm ów , ciężar w łaściw y kom órki i jej objętość. W yznaczenie ty ch w ielkości jest obciążone dużym i nieścisłościam i. Zarów no m etoda płytkow a, ja k m etoda bezpośredniego oznaczania ilości m ikroorganizm ów w glebie odbiega od rzeczyw istości ze w zględu n a tru dn ości z oddziele niem kom órek od koloidów glebow ych oraz zróżnicow anie w y m agań po karm ow ych m ikroorganizm ów [1]. O znaczając liczebność m ikroo rg aniz m ów pod m ikroskopem o trz y m u je się w ielokrotnie wyższe w y nik i niż
m etodą płytkow ą [8]. Ś rednią objętość kom órek określa się od 0,4 ixm
do 0,8 м т , n ato m iast ciężar w łaściw y od 1,05 do 1,2 [3, 9]. Różne w iel kości przyjm o w any ch w dośw iadczeniach p a ra m etró w o raz o grom na zm ienność środow iska glebow ego są powodem dużych różnic w w a rto ś ciach biom asy oznaczanych przez ty ch autorów . W ynoszą one od k ilk u
do ponad tysiąca g/m2 [4, 5, 9]. W skaźnikam i biom asy d ro b n oustrojów
w glebie mogą być także niek tó re związki chem iczne c h a ra k te ry sty c z n e dla żyw ych kom órek, jak ATP, kw as d w uam ino-pim elinow y lub m u ra m i- now y [10]. Oznaczenia chem iczne składników kom órek m ikroorganizm ów są p rzy datne w badaniach porów naw czych ze w zględu na duże zróżni cow anie zaw artości ty ch zw iązków w kom órkach. O w ielkości biom asy m ożna także wnioskow ać stosując m eto d y fizjologiczne [13]. W artości biom asy uzyskane z oznaczeń liczebności m ikroorganizm ów m eto d am i fizjologicznym i i enzym atycznym i są na ogół w iększe niż w yniki oznaczeń bezpośrednich [5].
Ze w zględu na duże znaczenie znajom ości biom asy m ikroorganizm ów w glebie każda nowo proponow ana m etoda jej oceny jest w a rta rozw a żenia. Celem niniejszej p racy jest opracow anie now ego sposobu oceny
68 В. Kosinkiewicz
biom asy m ikroorganizm ów w glebie w o parciu o e k stra k cję gleby roz tw orem ch lork u sodowego i n astęp n ie rozdział zaw a rty c h w ek strak cie zw iązków za pom ocą sączenia przez żel Sephadex SE-C-25.
M ETO DY B A D A Ń
Do badań użyto n a stęp u jący ch gleb: m urszow ej, piasku gliniastego, piasku i ogrodow ej, w ytw orzonej z piasku gliniastego na glinie średniej. W n ie k tó ry ch dośw iadczeniach glebę w zbogacano h y d ro lizatem k azeiny lu b gnojow icą. Dla celów porów naw czych analizow ano także glebę s k a żoną pyłam i pohutniczym i wi stopmiu znacznie og raniczającym w zro st m ikroorganizm ów , zwłaszcza bakterii. W ykonano także analizę gleby ogro dowej i piaszczystej po ich uprzedniej ste ry liz ac ji w autoklaw ie.
W dośw iadczeniu m odelow ym ekstraho w ano w ysuszoną do sta łe j w a gi m ieszaninę m ikroorganizm ów : R hodotorula glu tin ia , E. coli9 Sarcina lutea, A rth ro b a cter sp. i Bacillus sp.
