Załącznik nr 3
Autoreferat
Dr n. med. Wojciech Smółka
Katedra i Klinika Laryngologii
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Katowice 2020
2
Spis treści
1. Imię i nazwisko ... 3
2. Dyplomy i stopnie naukowe ... 3
3. Zatrudnienie ... 3
4. Wskazanie głównego osiągnięcia naukowego ... 4
4.1. Tytuł głównego osiągnięcia naukowego/artystycznego ... 4
4.2. Spis publikacji wchodzących w skład osiągnięcia naukowego ... 4
4.3. Omówienie głównych wyników badań publikacji włączonych do osiągniecia naukowego ... 5
4.3.1. Wstęp do zagadnienia badawczego podjętego w cyklu trzech publikacji... 5
4.3.2. Opis publikacji i osiągniętych wyników ... 7
4.3.3. Podsumowanie i wnioski ... 31
5. Pozostałe osiągnięcia naukowe ... 33
5.1. Omówienie pozostałych opublikowanych prac naukowych ... 33
5.2. Wykaz pozostałych publikacji naukowych ... 42
5.3. Praca w ramach Studenckiego Koła Naukowego przy Katedrze Ginekologii ... 46
5.4. Kursy i szkolenia zagraniczne oraz krajowe ... 46
5.5. Udział w konferencjach, kongresach i sympozjach naukowych ... 47
5.6. Organizacja zjazdów, konferencji i szkoleń ... 49
5.7. Członkostwo w towarzystwach naukowych ... 50
6. Podsumowanie dorobku naukowego ... 50
3 1. Imię i nazwisko
Wojciech Smółka
2. Dyplomy i stopnie naukowe
• 1989-1995 - Studia na Wydziale Lekarskim Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
• 1998 - Specjalizacja I stopnia z otolaryngologii – egzamin zdany z wyróżnieniem
• 2003 - Specjalizacja II stopnia z otorynolaryngologii
• 2008 - Uzyskanie tytułu dr n. med. Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach na podstawie pracy: „Odległe wyniki leczenia otosklerozy metodą stapedotomii małookienkowej”
3. Zatrudnienie
SPSKM Katowice, Oddział Laryngologii Ś.U.M.
• 1997-1998 - młodszy asystent
• 1999-2003 - asystent
• 2003- do nadal - starszy asystent
4 4. Wskazanie głównego osiągnięcia naukowego
4.1.Tytuł głównego osiągnięcia naukowego
Osiągnięcie naukowe przedstawione jako jednotematyczny cykl trzech prac, opublikowanych po uzyskaniu stopnia doktora nauk medycznych pod wspólnym tytułem: Badania nad otrzymywaniem nowych biomateriałów dla potrzeb laryngologii: włókniste materiały kompozytowe na implanty głosowe i słuchowe oraz nanomateriały jako podłoża dla inżynierii tkankowej
4.2. Spis publikacji wchodzących w skład osiągnięcia naukowego
1. Wojciech Smolka, Michal Dworak, Bartlomiej Noworyta, Maciej Gubernat, Jaroslaw Markowski, Marta Blazewicz, Mechanical and biological assessement of carbon fiber- reinforced PEEK composite materials intended for laryngeal prostheses, Engineering of Biomaterials / Inżynieria Biomateriałów, 2019: T.22, No.151, s.2-8
[MNiSW=20]
2. Wojciech Smolka, Agnieszka Panek, Maciej Gubernat, Aneta Szczypta-Fraczek, Piotr Jelen, Czeslawa Paluszkiewicz, Jaroslaw Markowski, Marta Blazewicz, Structure and biological properties of surface-engineered carbon nanofibers, J.Nanomater, 2019 : Vol.2019, ID 4146190, p.1-14
[IF=2.223; MNiSW= 70]
3. Wojciech Smolka, Elzbieta Dlugon, Piotr Jelen, Wiktor Niemiec, Agnieszka Panek, Czeslawa Paluszkiewicz, Barbara Zagrajczuk, Elzbieta Menaszek, Jaroslaw Markowski,Marta Blazewicz, Carbon Nanofibers Coated with Silicon/Calcium- Based Compounds for Medical Application, J.Nanomater, 2019 : Vol.2019, ID 8796583, p.1-11
[IF-2.223, MNiSW= 70]
[Łączny IF=4.446: MNiSW= 160]
5 4.3. Omówienie głównych wyników badań publikacji włączonych do osiągniecia
naukowego
4.3.1. Wprowadzenie do zagadnienia badawczego podjętego w cyklu trzech publikacji
Tematyka podjęta w trzech współautorskich pracach dotyczy zasadniczo badań nad opracowaniem nowych materiałów pod kątem możliwych zastosowań w laryngologii. Badania, wynikiem których powstały trzy publikacje są następstwem wieloletniej współpracy interdyscyplinarnych zespołów badawczych z Katedry Biomateriałów i Kompozytów, Wydziału Inżynierii Materiałowej i Ceramiki, Akademii Górniczo-Hutniczej, Katedry i Kliniki Laryngologii Śląskiego Uniwersytetu Medycznego oraz zespołu biologów z Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie i Instytutu Fizyki Jądrowej PAN w Krakowie.
Wyniki badań prezentowane w tych pracach dotyczą zagadnień materiałowych i biologicznych w zakresie możliwości opracowania nowej generacji materiałów wykorzystujących dotychczasową wiedzę, wyniesioną z takich dziedzin techniki i medycyny jak: inżynieria materiałów, nanomateriały, inżynieria tkankowa i nanomedycyna. Badania zostały ukierunkowane na opracowanie kilku rodzajów nowej generacji materiałów, których zarówno potencjalne przeznaczenie w laryngologii zastało w każdej pracy nakreślone, jak i wymagania materiałowe, biologiczne i kliniczne sprecyzowane, a prowadzone eksperymenty zostały zaplanowane pod kątem przyszłego ich wykorzystania w praktyce.
Rozwój nanotechnologii i nanomateriałów zapowiada w najbliższej przyszłości zasadnicze zmiany w metodach leczenia i diagnostyki medycznej.
Nanomedycyna otwiera nowe możliwości w leczeniu chorób nowotworowych, choroby Alzheimera, choroby Parkinsona, w leczeniu chorób narządów i tkanek, w ich procesach regeneracyjnych i rekonstrukcyjnych. Badania w tej dziedzinie zmierzają do wprowadzania nowych technik diagnostyki oraz rozbudowanej prewencji chorób cywilizacyjnych i bezinwazyjnych metod terapii. Nanomedycyna jako dziedzina wiedzy jest związana z inżynierią tkanek i inżynierią nowych biomateriałów opartych na nanomateriałach. Według aktualnego stanu wiedzy nanomateriały należą do tej grupy materiałów, które mogą znaleźć zastosowanie
6 m.in. w medycynie regeneracyjnej, wykorzystującej różne metody leczenia. Celem medycyny regeneracyjnej jest leczenie poprzez zastępowanie lub regenerację komórek zmienionych chorobowo (terapia komórkami macierzystymi, inżynieria tkankowa), lub regeneracja organizmu za pomocą terapii genowej. Medycyna regeneracyjna jest interdyscyplinarną dziedziną wiedzy stwarzającą pacjentom nadzieję na opracowanie nowych, innowacyjnych metod leczenia chorób, dotąd uznawanych za nieuleczalne metodami konwencjonalnym. Metody te mają na celu zwalczenie nie tylko symptomów chorób, ale również ich przyczyn, najczęściej mających podłoże genetyczne.
Szczególnie interesującą grupą materiałów dla tej dziedziny medycyny, wytwarzanych według nowych reguł i zasad technologicznych, opracowanych dla materiałów o wymiarze nanometrycznym, są formy włókien o wymiarze nanometrycznym. Materiały wytworzone z takich form włókien, naśladujące macierz pozakomórkową, przypominającą włókna kolagenowe naturalnej macierzy, są szczególnym obiektem zainteresowania takich materiałów jako podłoży do procesów regeneracyjnych tkanek. Prowadzone są badania dotyczące opracowania nowych rusztowań z nanowłókien dla procesów regeneracyjnych tkanki kostnej, chrzęstnej i nerwowej. Nanowłókna, pozwalające formować specyficzną architekturę przestrzenną znajdują dzisiaj coraz szersze zastosowanie w wielu nowych dziedzinach medycznych. Oprócz medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej, ich przydatność została już potwierdzona w takich zastosowaniach, jak kierowana regeneracja tkanek (ang. guided tissue regeneration, GTR), nośniki leków (ang. drug delivery systems, DDS), membrany, materiały opatrunkowe, a także w zaawansowanych systemach filtrujących i czyszczących (aktywne membrany).