E k strak cję gleb lu b kom órek m ikroorganizm ów przeprow adzono sto
su jąc 0,5-procentow y ro ztw ó r ch lo rk u sodowego w ilości 150 cm3 n a
100 g gleby. Użycie do e k stra k c ji c h lo rk u sodowego było podyktow ane jego zdolnością do rozpuszczania kw asów nuklein ow y ch d białek, przy rów noczesnym b ra k u w ym yw ania kw asów h um inow y ch z gleby. Po 0,5- -godzinnym w y trzą sa n iu i zagotow aniu glebę oddzielano na gorąco przez bibułę filtra cy jn ą , w razie p o trzeb y odw irow yw ano, a k laro w n y przesącz odparow yw ano do objętości około 10 cm 3. K la ro w n y e k s tra k t w ilości
2 cm3 wnoszono na kolum nę (30 cm/2 cm) w ypełnioną żelem Sephadex
SE-C25. W ym yw ano ją bufo rem fosforanow ym o pH 6, zbierając fra k c je
objętości 3 cm3 co 3 m in u ty . W yznaczano absorpcję św iatła każdej fra k c ji
przy długości fali 254 nm . Zastosow anie silnie kw aśnego kationiitu, jak im je s t Sephadex SE-C-25, było uzasadnione brak iem absorpcji kom órek drożdży i b a k te rii na ty m żelu, co stw ierdzono już poprzednio [12]. L i czebność m ikroorganizm ów w b ad any ch glebach oznaczono m etodą p ły t kow ą na pożywce z w yciągu glebowego. Biom asę m ikroorganizm ów w badan y ch glebach obliczono w edług w zoru: biom asa = liczebność X śred nia objętość kom órki X śred n i ciężar właściw y, p rzy jm u ją c objętość ko m órki 0,35 м-m3, a ciężar w łaściw y 1,2. A nalizę chem iczną sk ład u e k s tra k tów z gleb w ykonano sto su jąc n a stę p u jąc e oznaczenia: białko — m etodą L ow ry, c u k ry — m etodą antronow ą, kw asy n ukleinow e — ko lo ry m etry cz
nie dwufenyloam iiną [11].
W Y N IK I B A D A Ń I W N IO SK I
Zw iązki zaw arte w ekstrak cie z g leb y rozdzielały się na żelu na dw ie frakcje: o dużej m asie cząsteczkow ej (frakcie od 1 do 15) i o m n ie j szej m asie (frakcje od 15 do 30). Ilość zw iązków wysokocząsiteczko-
R ye. 1. R ozd ział e k stra k tó w ch lo rk iem sod u z g leb y 1 — mursz, 2 — humus 2 piasku, 3 — piasek gliniasty, 4 — piasek
S ep a ra tio n of so il ex tr a c ts w ith sod iu m ch lo rid e fro m J — mursh, 2 — humus horizont from sand, 3 — loamy sand, 4 — sand
w iększa dla gleb bogatszych w m ikroorganizm y. Stw ierdzono, że po-:
w ierzchnie pierw szych pików pozostają w d o datniej k o relacji z liczeb nością m ikroorganizm ów o raz z ich biom asą (tab. 1 i 2). Podobne zależ ności stw ierdzono an alizu jąc w te n sam sposób gleby różnie użytkow ane, w jesieni i n a w iosnę (ryc. 2). W p rzy p a d k u gleb tra k to w a n y ch
gnojo-T a b e l a 1 Z a l e i n o d ć m i ę d z y l i c z e b n o ś c i ą b a k t e r ii w g le b ie p i a ^ o z y e t e j , ich b io m a s ą i p o w i e r z c h n i a m i wyznaczonymi p r z s s n&^vi'jzbze p i k i R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e num be r o f b a c t e r i a i n pandy e r i l , t h e i r b i o n a s e a n d t h e a r e a s d e t e r m i n e d by t h 9 h i g h s c c р е а ^ з O b i e k t - T r e a t m e n t L i c z e b n o ś ć n> I n / g Ku nbe r m i l l . / g Biomasa Li ;r:nsa f - E / s P o w i e r z c h n i a p i k u Pefci: a r e a cm2 G l e b a p i a