Przedmiotem badań podjętych w niżej opisanych publikacjach są trzy formy materiałów, których wspólnym mianownikiem jest włóknisty węgiel, dla trzech kierunków badawczych związanych z laryngologią: materiały na implanty głosowe, materiały elektrodowe dla elektrostymulacji i materiały na podłoża dla inżynierii tkanek kostnych lub kostno-chrzęstnych. W pierwszej pracy opisano doświadczenia dotyczące opracowania nowych, niemetalicznych materiałów kompozytowych złożonych z mikrowłókien węglowych (włókna o średnicach rzędu od kilku do kilkunastu mikrometrów) i biozgodnego polimeru typu polieteroeteroketonu, jako potencjalnego tworzywa na implanty głosowe. Proponowana kompozycja
7 materiałowa została dodatkowo modyfikowana nanorurkami węglowymi, a celem tej modyfikacji był oczekiwany efekt poprawy właściwości mechanicznych, a także biologicznych. Ten ostatni zakładał, dzięki obecności składnika węglowego, uzyskanie powierzchniowych właściwości bakteriostatycznych. W dwóch pozostałych opracowano i zbadano wybrane właściwości biologiczne i fizyczne mat węglowych, złożonych z nanowłókien węglowych (włókna, których średnice mają wymiary nanometryczne, tj. poniżej 1000 nm), jako potencjalnych materiałów na elektrody dla implantów słuchowych, mogące mieć potencjalne zastosowanie w procesach elektrostymulacji oraz poprzez odpowiednią modyfikację jako bioaktywne podłoża komórkowe. Wszystkie trzy prace były realizowane w interdyscyplinarnych zespołach badawczych.
4.3.2. Opis publikacji i osiągniętych wyników
Wojciech Smolka, Michal Dworak, Bartlomiej Noworyta, Maciej Gubernat, Jaroslaw Markowski, Marta Blazewicz, Mechanical and biological assessement of carbon fiber- reinforced PEEK composite materials intended for laryngeal prostheses
Mój wkład w powstanie pracy polegał na uczestnictwie w opracowaniu planu pracy, opracowaniu opisu stanu wiedzy do części literaturowej nt. protez głosowych, zaplanowaniu badań materiałowych pod kątem możliwości wytworzenia protez głosowych, interpretacji wyników badań in vitro i uczestnictwie w redakcji manuskryptu.
Krtań jest kluczowym elementem górnych dróg oddechowych zapewniającym swobodny przepływ powietrza w kierunku tchawicy i oskrzeli.
Spełnia również istotną funkcję w tworzeniu głosu i mowy. U człowieka wydolna, rozumiana przez otoczenie mowa jest podstawowym czynnikiem prawidłowego społecznego funkcjonowania. Rak krtani jest najczęściej występującym rakiem płaskonabłonkowym w obrębie głowy i szyi (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma - HNSCC). Stanowi on siódmy najczęściej występujący nowotwór złośliwy w populacji męskiej w Polsce, a według danych Krajowego Rejestru Nowotworów w 2010 r. stwierdzono 2200 nowych przypadków tego nowotworu, a
8 przeszło 1500 osób zmarło w jego następstwie. W leczeniu chorych o dużym zawansowaniu klinicznym raka krtani- pomimo rozwoju metod radioterapii- nadal wykorzystuje się laryngektomię całkowitą. Jest to zabieg okaleczający, w następstwie którego dochodzi do całkowitego usunięcia krtani. Pozbawienie chorego krtani wiąże się m.in. ze zmianą sposobu oddychania- po zabiegu drogi oddechowe zaczynają się na poziomie tchawicy, a powietrze wdychane nie zostaje oczyszczone. Chory laryngektomowany pozbawiony zostaje podstawowego narządu zaangażowanego w wytwarzanie głosu. Od wielu lat w rehabilitacji mowy chorych laryngektomowanych wykorzystywane są protezy głosowe. Implantacja protezy polega na wytworzeniu przetoki komunikującej tchawicę z przełykiem co umożliwia rozwój mowy tchawiczoprzełykowej. W obrębie uzyskanej przetoki umieszcza się protezę głosową, która funkcjonuje jako jednostronny układ zastawkowy, powodując przepływ powietrza wyłącznie od strony tchawicy do przełyku. Zapobiega tym samym zwrotnemu wnikaniu treści pokarmowej z przełyku do tchawicy. Drgania śluzówki przełyku wywołane prądem powietrza są następnie przekazywane do gardła i jamy ustnej, gdzie przekształcane zostają w zrozumiałą dla otoczenia mowę [2, 3, 4]. W Polsce najczęściej stosowane są silikonowe protezy Provox (Atos Medical AB, Hörby, Szwecja) i Blom-Singer (InHealth Technologies, Carpinteria, CA, USA).
Stosowanie protez głosowych w specyficznym środowisku śluzówek tchawicy i przełyku wiąże się z ich ograniczoną „żywotnością”. Oznacza to że wszczepione protezy wymagają okresowej wymiany z powodu obniżenia swej jakości i ograniczenia w funkcjonowaniu. Według danych literaturowych średni czas przydatności do użytku wszczepionej protezy wynosi 3-6 miesięcy. Po tym czasie protezę należy wymienić. Ograniczenia funkcjonowania protezy w miarę jej użytkowania są spowodowane czynnikami związanymi z właściwościami samej protezy, m.in. dysfunkcją mechaniczną układu zastawkowego w następstwie powstawania biofilmu oraz czynnikami zależnymi od „dobrostanu” przetoki, związanymi z właściwościami tkanek otaczających przetokę, tj. nadkażeniem miejsca wszczepienia, wytwarzaniem ziarniny wokół protezy i powiększaniem się przetoki wiodące do wydalenia jej do przełyku lub tchawicy.
Do podstawowych cech decydujących o żywotności protezy należy jakość silikonu użytego do jej produkcji oraz wydolność i siła układu zastawkowego. Jedną z najważniejszych przyczyn prowadzących do upośledzenia funkcjonowania
9 protezy głosowej jest tworzenie blaszki tzw. biofilmu, która wrasta w materiał protezy i obniża jej właściwości kinetyczne. Biofilm to wyspecjalizowana kolonia bakterii i/lub grzybów produkujących pozakomórkową macierz. Ograniczenie wydolności układu zastawkowego protezy głosowej pokrytej biofilmem powoduje ryzyko aspiracji treści pokarmowej do tchawicy oraz zmniejszony przepływ powietrza przez zastawkę. Zapobieganie tworzenia się biofilmu na powierzchni protezy jest jednym z kierunków badań nad poprawą trwałości protez głosowych.
Przykładem jest zastosowanie silikonu wzbogaconego 7% dodatkiem tlenku srebra, który znany jest z hamujących właściwości mikrobiologicznych. Protezą wykorzystującą bakteriostatyczne właściwości tlenku srebra jest Blom-Singer®
Dual Valve ™ [8].
Uszkodzenie błony śluzowej tchawicy podczas stosowania protez głosowych może prowadzić do ziarninowania wokół przetoki tchawiczo- przełykowej. Dlatego odpowiedni projekt protezy, który minimalizuje ryzyko uszkodzenia błony śluzowej, może wydłużyć jej żywotność. Taką modyfikację zastosowano w protezach Provox® Vega ™, które są wykonane z polimerów PTFE [9].
W świetle literatury dotyczącej implantów głosowych, jak do tej pory zostało przebadanych stosunkowo niewiele materiałów. Z tego względu autorzy niniejszej publikacji podjęli badania nad opracowaniem nowego materiału w formie kompozytu, złożonego z osnowy polimerowej PEEK i włókien węglowych, jako potencjalnego tworzywa syntetycznego na protezy głosowe. Inspiracją do wyboru materiału kompozytowego były dotychczasowe doświadczenia zespołu badawczego Katedry Biomateriałów i Kompozytów (WIMiC, AGH Kraków) oraz Katedry i Kliniki Laryngologii Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach nad opracowaniem nowych materiałów dla laryngologii [1, 2]. Nie bez znaczenia był także wybór składników kompozytu, jako materiału na protezę głosową. Z jednej strony doniesienia literaturowe wskazują, że matryca polimerowa PEEK charakteryzuje się właściwościami hamującymi rozwój biofilmu w miejscu implantacji [3, 4] z drugiej zaś dotychczasowe, wcześniejsze badania własne autorów tej publikacji wykazały, że komponent węglowy może pełnić funkcję materiału bakteriostatycznego, tzn. takiego, w środowisku którego bakterie nie rozwijają się. Kompozyty wytwarzane przy użyciu różnych form włókien węglowych i matrycy PEEK oferują szerokie możliwości projektowania
10 architektury przestrzennej oraz właściwości biologicznych, fizycznych i mechanicznych, prowadzących do uzyskania optymalnie dopasowanych implantów do pracy w środowisku tkanek. Kompozyty takie można wytwarzać z wysokim stopniem anizotropii, jako lekkie materiały, o właściwościach fizycznych zbliżonych do właściwości zastąpionej tkanki. Wszystkie te formy węgla w postaci włókna węglowego wydają się korzystne w opracowywaniu materiałów kompozytowych do różnych zastosowań medycznych [5–8]. Istotnym czynnikiem determinującym ich potencjalne zastosowanie jako protez głosowych było określenie ich trwałości (starzenia się) w warunkach obciążeń dynamicznych, w środowisku biologicznym. Zjawisko nadmiernego starzenia jest jednym z ograniczeń dotychczas stosowanych protez głosowych wytwarzanych z silikonu.
Zakres badań przeprowadzony w ramach tej publikacji dotyczył zagadnienia wytwarzania kompozytu z polimeru PEEK i różnych form węgla (włókno węglowe długie, i nanorurki węglowe, które pozwoliły wytworzyć kompozycje o architekturze izotropowej i anizotropowej), oceny trwałości kompozytu w warunkach dynamicznych symulujących środowisko biologiczne (płyn fizjologiczny, temperatura 37oC) oraz oceny biozgodności w warunkach in vitro. Przeprowadzone testy pozwoliły określić możliwość wykorzystania kombinacji różnych składników węglowych i polimeru PEEK pod kątem wytwarzania protezy głosowej i także biozgodności zastosowanego materiału w warunkach in vitro. Szczególnie interesującym i oryginalnym osiągnięciem doświadczeń prowadzonych w ramach zespołu było wykazaniem pozytywnego działania komponentu węglowego w postaci nanorurek węglowych wprowadzonych do matrycy polimerowej. Nanorurki poprawiały wyraźnie jednorodność materiałów kompozytowych, dzięki zaobserwowanemu zmniejszeniu odchylenia standardowego parametrów mechanicznych od wartości średniej.
Można oczekiwać, że dzięki obecności nanorurek węglowych i także komponentu węglowego w formie włókien takie kompozycje będą wykazywały właściwości bakteriostatyczne, co będzie przedmiotem dalszych badań. Plan dalszych badań zakłada także przeprowadzenie testów określających zdolności do tworzenia biofilmu oraz możliwości wytworzenia prototypu protezy głosowej.
Przeprowadzone badania w ramach tej pracy wykazały że zastosowane kompozycje są trwałe pod obciążeniem dynamicznym, znacznie przekraczającym naprężenia mechaniczne, które mogą powstawać w trakcie pracy protezy głosowej.
11 W szczególności dotyczy to kompozycji dodatkowo modyfikowanej nanorurkami węglowymi. Próbki zmodyfikowane nanorurkami węglowymi poprawiły jednorodność między warstwami węglowymi, co wykazano poprzez zmniejszenie standardowych odchyleń wartości średniej wytrzymałości i modułu.
Wyniki badań mechanicznych przy dynamicznych obciążeniach zginających wykazały, że propagacja fali ultradźwiękowej (do oceny procesu starzeniowego zastosowano nieniszczącą metodę badań za pomocą testów ultradźwiękowych) w materiałach kompozytowych zależy przede wszystkim od modułu sprężystości samych włókien węglowych i ich orientacji względem kierunku propagacji.
Materiały kompozytowe poddane obciążeniu dynamicznemu złożonemu wynoszącemu milion cykli zachowały swoją integralność mechaniczną, gdy maksymalna amplituda (ugięcie) zginania wynosiła 50% obciążenia niszczącego.
W kompozytach warstwowych (2D) bez nanorurek węglowych odnotowano niewielki wzrost odchylenia standardowego dynamicznego modułu sprężystego po próbie zmęczeniowej.
Testy biologiczne wykazały, że żywotność fibroblastów i osteoblastów określona w teście MTT, po tygodniu, jest nieco niższa w porównaniu z kontrolą i czystym polimerem. Na wartość żywotności ma wpływ zarówno rodzaj badanego materiału, jak i rodzaj linii komórkowej. Wykazano, że istotną rolę w badaniu żywotności próbek kompozytowych ma powierzchnia próbek. Spośród badanych komórek osteoblasty wykazują wyższą przeżywalność w porównaniu do fibroblastów. Ilość kolagenu I wytwarzanego przez osteoblasty w kontakcie z kompozytami jest wyższa niż ilość kolagenu I wytwarzanego przez te komórki w kontakcie z kontrolą i czystym polimerem. Generalnie, testy biologiczne wykazały, że czysty polimer charakteryzuje się nieco wyższą biozgodnością w porównaniu do kompozytów, jednak jest to głównie związane ze stanem fizycznym powierzchni próbek. Stan fizyczny powierzchni próbek charakteryzowany był na podstawie oceny zwilżalności w kontakcie z wodą i poprzez wyznaczenie parametru chropowatości. Badania wykazały, że powierzchnie materiałów kompozytowych są hydrofobowe, co może być korzystne ze względu na planowane zastosowanie jako protez głosowych, mianowicie powierzchnie hydrofobowe materiałów implantacyjnych zmniejszają oddziaływania chemiczne i fizyczne z otoczeniem biologicznym, co zmniejsza ryzyko niepożądanej odpowiedzi tkankowej.
12 Warto także zwrócić uwagę na rodzaj osnowy kompozytu stosowanej w naszych eksperymentach tj. polieteroeteroketon produkowany przez angielską firmę Victrex. Producent wytwarza PEEK do zastosowań medycznych produkowany pod marką InviBio jako linia produktów PEEK Optima. Odznaczają się one wysoką czystością chemiczną, posiadają certyfikat FDA (Food and Drug Administration – amerykańska Agencja ds. Żywności oraz Leków), oraz CE (znak spełniania Dyrektyw Nowego Podejścia Unii Europejskiej w zakresie Aktywnych Implantów Medycznych) dopuszczające go do stosowania w medycynie implantacyjnej. W naszych doświadczeniach wykorzystaliśmy polimer tej samej firmy, o nazwie handlowej Victrex PEEK 150PF który charakteryzuje się identycznymi właściwościami mechanicznymi i czystością jak wersja dla zastosowań medycznych. Polimer ten posiada atest FDA dopuszczający do kontaktu z żywnością i środkami spożywczymi. Może to być dodatkowym czynnikiem, który zapewni uzyskanie wyrobu w formie protezy głosowej i pożądanych właściwościach biologicznych.
Literatura:
1. Magiera A., Markowski J., Menaszek E., Pilch J., Blazewicz S.: PLA-based hybrid and composite electrospun fibrous scaffolds as potential materials for tissue engineering. Journal of Nanomaterials (2017) 1-11.
2. Dworak M., Blazewicz S.: Mechanical assessment of a hip joint stem model made of a PEEK/carbon fibre composite under compression loading. Acta of Bioengineering and Biomechanics 18(2) (2016) 71-79.
3. Hahnel S, Wieser A, Lang R, Rosentritt M., Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials., Clin Oral Implants Res. 2015 Nov;26(11):1297-301. doi: 10.1111/clr.12454. Epub 2014 Jul 24
4. Montero JF, Tajiri HA, Barra GM, Fredel MC, Benfatti CA, Magini RS, Pimenta AL, Souza JC, Biofilm behavior on sulfonated poly(ether-ether- ketone) (sPEEK), Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.
5. Schwitalla AD, Spintig T, Kallage I, Muller WD. Flexural behavior of PEEK materials for dental application. Dental Materials 2015:31(11):1377- 1384.
6. Brockett CL, Carbone S, Abdelgaied A, Fisher J, Jennings LM. Influence of contact pressure, cross-shear and counterface material on wear of PEEK and
13 CFR-PEEK for orthopeadic applications. Journal of the Mechanical
Behavior of Biomedical Materials 2016:63:10-16.
7. Nazimi AJ, Yusoff MM, Nordin R, Nabil S. Use of polyetheretherketone (PEEK) in orbital floor fracture reconstruction - A case for concern. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, Medicine, and Pathology
2015:27(4):536-539.
8. Dworak, M., Bloch, M., Blazewicz, S.: Chemical and mechanical study of PEEK/carbon fibre composite, Engineering of Biomaterials. Polish J. 10 (69–72): 121–124 (2007)
Wojciech Smolka, Agnieszka Panek, Maciej Gubernat, Aneta Szczypta-Fraczek, Piotr Jelen, Czeslawa Paluszkiewicz, Jaroslaw Markowski, Marta Blazewicz;
Structure and biological properties of surface-engineered carbon nanofibers
Celem badań przedstawionych w publikacji było określenie wyselekcjonowanych właściwości jednej z nowych form węgla, jaką jest nanowłókno węglowe w aspekcie możliwej przyszłej aplikacji jako materiału elektrodowego dla potrzeb otolaryngologii. W szczególności przedmiotem badań były nanowłókna węglowe przewodzące prąd elektryczny do budowy wszczepialnych elektrod o zminiaturyzowanych rozmiarach, a także na ocenie możliwości wykorzystania takich form materiałowych do wytwarzania podłoża dla inżynierii tkankowej i terapii komórkami macierzystymi.
Mój wkład w powstanie pracy polegał na uczestnictwie w opracowaniu planu pracy, opisu stanu wiedzy do części literaturowej nt. materiałów stosowanych na implanty (59 poz. literaturowych w publikacji), zaplanowaniu badań materiałowych, udziału w interpretacji wyników badań in vitro i uczestnictwie w redakcji manuskryptu.
Współczesna medycyna stosuje coraz więcej rozwiązań terapeutycznych opartych na osiągnięciach nanotechnologii i nanomateriałów. Materiały
o zmniejszonych wymiarach do nanoskali, tj. nanomateriały, często charakteryzują się specyficznymi właściwościami fizycznymi i chemicznymi, które są szczególnie interesujące pod względem potencjalnych zastosowań medycznych [1].
Dotychczasowe badania nad nowymi formami nanomateriałów zaowocowały
14 opracowaniem szeregu nowych rozwiązań w dziedzinie terapii medycznych i diagnostyki, w tym bioczujników, wszczepialnych elektrod, materiałów na nośniki leków, terapii przeciwnowotworowej, a także opracowaniem nowych metod w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej [2–4]. Rozwój i dotychczasowe sukcesy medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej są w dużej mierze następstwem osiągnięć nanotechnologii i stosowania nowych nanomateriałów [5].