s z c z y c t a p o b r a n a w i o s n ą San d y s o i l t a k e n i n s p r i n g 0 , 1 4 3 C,C CO 1 3 , 0 G l e b a p i a s z c z y s t a p o b r a n a j e 6 i e n i ą S on dy s o i l t a k e n i n a u t u n n 1, ;20 0 , 4 7 0 1 7 , 5 - po i n k u b a c j i - 1 d z i e ń a f t e r i n c u b a t i o n - 1 d ay 2 ,0 0 0 0 , 8 4 0 1 9 , 5 7 d n i - 7 d ay a 1,820 0 ,7 6 0 1 4 , 5 14 d r. i - 14 da y o 1 , 6 8 0 o / n o 1 2 ,0 21 d n i - 21 d a y s 1 , 6 4 0 0,690 11,6 - w zb o g ao o n a h y d r o l i z a t e m k a z e i n y 1 JLnkubowana: e n r i c h o d w i t h ca ca i. n h y d r o l y s e ï e and i n c u b a t e d : ) 1 d z i e ń - 1 d ay 1 , 5 4 0 0 , 6 5 0 15,7' 7 d n i - 7 d a y s 3,2 5 0 1 , 3 7 0 1 0 , 1 14 d n i - 14 d a y a 4 , 4 9 0 1,o 90 14 ,6 21 d n i - 21 d a y a 5 , 1 2 0 2 , 1 5 0 1 9 , 8
Vsp<3łobjnnlk k o r e la c ji a ię d z y biomasą i powierzchniam i piJc<5w => 0 ,9 8 Сo r r e a c t i o n c o e f f i c i e n t b e t w e e n t h e b i o n a e s an d t h e p e a k a r e s o « 0 , 9 3
70 В. Kosinkiewicz T a b e l a 2 Z a l e ż n o ś ć m i ę d z y l i c z e b n o ś c i ą b a k t e r i i w g l e b i e o g r o d o w e j , i c h b io m as ą i p o w i e r z c h n i a m i w yzn acz on ym i p r z e z n a j w y ż s z e p i k i R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e number o f b a c t e r i a i n g a r d e n s o i l , t h e i r b io m aae and п г е а з d e t e r m i n e d by .the h i g h e s t p e a k s O b i e k t - T r e a t m e n t L i c z e b n o ś ć m l n / g Nuabe r m i l l . / g Biomasa Biom ass Ji g / g Powie r z c h n i a p i k u Peak a r e a c « 2 G le b a og ro do w a p o b r a n a w i o s n ą G ar de n s o i l ta k e n i n s p r i n g 0 , 1 7 0 0 , 0 7 1 1 4 , 0 G le b a og ro d ow a p o b r a n a j e 3 i e n i ą Ga rd en s o i l t a k e n i n aut umn 5, 560 2 , 3 4 0 3 1 , 5 - po i n k u b a c j i - 1 d z i e ń a f t e r i n c u b a t i o n - 1 d a y 9 , 8 8 0 4 , 1 5 0 3 2 , 4 7 d n i - 7 d a y s 4 , 1 2 0 1 , 7 3 0 2 1 , 2 14 d n i - 14 d a y s 13,800 1 , 5 9 0 1 3 ,5 21 d n i - 21 d a y e 3 , 0 8 0 1 , 2 9 0 1 2 , 7 - w z b o ga co na h y d r o l i z a t e m k a z e i n y i i n k u b o w a n a : e n r i c h e d w i t h c a s e i n h y d r o l y s a t e an d i n c u b a t e d : 1 d z i e ń - 1 d ay 1 0 ,6 4 0 4 , 4 7 0 4 8 , 3 7 d n i - 7 d a y s 1 2 , 6 7 0 5 , 3 2 0 6 2 , 4 14 d n i - 14 d a y s 1 8 , 6 6 0 7 , 8 4 0 8 5 , 6 21 d n i - 21 d a y s 2 1 , 3 5 0 8 , 9 7 0 9 6 , 0 W s p ó ł c z y n n i k k o r e l a c j i m i ęd zy bi o m a s ą i p o w i e r z c h n i a m i pików ■ 0 , 9 9 C o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t b e t w e e n t h e b i o m a s s and t h e p e a k areaa * 0 . 9 9
Numer kolejny frakcji-Subsequent A'o. of the fraction
R yc. 2. R ozdział ek stra k tó w ch lo rk iem sod u z gleb p o b ran ych w io sn ą 1 — ogrodowa, 1 — piasek, oraz w jesieni: 3 — ogrodowa, 4 — piasek S ep a ra tio n of e x tr a c ts w ith sod iu m ch lo rid e from so ils ta k e n in sp rin g