Inżynieria tkankowa to dziedzina oparta na projektowaniu i wytwarzaniu specyficznych rusztowań biomimetycznych, odwzorowujących strukturę macierzy pozakomórkowej, często modyfikowaną środkami bioaktywnymi. Komórki zasiedlające takie rusztowanie tkankowe mają odpowiednie warunki do proliferacji i różnicowania.
W strukturze żywej tkanki endogenne pola elektryczne odgrywają ważną rolę w kontrolowaniu funkcji komórkowych, takich jak morfologia, ekspresja genów, proliferacja i migracja. Obecnie prowadzone są badania nad rozwojem alternatywnych procesów aktywacji komórkowej, a stymulacja elektryczna jest jednym z kierunków badań w inżynierii regeneracyjnej nerwów, a także w leczeniu mięśni szkieletowych w tym mięśnia sercowego [6-12]. Wykazano, że wprowadzenie stymulacji pola elektrycznego w leczeniu komórkowym jest korzystnym czynnikiem fizycznym, wpływającym na skuteczność metod inżynierii tkankowej. Takie wspomaganie w leczeniu chorych tkanek jest interesującym kierunkiem badań m.in. w terapii komórkami macierzystymi. Interakcje między komórkami macierzystymi i ich środowiskiem w warunkach in vivo są bardzo złożone i obejmują czynniki biochemiczne, składniki macierzy pozakomórkowej oraz czynniki fizyczne wpływające na zachowanie komórek. Wszystkie te elementy, wykorzystywane do regulacji procesów zachodzących w komórkach macierzystych, są bardzo ważnymi czynnikami tworzącymi korzystne warunki w terapii komórkami macierzystymi [13–14].
Otolaryngologia, podobnie jak kardiochirurgia czy neurochirurgia, poszukuje nowych rozwiązań w dziedzinie stosowania metod terapeutycznych wykorzystujących nanomateriały przewodzące prąd elektryczny do budowy zarówno wszczepialnych elektrod, jak i nanomateriałów, umożliwiających budowę materiałów na podłoża dla inżynierii tkankowej i terapii komórkami macierzystymi.
15 Utrata słuchu jest powszechnym schorzeniem spowodowanym nieodwracalnym uszkodzeniem komórek rzęsatych ucha wewnętrznego i/lub neuronów zwojów spiralnych.
W ostatnich latach, obserwuje się wzrost częstości występowania głębokiego niedosłuchu i głuchoty, szczególnie wśród starzejącego się społeczeństwa. Jest to m.in. spowodowane rozwojem technologii oddziaływujących na człowieka, wzrostem narażenia na hałas, zanieczyszczenia środowiska, wzrostem infekcji wirusowych czy nadużywaniem leków ototoksycznych. Według danych Światowej Organizacji Zdrowia utrata słuchu poważnie wpływa na jakość życia wśród 360 milionów ludzi na całym świecie, co powoduje, że jest to problem globalny. Istnieje wiele rozwiązań terapeutycznych w leczeniu tej choroby, takich jak aparaty słuchowe i implanty ślimakowe, które mogą zapewnić przywrócenie funkcji słuchu [15].
Komórki rzęsate i neurony spiralne nie mają zdolności samoregeneracji, toteż regeneracja uszkodzonych ślimakowych komórek rzęsatych i neuronów spiralnych, drogą różnicowania się komórek macierzystych lub komórek progenitorowych, wzbudza w ostatnich latach duże zainteresowanie świata nauki.
Prowadzone są równolegle badania nad opracowaniem biologicznej metody naprawy uszkodzonego ślimaka, która może przywrócić normalne słyszenie, bez materiałów implantacyjnych, drogą hodowli komórkowych, metodami inżynierii tkankowej z wykorzystaniem syntetycznych podłoży nośnych (skafoldów). Tego rodzaju przesłanki stały się siłą napędową rozwoju terapii komórkami macierzystymi w otolaryngologii [16 -17].
Jak wynika z przeglądu literatury dotyczącej biomateriałów węglowych, nowe formy węgla, takie jak nanorurki węglowe (CNT), grafen lub nanowłókna węglowe (CNF), okazały się materiałami szczególnie interesującymi w opracowaniu nowych biomateriałów i implantowalnych elementów elektronicznych w urządzeniach medycznych [18]. Ze względu na ich właściwości elektronowe, wysokie przewodnictwo elektryczne, formę biomimetyczną (nanowłókno o zbliżonej średnicy do włókien kolagenowych budujących macierz pozakomórkową) i specyficzne właściwości powierzchniowe, mogą być stosowane w konstrukcji wszczepialnych elektrod i bioczujników oraz jako podłoża tkankowe do zastosowań in vitro i in vivo. Z tego względu stymulacja polem elektrycznym, dzięki
16 właściwościom przewodzącym substratów węglowych, może stać się metodą regulującą zachowanie komórek, zarówno in vivo, jak i in vitro.
Jednak wymienione formy węglowe w trakcie oddziaływania z tkankami i komórkami mogą wykazywać działanie toksyczne. Ostatnie prace dotyczące biozgodności nanorurek węglowych (CNT) dowiodły istotnego wpływu sposobu ich przygotowania na reakcję z komórkami i tkankami [19-20]. Wiele badań wskazało, że krytycznymi parametrami determinującymi zachowanie biologiczne CNT są morfologia ich powierzchni, chemiczny stan powierzchni i ich właściwa dyspersja w układzie biologicznym [20]. Funkcjonalizacja powierzchniowa CNT jest jednym za sposobów zmniejszenie efektów cytotoksycznych [21].
Dotychczasowe badania w tym zakresie, wykazały, że nanorurki węglowe wymagają dodatkowej obróbki chemicznej celem usunięcia toksycznych frakcji węglowych, które mogą pojawić się w ich strukturze i które mogą być odpowiedzialne za jego zachowanie biologiczne. Wiele prac badawczych poświęcono biozgodności CNT i grafenu. Nanowłókna węglowe, które są przedmiotem badań niniejszej pracy, jako nowa forma węgla, są dopiero w początkowej fazie badań w aspekcie możliwych zastosowań medycznych.
Celem badań prezentowanych w omawianej publikacji było zaproponowanie nowego podejścia do wytworzenia biozgodnych nanowłókien węglowych, które mogą znaleźć zastosowanie w medycynie regeneracyjnej, jako nowe biomateriały, elementy elektrodowe implantów słuchowych i rusztowania typu 3D przewodzące prąd elektryczny, komponenty implantowalnych miniaturowych elementów urządzeń medycznych, biosensory czy mikroelektrody.
W omawianej publikacji opracowano nową metodę wytworzenia biozgodnych nanowłókien węglowych tworzących formę izotropowej maty węglowej. Biozgodność wybranych form włóknistego węgla potwierdzono za pomocą testów biologicznych, wyjaśniono mechanizm oddziaływania materiałów węglowych w formie nanowłókien, przeprowadzono podstawowe charakterystyki fizyczno- chemiczne pod kątem wykorzystania takich form węgla jako elementów elektrodowych i podłoży dla hodowli komórkowych. Testy biozgodności polegały na zbadaniu ich genotoksyczności i cytotoksyczności. Nanowłókna otrzymane zostały w Katedrze Biomateriałów i Kompozytów, Wydziału Inżynierii Materiałowej i Ceramiki, Akademii Górniczo- Hutniczej. Wytworzono je z polimeru poliakrylonitrylowego metodą elektrospiningu, a następnie poddano
17 obróbce termicznej do 1000oC. Wytworzono dwa rodzaje materiałów, które różniły się sposobem przygotowania tych materiałów w końcowej fazie preparacji. Jeden rodzaj nanowłókien został wytworzony jako materiał po obróbce do 1000 oC, a drugi został dodatkowo poddany powierzchniowej obróbce chemicznej. Zastosowana obróbka powierzchniowa była jednym z kluczowych problemów rozwiązywanych w ramach eksperymentów prowadzonych w ramach tej pracy, z uwagi na wcześniejsze doświadczenia autorów w zakresie badań biomateriałów węglowych i istotności przygotowania powierzchni takich materiałów do kontaktu z otoczeniem biologicznym. Nanowłókna węglowe są stosunkowo nowym obiektem badań w aspekcie potencjalnych zastosowań medycznych. Wcześniejsze badania dotyczące mikrowłókien węglowych, w tym doświadczenia dotyczące tej grupy materiałów do wytwarzania implantów krtani i tchawicy, a także badania kliniczne dla ortopedii, chirurgii ogólnej, chirurgii rekonstrukcyjnej twarzoczaszki i okulistyki wykazały, że jednym z istotnych czynników decydujących o biozgodności węgla jest odpowiednia funkcjonalizacja fizyczna i chemiczna jego powierzchni. Zatem w omawianej pracy, dotyczącej nowej formy węgla, jaką jest nanowłókno węglowe, szczególną uwagę w wytworzeniu tych materiałów poświęcono preparatyce powierzchniowej.
Badania strukturalne za pomocą mikroskopii transmisyjnej wysokiej rozdzielczości (TEM+SAED) i mikroskopii rentgenowskiej pozwoliły uwidocznić charakterystyczne cechy budowy nowego biomateriału. Badania te wykazały podobieństwo struktury nanowłókna węglowego do budowy mikrowłókna węglowego. Ten wynik badań struktury badanego węgla został wykorzystany do opracowania warunków chemicznej obróbki powierzchniowej i przygotowania drugiej formy nanowłókna powierzchniowo funkcjonalizowanego chemicznie.
Dyfraktogramy rentgenowskie próbek węgla po dekonwolucji charakterystycznych pików węgla (002) wykazały, że mikrostruktura nanowłókien jest silnie zróżnicowana. Zastosowana obróbka powierzchniowa zmieniła istotnie morfologię powierzchni nanowłókna, doprowadzając do usunięcia frakcji materiału węglowego z tzw. granic międzykrystalitowych. Ponieważ nanowłókna węglowe po obróbce powierzchniowej charakteryzowały się wyższą biozgodnością w testach biologicznych, usuwanie tej fazy można wiązać z usunięciem składnika, który był przyczyną negatywnej oceny nanowłókien bez obróbki w testach biologicznych.
18 Ocena istotnego parametru fizycznego, ze względu na przyszłe zastosowanie opracowanego materiału, jako materiału elektrodowego, została dokonana na podstawie wyznaczenia podstawowych charakterystyk, tj. badając zmiany rezystancji powierzchniowych nanowłókien węglowych w funkcji temperatury.
Oba rodzaje nanowłókien różniły się strukturą, co związane było ze sposobem ich wytwarzania. Dla obu próbek krzywe reprezentujące zmiany rezystancji są podobne; tj. wraz ze wzrostem temperatury rezystywność powierzchniowa maleje;
jest to zachowanie materiałów charakteryzujących się właściwościami półprzewodnikowymi. Wyższą rezystywność powierzchniową mają nanowłókna po dodatkowej obróbce chemicznej w porównaniu do nanowłókien węglowych bez obróbki. Wyższa rezystywność powierzchniowa nanowłókien węglowych jest konsekwencją zmiany morfologii powierzchni w wyniku obróbki powierzchniowej.
Badania biologiczne, których celem było określenie biozgodności opracowanych materiałów węglowych przeprowadzono wykonując test genotoksyczności i testy cytotoksyczności. Do badań wykorzystano fibroblasty ludzkiej skóry z linii komórkowej CCL-110 (American Type Culture Collection). Prowadzono obserwacje poziomu uszkodzenia DNA po 24-godzinnej inkubacji z nanowłóknami w obecności komórek. Uzyskano informacje na temat trwałości efektów interakcji z DNA i wpływu na integralność nici DNA (fragmentacja DNA związana z apoptozą). Analizę poziomów uszkodzenia DNA w badaniu in vitro przeprowadzono przy użyciu alkalicznej wersji testu kometowego [22].
Przeprowadzono doświadczenia, w których hodowle komórkowe zawierające oba rodzaje nanowłókien były poddane napromieniowaniu dawką 1 Gy, w czasie 1 godziny i w czasie 24 godzin. W normalnych komórkach po ich napromieniowaniu, uszkodzenie powstałe w jego wyniku powinno zostać zregenerowane w ciągu 24 godzin inkubacji. Porównanie wartości T-DNA (Tranformujący DNA) w tak zaplanowanych eksperymentach, oprócz informacji związanych z genotoksycznością i cytotoksycznością, pozwoliło także dostarczyć danych na temat degradacji procesów naprawczych w komórkach kontaktowych z nanowłóknami węglowymi. Uszkodzenie DNA określano ilościowo na podstawie procentowego pomiaru uszkodzonego DNA ogona komety. Zmiany w rozmieszczeniu DNA ogona są uważane za wrażliwy wskaźnik początkowego pęknięcia DNA i jego naprawy.
19 Wyniki testów biologicznych z wykorzystaniem fibroblastów kontaktujących się z próbkami węglowymi bez napromieniowania i po napromieniowaniu rentgenowskim, wykazały znacząco wyższy poziom uszkodzenia DNA komórek kontaktujących się z materiałami węglowymi niemodyfikowanymi, jak i w porównaniu do kontroli (komórki bez materiałów węglowych). Przeprowadzone badania wykazały, że obecność nanowłókien węglowych bez obróbki chemicznej w hodowli komórkowej spowodowała wyższy poziom martwych komórek (24%), w porównaniu do testu z nanowłóknami modyfikowanymi (6%) i kontroli (4%). W przypadku nanowłókien specjalnie modyfikowanych powierzchniowo w kontakcie z fibroblastami, zarówno w warunkach bez napromieniowania i po napromieniowaniu (dawka promieniowania rentgenowskiego 1Gy), liczba uszkodzeń DNA i poziom komórek martwych były podobne do próby kontrolnej.
Ocena wpływu nanomateriałów na proces naprawczy DNA, na podstawie poziomu jego uszkodzenia w komórkach po napromieniowaniu wykazała znacznie wyższy poziom żywych fibroblastów, w porównaniu z komórkami w obecności nanowłókien wyjściowych (bez obróbki chemicznej). Ten ostatni materiał jest genotoksyczny, o czym świadczy zarówno wartość parametru T-DNA, wskazująca na wzrost uszkodzeń DNA, i obserwowane obniżenie przeżywalności komórkowej, podczas gdy drugi badany materiał nie jest genotoksyczny.
Nanowłókna obrabiane chemicznie wprowadzone do hodowli komórkowej nie wpływają negatywnie na procesy naprawcze kontaktujących się z nimi komórek.
Analiza morfologii komórek MG63 w kontakcie z nanowłóknami wykazała znaczące różnice w ich zachowaniu, w zależności od rodzaju nanowłókien. W przypadku nanowłókien wyjściowych kontaktujące się komórki były okrągłe, bez występowania połączeń między sobą. Jednocześnie w tych hodowlach obserwowano znaczący wzrost poziomu komórek martwych. W przypadku komórek, które kontaktowały się z nanowłóknami poddanymi obróbce powierzchniowej, zaobserwowano ich lepsze przyleganie do podłoża, były dobrze rozłożone, a ich kształty były podobne do tych, które obserwowano w badaniach kontrolnych. W przypadku tych nanowłókien nie obserwowano martwych komórek, co wskazywało na brak ich działania cytotoksycznego. Wyniki te są spójne z danymi uzyskanymi z badania biologicznego próbek węglowych w kontakcie z fibroblastami.
20 Wyniki badań prowadzonych w ramach tej pracy pozwoliły zaproponować prawdopodobny mechanizm, wynikający z zastosowanej obróbki chemicznej, według którego usunięcie frakcji węgla z nanowłókna węglowego zmienia strukturę powierzchni i kształt cząstek węgla znajdujących się w warstwie przypowierzchniowej. Została postawiona hipoteza, że nanometryczne cząstki węgla (nieobrabiane chemicznie) w kontakcie z ośrodkiem komórkowym (również w teście kometowym) uwalniają aromatyczne i alifatyczne związki węgla, prawdopodobnie pochodzące z mniej uporządkowanych faz węgla, w tym granic międzykrystalicznych. Takie związki mogą wykazywać zachowanie cytotoksyczne i genotoksyczne w hodowli komórkowej. Należy nadmienić, że zaproponowane wytłumaczenia, skrajnie różnego zachowania się dwóch nanometrycznych form węgla, jest oryginalne i po raz pierwszy opublikowane w niniejszej pracy. Jednakże proponowany mechanizm oddziaływania nanoform węgla z otoczeniem biologicznym (hodowle komórkowe, test kometowy, dodatkowe testy biologiczne, badania in vivo) wymaga dalszych badań celem jego potwierdzenia. Właściwości biologiczne nanomateriałów węglowych są zagadnieniem złożonym, i w dostępnej literaturze zagadnienie to opisane jest niekonsekwentnie i niejednoznacznie.
Ogólnie wiadomo, że w przypadku nanoform węglowych, zwłaszcza otrzymanych w procesach CVD (chemical vapour deposition- chemiczne osadzanie z fazy gazowej) o dobrze zdefiniowanej strukturze, czynnikami wpływającymi na odpowiedź komórkową pod względem cytotoksyczności i genotoksyczności są wielkość i kształt drobin węglowych (krystalitów), stan chemiczny powierzchni oraz obecność powierzchniowo reaktywnych form tlenu (ROS- surface reactive oxygen species), które mogą prowadzić do uszkodzenia DNA komórek [23]. Z drugiej strony nanomateriały węglowe otrzymane drogą obróbki termicznej włóknistych prekursorów polimerowych różnią się wyraźnie od węgla typu nanorurka, grafen. W tym przypadku nie można wykluczyć wpływu wszystkich wyżej wymienionych czynników na charakter odpowiedzi komórkowej, chociaż kluczowe znaczenie mają produkty karbonizacji (obróbki termicznej), które mogą być toksyczne i genotoksyczne w kontakcie z komórkami. W niniejszej pracy właściwości powierzchniowe nanowłókien węglowych badano poprzez pomiar kąta zwilżania wodą. Badania wykazały znaczące różnice obu badanych form nanowłókien, tj. nanowłókna wyjściowe były hydrofobowe, a po obróbce utleniającej stały się hydrofilowe. Zasadniczo hydrofilowość biomateriału
21 przeznaczonego np. na rusztowania do hodowli komórkowych jest korzystnym czynnikiem związanym z regeneracją niektórych rodzajów tkanek. Dlatego wydaje się, że materiały węglowe składające się z nanowłókien węglowych, po zastosowanym procesie obróbki chemicznej, mają korzystniejsze właściwości powierzchni jako potencjalne podłoża do regeneracji tkanek, w porównaniu z nanowłóknami wyjściowymi. Zastosowana obróbka utleniająca spowodowała tylko niewielki wzrost oporności nanowłókien i nadal były to materiały przewodzące, co jest istotne w odniesieniu do potencjalnych zastosowań jako materiałów elektrodowych czy rusztowań do hodowli komórek i tkanek z zachowanym przewodnictwem elektrycznym. Ich budowa mikrostrukturalna (porowatość, średnica nanowłókna) była porównywalna dla obu rodzajów badanych próbek węglowych. Nietoksyczne i niegenotoksyczne nanowłókna węglowe mogą być przedmiotem dalszego zainteresowania i badań jako materiały do konstrukcji elektrod do stymulacji elektrycznej, a także jako elementy podłożowe do elektrycznie aktywowanych hodowli komórkowych.