wicą otrzym ano podobne zależności, p rzy czym w prow adzenie ta k boga tego energetycznie m a te ria łu spow odow ało wzm ożenie dynam ik i rozw oju m ikroorganizm ów o raz w zrost w artości absorbancji fra k c ji u w aln ian y ch w żelu, a zatem i stężenia zw iązków wysoko cząsteczkow ych w e k stra k cie glebow ym (ryc. 3). A naliza gleb zanieczyszczonych pyłam i p o h u tn i- czymi w y kazała obecność dużej ilości grzybów p rz y rów noczesnym b ra k u bakteria. O trzym ane w ysokie w artości ek sty n k cji poszczególnych fra k c ji
Numer kolejny frakcji— Subsequent No. of the fraction
R yc. 3. R ozd ział ek stra k tó w ch lo rk iem sodu z g leb y tra k to w a n ej g n o jo w icą 1 — gleba ciężka bez gnojowicy, kontrolna, 2 — z gnojowicą w ilości 40 mtyha, 3 — gleba
kontrolna lekka bez gnojowicy, 4 — z gnojowicą w ilości 40 m*/ha
S ep a ra tio n of ex tr a c ts w ith sod iu m ch lo rid e iron so ils trea ted w ith liq u id m an u re I — heavy soil without liquid manure, control, 2 — with liquid manure, 40 m*/ha, 3 — light
soil without liquid manure, control, 4 — with liquid manure, 40 m’/ha
(ryc. 4) dowodzą, że zw iązki za w a rte w ek strakcie z ty ch gleb pochodzą praw dopodobnie praw ie w yłącznie z kom órek grzybów lu b też z m a r tw y c h k om órek b ak terii, nie ujaw n ion y ch przez w ysiew na p łytk i. J a k w ykazała analiza chem iczna e k stra k tó w glebow ych, w e fra k c ja c h w ysoko cząsteczkow ych znajdow ały się kw asy nukleinow e, p ro te in y i cukry.
W yniki b adań m a te ria łu kom órkow ego drożdży glebow ych i k ilk u szczepów b a k te rii w ykazały podobne zależności ja k w p rzy p a d k u e k stra k tów z gleb (ryc. 5), co m ogłoby sugerow ać, że w y e k strah o w an e z gleb} zw iązki pochodzą z kom órek m ikroorganizm ów , ty m b ardziej że badane e k s tra k ty nie zaw ierały żadnych zw iązków próchnicznych, poniew aż po
zostaw ały k laro w n e po zakw aszeniu kw asem solnym do pH 2.
A naliza gleb stery lizo w an y ch w au to k law ie przez 0,5 godziny przy
72 B. Kasmkiewicz
Numer kdejny frakcji- Subséquent No. of the fraction
R ye. 4. R ozdział e k str a k tó w ch lork iem sodu z g leb y sk ażon ej p y ła m i p oh u tn iczy m i 1 — odległość od huty 600 m, 2 — odległość od huty 200 m
S ep aration s of ex tra cts w ith sodium ch lo rid e fro m so il p o llu ted w ith in d u stria l dusts
1 — distance from the metalurgie works 600 m, 2 — distance from the metalurgie works 200 m
10 20 30
Numer kolejny f r a k c ji- Subsequent Ho. o f the fraction
R ye. 5. R ozdział e k stra k tó w ch lo rk iem sod u z su ch ej m iesza n in y k om órek b a k terii i drożdży g leb o w y ch (426 m g) 1 — ekstrakt z komórek z dodatkiem hy drolizatu kazeiny, 2 — ekstrakt z komórek S ep a ra tio n of ex tr a c ts w ith sod iu m ch lo rid e from dry m a tter of b a cteria
c e lls and so il y ea sts (426 m g) 1 — extract from bacteria cells with added casein hydrolysate, 2 — extract from
bacteria cells
n a tu ra ln a gleby, do e k stra k tu przechodziło znacznie w ięcej zw iązków w ysoko cząsteczkow ych, będących m ia rą biom asy kom órek m ik ro o rg a nizm ów, co jest zrozum iałe ze w zględu n a zm niejszenie się w ty ch w a ru n k ac h so rpcji cząsteczek koloidu glebowego.