Zastosowana chemiczna obróbka utleniająca znacząco zmieniła morfologię powierzchni nanowłókien i zmniejszyła udział fazy węglowej zawierającej nieuporządkowane kryształy węgla. Test T-DNA wykazał, że utlenione powierzchniowo nanowłókna węglowe nie były genotoksyczne, podczas gdy nieobrabiane nanowłókna węglowe wskazały na wzrost uszkodzenia nici DNA i większą liczbę martwych komórek, w porównaniu do kontroli. Czysty materiał węglowy wprowadzony do hodowli komórkowej nie wpływał na procesy naprawcze w kontaktujących się z nimi komórkach.
Przeprowadzone badania wykazały skuteczność zaproponowanej obróbki powierzchniowej nanowłókien węglowych. Jednocześnie przeprowadzone badania wykazały wrażliwość powierzchni nanometrycznego węgla jako potencjalnego biomateriału do szeregu zastosowań medycznych, w tym dla laryngologii.
Warunkiem uzyskania biozgodnej formy nanowęgla włóknistego jest jego odpowiednia obróbka powierzchniowa po procesie syntezy z surowca polimerowego.
22 Literatura:
1. T. J. Webster, Ed., Nanomedicine: Technologies and Applications, Woodhead Publishing, Oxford, PA, USA, 2012.
2. Y. Nishimura, J. Ishii, C. Ogino, and A. Kondo, “Genetic engineering of bio- nanoparticles for drug delivery: a review,” Journal of Biomedical Nanotechnology, vol. 10, no. 9, pp. 2063– 2085, 2014.
3. Y.-Y. Huang, S. K. Sharma, R. Yin, T. Agrawal, L. Y. Chiang, and M. R.
Hamblin, “Functionalized fullerenes in photodynamic therapy,” Journal of Biomedical Nanotechnology, vol. 10, no. 9, pp. 1918–1936, 2014.
4. B. C. Janegitz, J. Cancino, and V. Zucolotto, “Disposable biosensors for clinical diagnosis,” Journal of Nanoscience and Nanotechnology, vol. 14, no. 1, pp. 378–
389, 2014.
5. L. Zhang and T. J. Webster, “Nanotechnology and nanomaterials: promises for improved tissue regeneration,” Nano Today, vol. 4, no. 1, pp. 66–80, 2009 6. R. Balint, N. J. Cassidy, and S. H. Cartmell, “Electrical stimulation: a novel tool
for tissue engineering,” Tissue Engineering Part B: Reviews, vol. 19, no. 1, pp.
48–57, 2013.
7. G. Shi, Z. Zhang, and M. Rouabhia, “The regulation of cell functions electrically using biodegradable polypyrrole–polylactide conductors,” Biomaterials, vol. 29, no. 28, pp. 3792– 3798, 2008.
8. R. Huo, Q. Ma, J. J. Wu et al., “Noninvasive electromagnetic fields on keratinocyte growth and migration,” The Journal of Surgical Research, vol. 162, no. 2, pp. 299–307, 2010.
9. M. Zhao, “Electrical fields in wound healing—an overriding signal that directs cell migration,” Seminars in Cell & Developmental Biology, vol. 20, no. 6, pp.
674–682, 2009.
10. W. Zhu, T. Ye, S.-J. Lee et al., “Enhanced neural stem cell functions in conductive annealed carbon nanofibrous scaffolds with electrical stimulation,”
Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, vol. 14, no. 7, pp.
2485–2494, 2018.
11. C. P. Huang, X. M. Chen, and Z. Q. Chen, “Osteocyte: the impresario in the electrical stimulation for bone fracture healing,” Medical Hypotheses, vol. 70, no. 2, pp. 287–290, 2008.
23 12. L. Li, Y. H. El-Hayek, B. Liu et al., “Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration,” Stem Cells, vol. 26, no. 8, pp. 2193–
2200, 2008.
13. S. Mobini, L. Leppik, V. Thottakkattumana Parameswaran, and J. H. Barker,
“In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells,” PeerJ, vol. 5, article e2821, 2017.
14. A. S. Rowlands and J. J. Cooper-White, “Directing phenotype of vascular smooth muscle cells using electrically stimulated conducting polymer,”
Biomaterials, vol. 29, no. 34, pp. 4510– 4520, 2008.
15. F.-G. Zeng, S. J. Rebscher, Q.-J. Fu et al., “Development and evaluation of the Nurotron 26-electrode cochlear implant system,” Hearing Research, vol. 322, pp. 188–199, 2015.
16. M. N. Rivolta, “Developing a stem cell-based therapy for the treatment of hearing loss,” Hearing, Balance and Communication, vol. 13, no. 4, pp. 148–
152, 2015.
17. H. Kasagi, T. Kuhara, H. Okada, N. Sueyoshi, and H. Kurihara, “Mesenchymal stem cell transplantation to the mouse cochlea as a treatment for childhood sensorineural hearing loss,” International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, vol. 77, no. 6, pp. 936–942, 2013.
18. P. A. Tran, L. Zhang, and T. J. Webster, “Carbon nanofibers and carbon nanotubes in regenerative medicine,” Advanced Drug Delivery Reviews, vol.
61, no. 12, pp. 1097–1114, 2009.
19. J. V. Veetil and K. Ye, “Tailored carbon nanotubes for tissue engineering applications,” Biotechnology Progress, vol. 25, no. 3, pp. 709–721, 2009.
20. C.-W. Lam, J. T. James, R. McCluskey, S. Arepalli, and R. L. Hunter,“A review of carbon nanotube toxicity and assessment of potential occupational and environmental health risks,” Critical Reviews in Toxicology, vol. 36, no. 3, pp.
189–217, 2006.
21. A. Fraczek, E. Menaszek, C. Paluszkiewicz, and M. Blazewicz, “Comparative in vivo biocompatibility study of single- and multi-wall carbon nanotubes,” Acta Biomaterialia, vol. 4, no. 6, pp. 1593–1602, 2008.
22. A. Cebulska-Wasilewska, A. Panek, Z. Żabiński, P. Moszczyński, and W. W.
Au, “Occupational exposure to mercury vapour on genotoxicity and DNA
24 repair,” Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 586, no. 2, pp. 102–114, 2005.
23. A. A. Shvedova, E. R. Kisin, D. Porter et al., “Mechanisms of pulmonary toxicity and medical applications of carbon nanotubes: two faces of Janus?,”
Pharmacology & Therapeutics, vol. 121, no. 2, pp. 192–204, 2009.
Wojciech Smolka, Elzbieta Dlugon, Piotr Jelen, Wiktor Niemiec, Agnieszka Panek, Czeslawa Paluszkiewicz, Barbara Zagrajczuk, Elzbieta Menaszek, Jaroslaw Markowski,Marta Blazewicz, Carbon Nanofibers Coated with Silicon/Calcium- Based Compounds for Medical Application
Praca rozwija tematykę dotyczącą nowego rodzaju węgla w postaci nanowłókien węglowych (mata węglowa), jako potencjalnego biomateriału do zastosowań medycznych, w szczególności dla medycyny regeneracyjnej. W odróżnieniu od publikacji nr 2, w której opisano tę samą postać węgla, po odpowiedniej modyfikacji chemicznej, w niniejszej pracy badania koncentrowały się na opracowaniu nanowłókien węglowych w formie mat i dodatkowej impregnacji takiej fazy związkami krzemu i wapnia metodą zol-żel. Na podstawie analizy literaturowej, a także dotychczasowych badań własnych autorów tej pracy materiały takie mogą znaleźć zastosowanie w chirurgii kostnej i kostno-chrzęstnej, w tym także dla potrzeb laryngologii. Wymaga to opracowania nowej generacji implantów, które mogłoby przyczynić się do zmniejszenia liczby operacji z wykorzystaniem tkanki pacjenta. W laryngologii nowe biomateriały z nanowłókien aktywnych biologicznie mogłyby znaleźć zastosowania w rekonstrukcjach kosteczek słuchowych, rekonstrukcji tylnej ściany kanału słuchowego, elektrodach implantów ślimakowych, w operacjach rekonstrukcyjnych w zakresie twarzoczaszki, chirurgii rekonstrukcyjnej inwazyjnej i perforacjach przegrody nosowej. Przeprowadzone badania doświadczalne w warunkach in vitro potwierdziły oczekiwane właściwości biologiczne (biomateriały osteokonduktywne) opracowanych nanokompozycji węglowo- ceramicznych, jako biomateriały aktywne, a tematyka jest aktualnie rozwijana w Katedrze Biomateriałów i Kompozytów Akademii Górniczo –
25 Hutniczej, Katedrą i Kliniką Laryngologii Wydziału Lekarskiego Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach i Instytutem Fizyki Jądrowej PAN w Krakowie.
Brałem udział w opracowaniu dotychczasowego stanu wiedzy na ten temat (45 pozycji literaturowych), planu pracy eksperymentalnej, wyborze technik instrumentalnych pozwalających na charakterystykę biologiczną wytworzonych materiałów oraz w interpretacji części wyników biologicznych, a także uczestniczyłem w przygotowaniu końcowej wersji manuskryptu.
W omawianej publikacji celem badań, było opracowanie nowego biomateriału (którego głównym komponentem były nanowłókna węglowe), poddanego dodatkowej funkcjonalizacji dla uzyskania jego aktywnej formy w środowisku biologicznym.
Nanowłókna węglowe, jako nanometryczna forma węgla, są przedmiotem zainteresowania wielu dziedzin techniki, a także medycyny [1–4]. W odniesieniu do zastosowań medycznych stały się obiektem szczególnego zainteresowania dopiero w ostatnich latach, m.in. w kontekście dużego zainteresowania świata medycznego innymi formami węgla tj. grafenem i nanorurką węglową. Opublikowano wiele prac poświęconych możliwości wykorzystania nanoform węgla w medycynie, w tym inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej.
Przez analogię do nanorurek węglowych, które mają niezwykłe właściwości fizyczne, mechaniczne i biologiczne, zwrócono uwagę na nanowłókna węglowe, które w odróżnieniu do nanorurek węglowych można wytwarzać mniej skomplikowanym i znacznie tańszymi metodami.
Są one produktem obróbki termicznej tzw. prekursorowych nanowłókien polimerowych, które można wytwarzać metodą elektrospiningu w postaci mat, membran lub bardziej złożonych struktur przestrzennych typu 3D.
Nanowłókna polimerowe ze względu na ich znaczne rozwinięcie powierzchni (powierzchnia właściwa), wynikającą z dużego stosunku powierzchni do objętości i małej średnicy, mogą pełnić rolę macierzy pozakomórkowej w inżynierii tkankowej. Takie nanowłókna w postaci porowatych mat mogą być stosowane jako membrany w medycynie rekonstrukcyjnej i jako podłoża dla procesów regeneracyjnych różnych tkanek [5-7]. Nanowłókna mogą być wytwarzane w zakresach średnic zbliżonych do włókien kolagenowych tkanki kostnej. Dzięki swojej formie, właściwościom fizycznym i chemicznym stają się kandydatami do
26 wielu zastosowań medycznych; w konstrukcji bioczujników i elektrostymulacji układu nerwowego, a także do wytwarzania rusztowań dla potrzeb medycyny regeneracyjnej [8-9].
Dotychczasowe badania w zakresie włóknistych form węgla wykazały, że zarówno mikro, jak i nanowłókna węglowe mogą charakteryzować się właściwościami chondrogennymi, i potencjalnie być wykorzystane do leczenia i regenerowania chrząstki [10-12]. Implanty włókniste wytworzone z nanowłókien mogą być również przydatne w zastosowaniach w laryngologii. Ten obszar zastosowań wymaga jednak opracowania nowej generacji biomateriałów, których szersze zastosowanie mogłoby przyczynić się do zmniejszenia liczby operacji z wykorzystaniem tkanki pacjenta. W laryngologii różne biomateriały są wykorzystywane w rekonstrukcjach lub zastępowaniu, m.in. kosteczek słuchowych, rekonstrukcji tylnej ściany zewnętrznego kanału słuchowego, elektrodach implantów ślimakowych, rekonstrukcji elementów twarzoczaszki, chirurgii rekonstrukcyjnej ubytków przegrody nosowej [13-14]. Istnieje także potrzeba opracowania nowych biomateriałów aktywnych, osteogennych i chondrogennych, a także biozgodnych do budowy elektrod wszczepialnych. Nanowłókna węglowe o kontrolowanej strukturze mogą być cennym substratem, na powierzchni którego można wprowadzić bioaktywne cząsteczki oraz substancje organiczne i nieorganiczne. Otwarta, wysoko porowata mikrostruktura nanowłókien węglowych, dodatkowo aktywowana drogą odpowiedniej obróbki utleniającej [praca nr 2] może być podatna na dalszą funkcjonalizację w kierunku wspomnianych właściwości osteo- i chondrogennych, nie ograniczając się tylko do powierzchni samych nanowłókien. Wcześniejsze prace niektórych współautorów tej publikacji wykazały możliwość modyfikacji powierzchni nanowłókien węglowych nanocząstkami hydroksyapatytu lub nanorurkami węglowymi, pod kątem aktywacji do kontaktu z tkanką kostną [15]. Tak funkcjonalizowane nanowłókna mogą być punktem wyjścia do projektowania i wytwarzania materiałów przeznaczonych do leczenia i regeneracji tkanek. Nowym sposobem funkcjonalizacji nanowłókien węglowych może być dotowanie struktury węglowej związkami zawierającymi krzem i wapń.
Takie podejście pozwala na uzyskanie nowego bioaktywnego biomateriału, który może być stosowany w chirurgii kostno-chrzęstnej i chirurgii tkanki kostnej.
Weryfikację tej hipotezy przeprowadzono w ramach eksperymentów wykonanych w omawianej publikacji, i celem ich było opracowanie metody modyfikacji
27 nanowłókien węglowych za pomocą związków krzemu i wapnia do zastosowań w medycynie regeneracyjnej kości. Przygotowano nanowłókna węglowe z polimeru poliakrylonitrylowego, następnie taką próbkę w postaci izotropowej maty nasycono zolem krzemianowo-wapniowym. Badania biologiczne miały na celu wykazanie, czy sposób funkcjonalizacji nie zmienia biozgodności tej formy biomateriału, a dodatkowe testy ze sztucznym osoczem i testy biologiczne miały wykazać ich właściwości osteokonduktywne. Przeprowadzono testy biologiczne, w tym genotoksyczność, cytotoksyczność i aktywność fosfatazy alkalicznej (ALP).
Opisano morfologię komórek hodowanych w obecności nanowłókien. Próbki węglowe poddano testowi bioaktywności w kontakcie ze sztucznym osoczem SBF.
Jak dotąd takie doświadczenia dotyczące zarówno sposobu funkcjonalizacji jak i oceny aktywności biologicznej nanowłókien węglowych nie zostało jeszcze opisane w literaturze. Interesującym, nowym zagadnieniem tej pracy było zaproponowanie oryginalnej metody funkcjonalizacji nanowłókien węglowych techniką zol- żel roztworami krzemionkowo-wapniowymi; drogą impregnacji oraz stabilizacji kompozycji węglowo- ceramicznej.
Istotą funkcjonalizacji było wprowadzenie do nanowłókien węglowych w formie mat, związków krzemu i wapnia. Maty węglowe o izotropowym rozłożeniu nanowłókien przygotowano zgodnie z wcześniej opracowanymi warunkami wytwarzania tej formy węgla z polimeru poliakrylonitrylowego. Aktywację chemiczną przeprowadzono drogą impregnacji wysoko porowatej struktury maty węglowej zolem krzemionkowo-wapniowym a następnie procesem końcowej stabilizacji. Otrzymane próbki nanowłókien, zaimpregnowane związkami krzemu i wapnia, zostały poddane różnym badaniom; określono wybrane właściwości fizyczne, chemiczne i strukturalne, a następnie określono ich właściwości biologiczne i wykonano doświadczenia w celu potwierdzenia ich właściwości osteokonduktywnych.
Badania mikroskopowe i spektroskopowe materiałów węglowych impregnowanych związkami krzemu i wapnia wykazały obecności apatytu na powierzchni włókien w kontakcie z symulowanym płynem fizjologicznym. Po dłuższej inkubacji powierzchnie próbek były całkowicie pokryte grubą warstwą apatytową, tworząc stałą kompozycję węglowo-ceramiczną.
Genotoksyczność nanowłókien węglowych oceniano poprzez określenie uszkodzeń DNA; test kometowy na podstawie pomiarów długość ogona i ilości
28 zawartego w nim DNA (T-DNA). Testy te wykazały, że próbki czystych mat węglowych indukują znacznie wyższy poziom uszkodzenia DNA w porównaniu z kontrolą. Jednak po funkcjonalizacji takich mat za pomocą składników ceramicznych badane próbki charakteryzowały się znacznie niższą genotoksycznością , porównywalną z kontrolą. Cytotoksyczność czystych mat węglowych (niemodyfikowanych) określona została na podstawie pomiarów żywotności osteoblastów (linia komórkowa NHOst (normal human osteoblast cells) po 3 i 7 -dniowym kontakcie z komórkami i była wyższa w porównaniu do mat funkcjonalizowanych jak i w porównaniu z próbą kontrolną. Badania in vitro w kontakcie z osteoblastami wykazały, że opracowana metoda modyfikacji mat węglowych prowadzi do uzyskania materiałów biozgodnych.