Jak k o lw iek należy zdaw ać sobie spraw ę z błędów w y n ik ający ch z róż nej efektyw ności e k stra k cji gleb za pomocą chlo rku sodu, w y daje sdę, że proponow ana m etoda może znaleźć zastosow anie w badaniach porów naw czych. O pisaną m etodę stosow ano z pow odzeniem w naszym labo ra to riu m w w ielu dośw iadczeniach na ró żny m m ate ria le badaw czym , ja k np. na glebach tra k to w a n y c h w ysokim i daw kam i pestycydów . W ty m p rzy p ad k u stw ierdzano znaczne zaham ow anie w zrostu m ikroorganizm ów i zm niejszenie się biom asy, p rzy czym n a w y k resach zależności m iędzy w artościam i ek sty n k cji i n u m erem k o lejn ym fra k c ji uw idoczniała się
czynniki k o relacji m iędzy liczebnością m ikroorganizm ów a p ow ierzchnia m i pierw szych pików , odpow iadającym i w artościom biom asy, pozw alają sugerow ać, że przedstaw iona m etoda m oże być stosow ana do p orów naw czych szacunkow ych oznaczeń biom asy m ikroorganizm ów w glebie.
L IT E R A T U R A
[1] B a b i u k L. A., P a u l E. A.: T he u se o f flu o r e sc e in e is o -th io c y a n a te in th e d eterm in ation of th e b a cteria l b iom ass of grasslan d soil. Can. J. of. Microbiol.. 16, 1970, 57.
[2] B a l i c k a N.: T he part of m icroorgan ism s in th e co m p lex action of p esticid es in sugar b e e t cu ltu re. S p raw ozd an ie z prac b a d a w czy ch w ram ach U m o w y P r o je c t N o. P.L.A .R .S.-5 G rant F.G.Po.335, 1974— 1075.
[3] C h u d i a k o w J. P.: W oprosy cz isle n n o sti b io m a sy i p r o d u k tiw n o sti p o - c zw ien n y ch m ik roorgan izm ow . Izdat. N au k a 20, 1972, 21.
[4] C l a r k F., P a u l K.: T he m icroflors of grasslan d soil. A d van ces A gric. 22, 1970, 30.
[5] C l a r k h o l m M. , R o s s w a l l T.: B iom ass an d tu rn o v er o f b acteria in a fo r e st soil and apeat. S o il B iol. B iochem . 12, 1980, 1, 49—57.
[6] D o m s с h K. H., B e c k T. H., A n d e r s o n J. P., S о d e r s t г о m В., P a r - k i n s o n D., T r o l l d e n i e r G. A.: A com parison of m eth od s for soil m i crob ial p o p u la tio n and b iom ass stu d ies. Z. P fla n zen ern . B odenkd. 142, 1979, 3, 520—528.
[7] K a c z m a r e k W.: B iom asa i p rod u k tyw n ość d rob n ou strojów w g leb ie. Rocz. A R Pozn., pr. habilit. 1978.
[8] K a c z m a r e k W. , K a s z u b i a k H., G u z e k K.: The com parison of ch an ges in th e num ber of m icroorgan ism s in th e soil b y p la te and m icroscop ic m eth od s. J. J. of S oil Sei. 6, 1973, 2, 133, 135.
[9] K a c z m a r e k W. , K a s z u b i a k H'., P ę d z i w i ł к Z.: B adania n ad z a w a r to ścią A T P w gleb ie. S em in ariu m m ik rob iologiczn e pt.: „P rocesy m ik ro b io lo g iczn e w g le b ie ”, U stroń —P ozn ań 1975, 26.
[10] K a s z u b i a k H., K a c z m a r e k W. , D u r s k a G.: B ad an ia n a d rozk ład em i sy n tezą k om órek d rob n ou strojów g leb o w y ch . S em in ariu m m ik ro b io lo g iczn e pt. „P rocesy m ik rob iologiczn e w g le b ie ”, U stro ń —P ozn ań 1975, 83.
[11] K ł y s z e j k o - S t e f a n o w i c z A.: Ć w iczen ia z bioch em ii. 1980.
[12] K o s i n k i e w i c z B., V a r a n k a W.: B eh aviou r o f m icrob ial cells on collum n of som e ty p e of S ep h a d ex gels. J. C hrom . 114, 1975, 463— 464.
[13] L y n c h J. M. , P a i n t i n g L.: C u ltiv a tio n and soil biom as. S oil Biol. B iochem . 1, 1980, 29. Б. КОСИНКЕВИЧ П О П Ы Т К А О Ц Е Н К И БИ О М А С С Ы М И К РО О РГА Н И ЗМ О В В П О ЧВЕ Кафедра сельскохозяйственной микробиологии, Сельскохозяйственной академии во Вроцлаве Р е з ю м е В статье рассматривается новый м етод определения биомассы микроорганизмов в почве путем фракционированных экстрактов 0,5% хлоридом натрия на геле Сефадекс SE-C25. Исследования охватывали следующие виды почвы: мурш, сугилинок, гумусный слой песка,
74 В. K osinkiew icz песок и оглородную почву. В некоторых опытах использовали почву обогащенную гидро лизатом казеина или жидким навозом. С целью сравнения анализировали также почву за грязненную промышленными пылями. Установлено, что соединения содержащиеся в соляном экстракте почвы, разделяются на две главные фракции. Содержание фракций высокомолекулярных соединений коррели ровало с количеством микроорганизмов определяемых стандартным пластиночным методом. Химический анализ высокомолекулярных фракций показал наличие нуклеиновых кислот- белка и сахаров. Результаты фракционирования соляного экстракта сухой массы клеток микроорганизмов были очень сходными с результатами полученными в анализе почвы. В связи с этим можно предполагать, что соединения содержащиеся в высокомолеку лярной фракции происходят из клеток микроорганизмов. Указанный метод пригоден для оценки биомассы микроорганизмов в почве, особенно в сравнительных исследованиях. в. K O S IN K IE W IC Z
A N A TTEM PT OF E STIM A TIO N OF THE SO IL M IC RO BIAL B IO M A SS D ep artm en t of A g ricu ltu ra l M icrobiology, A g ricu ltu ra l U n iv e r sity of W rocław
S u m m a r y
A n ew m eth od of e stim a tio n o f th e soil m icro b ia l b iom ass u sin g 0.5°/o N aC l soil ex tr a c t on the S ep h a d ex SE-C -25 g e l is p resen ted in th e pap er. M ursh soil, cla y -sa n d , hum us horizon of sand, san d and gard en so il w e r e used. In som e e x p erim ents soil en riched w ith ca sein or liq u id m an u re w a s ap p lied . T o com p are th e resu lts, the soil p o llu ted w ith in d u stria l dusts w a s tested as w ell.
It has been found that th e com p ou n d s co n ta in ed in th e sa lin e so il ex tr a c t are sep arated into tw o fra ctio n s. T he h ig h -m o lecu la r fra ctio n c o n ten t co rrela ted w ith th e num ber of m icroorgan ism s d eterm in ed b y th e standard p la te m ethod.
T he ch em ical a n a ly sis of h ig h -m o lecu la r fra ctio n sh o w ed the p resen ce of n u cleic acid s, protein and sugars. The resu lt of fra ctio n a tio n of th e sa lin e e x tr a c t of dry m icro b ia l ce lls w a s v e r y sim ila r to that of soil.
It can be con clu d ed th at th e com pounds con tain ed in th e h ig h -m o lecu la r fr a c tio n origin ated from m icrob ial cells.
T he m eth od p resen ted can be used for e stim a tio n o f th e m icro b ia l b io m a ss in soil, p a rticu la rly in co m p a ra tiv e tests.
D o c . d r h a b . B a r b a r a K o s i n k i e w i c z W p ł y n ę ł o d o r e d a k c j i w p a ź d z i e r n i k u 1984 K a t e d r a M i k r o b io l o g ii R o ln ic z e j A R