Testy biologiczne wykazały, że modyfikowane maty węglowe w kontakcie z komórkami osteoblastów były biozgodne, a poziom cytotoksyczności był niższy w porównaniu z kontrolą. Aktywność ALP modyfikowanych nanowłókien była wyższa niż niemodyfikowanych nanowłókien, co wskazywało na potencjalne zastosowania takich biomateriałów jako podłoża do regeneracji tkanki kostnej.
Do podobnych wniosków doprowadziły wyniki badań w doświadczeniach polegających na bezpośredniej 14-dniowej inkubacji próbek węglowych w SBF (Simulated Body Fluid) w temp. 37oC. W tych próbach badania mikroskopowe wykazały tworzenie się gęstego osadu hydroksyapatytowego w obrębie porowatej struktury modyfikowanej maty węglowej. Zatem nanowłókna węglowe poddane odpowiedniej funkcjonalizacji komponentami ceramicznymi mogą być materiałem o właściwościach osteogennych.
Dobra adhezja komórek do powierzchni jest ważnym czynnikiem pod względem dalszych funkcji komórkowych, takich jak proliferacja, wydzielanie i wytwarzanie macierzy pozakomórkowej. Obserwacje mikroskopowe próbek wykazały, że maty węglowe stanowią odpowiednie podłoża dla hodowli komórkowych i są one odpowiednimi strukturami typu 3D. Mają one względnie dużą powierzchnię właściwą i strukturę porów otwartych, osiągając wartość około 80%. Można oczekiwać, że będą one odpowiednie, aby umożliwić adhezję i migrację komórek, przy zachowaniu właściwej morfologii komórki. Optymalna porowatość i wielkość porów struktury podtrzymującej tkanki są ważnymi czynnikami wpływającymi na migrację komórek w materiale. Dodatkowa funkcjonalizacja powierzchni maty węglowej, w której tworzą się grupy silanolowe,
29 wydaje się być skutecznym sposobem na uzyskanie biomateriału, który może aktywować regenerację tkanki kostnej ze względu na obecność krzemu. Krzem odgrywa kluczową rolę w poprawie regeneracji kości i w zwiększeniu gęstości zmineralizowanej tkanki kostnej. Badania biologiczne in vitro uwidoczniły (biozgodność i bioaktywność) próbek węgla w postaci maty różnice między niemodyfikowanymi (wyjściowymi) i modyfikowanymi węglowymi nanowłóknami w formie izotropowych mat. Badania te jednoznacznie wykazały korzystniejsze właściwości zmodyfikowanych nanowłókien.
Jednym z głównych celów modyfikacji powierzchni nanowłókien węglowych było opracowanie aktywnego materiału, który można by wykorzystać do regeneracji tkanki kostno-chrzęstnej, np. w chirurgii szczękowo-twarzowej czy w laryngologii.
Wcześniejsze doniesienia literaturowe, a także wyniki własnych badań z udziałem niektórych autorów omawianej publikacji wskazują, że materiały węglowe, w tym włókna węglowe i nanorurki węglowe, mogą być substratami w hodowlach komórkowych o właściwościach chondrogennych [16, 17]. Zatem zmodyfikowane nanowłókna węglowe w postaci maty węglowej zolem Si/Ca, mogą być odpowiednimi substratami dla tkanki kostno-chrzęstnej, jednakże niezbędne są dalsze badani biologiczne ukierunkowane na wykazanie właściwości chondrogennych opracowanych materiałów.
Rozwój laryngologii, podobnie jak ortopedii czy chirurgii szczękowej jest szczególnie związany z tworzeniem nowych rodzajów implantów wykazujących zarówno właściwości osteogenne jak i chondrogenne. Mikro- i nanowłókna węglowe okazały się mieć potencjał w leczeniu i regeneracji chrząstki. Ten fakt, w połączeniu z możliwością funkcjonalizacji materiału węglowego i kombinacji materiałów wskazuje, że takie włókniste biomateriały mogą być cennym składnikiem do budowy materiałów do terapii medycznej wykorzystującym naturalne mechanizmy regeneracyjne, wspomagane syntetycznymi podłożami.
Literatura:
1. L. Zhang, A. Aboagye, A. Kelkar, C. Lai, and H. Fong, “A review: carbon nanofibers from electrospun polyacrylonitrile and their applications,” Journal of Materials Science, vol. 49, no. 2, pp. 463–480, 2014.
2. L. Ji, Z. Lin, A. J. Medford, and X. Zhang, “Porous carbon nanofibers from electrospun polyacrylonitrile/SiO2 composites as an energy storage material,”
30 Carbon, vol. 47, no. 14, pp. 3346–3354, 2009. [3] L. Qie, W. M. Chen, Z. H.
Wang et al., “Nitrogen-doped porous carbonnanofiber webs as anodes for lithium ion batteries with a superhigh capacity and rate capability,” Advanced Materials, vol. 24, no. 15, pp. 2047–2050, 2012.
3. J.Liu,S.Wang,J.Yangetal.,“ZnCl2 activatedelectrospuncarbon nanofiber for capacitive desalination,” Desalination, vol. 344, pp. 446–453, 2014.
4. M. M. Stevens, “Biomaterials for bone tissue engineering,” Materials Today, vol. 11, no. 5, pp. 18–25, 2008. [6] J.M.HolzwarthaandP.X.Ma,“Biomimetic nanofibrousscaffoldsforbonetissueengineering,”Biomaterials,vol.32,no.36, pp.
9622–9629, 2011.
5. W. J. Lia, R. Tulia, C. Okafora et al., “A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells,”
Biomaterials, vol. 26, no. 6, pp. 599–609, 2005.
6. V. Vamvakaki, K. Tsagaraki, and N. Chaniotakis, “Carbon nanofiber-based glucose biosensor,” Analytical Chemistry, vol. 78, no. 15, pp. 5538–5542, 2006.
7. P. A. Tran, L. Zhang, and T. J. Webster, “Carbon nanofibers and carbon nanotubes in regenerative medicine,” Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 61, no. 12, pp. 1097–1114, 2009.
8. M. Blazewicz, “Carbon materials in the treatment of soft and hard tissue injuries,” European Cells and Materials, vol. 2, pp. 21–29, 2001.
9. I. Rajzer, E. Menaszek, L. Bacakova, M. Rom, and M.
Blazewicz,“Invitroandinvivostudiesonbiocompatibility of carbon fibres,” Journal of Materials Science: Materials in Medicine, vol. 2, no. 9, pp. 2611–2622, 2010.
10. E. Dlugon, W. Simka, A. Fraczek-Szczypta et al., “Carbon nanotubes-based coatings on titanium,” Bulletin of Materials Science, vol. 38, no. 5, pp. 1339–
1344, 2015.
11. A.Neumann and K.Kevenhoerste,“Biomaterials for craniofacial
reconstruction,” GMS Current Topics in Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, vol. 8, pp. 1 –17, 2009.
12. N.Fanous,A.Tournas,V.Coteetal.,“Soft and firm alloplastic implants in rhinoplasty: why, when and how to use them: a review of 311 cases,” Aesthetic Plastic Surgery, vol. 41, no. 2, pp. 397–412, 2017.
31 13. A. Benko, B. Kolecka, M. Nocun, E. Menaszek, and M. Blazewicz, “CNTs alter the biocompatibility of PAN derived CNFs,” Engineering of Biomaterials, vol. 20, no. 143, pp. 71-72, 2017.
14. E. Dlugon, W. Simka, A. Fraczek-Szczypta et al., “Carbon nanotubes-based coatings on titanium,” Bulletin of Materials Science, vol. 38, no. 5, pp. 1339–
1344, 2015.
15. A. Abarrategi, M. C. Gutierrez, C. Moreno-Vicente et al., “Multiwall carbon nanotube scaffolds for tissue engineering purposes,” Biomaterials, vol. 29, no. 1, pp. 94–102, 2008.
4.3.3. Podsumowanie i wnioski
Głównym celem badań przedstawionych w powyższych publikacjach, było opracowanie całkowicie nowych biomateriałów, które mogą znaleźć zastosowanie w medycynie w tym w laryngologii.
Zakres badań przeprowadzony w pierwszej publikacji dotyczył zagadnienia wytwarzania kompozytu z polimeru PEEK i różnych form węgla, w tym nanorurek węglowych, o architekturze przestrzennej (izotropowej i anizotropowej), oceny trwałości kompozytu w warunkach dynamicznych symulującym środowisko biologiczne i wstępnej oceny biozgodności w warunkach in vitro. Przeprowadzone testy pozwoliły określić możliwość wykorzystania kombinacji różnych składników węglowych i polimeru PEEK pod kątem wytwarzania protezy głosowej i także biozgodności zastosowanego materiału w warunkach in vitro. Szczególnie interesującym i oryginalnym osiągnięciem doświadczeń prowadzonych w ramach zespołu było wykazaniem pozytywnego działania komponentu węglowego w postaci nanorurek węglowych wprowadzonych do matrycy polimerowej. Nanorurki poprawiały wyraźnie jednorodność materiałów kompozytowych. Można oczekiwać, że dzięki obecności nanorurek węglowych i także komponentu węglowego w formie włókien takie kompozycje będą wykazywały właściwości bakteriostatyczne, co będzie przedmiotem dalszych badań.
Druga z omawianych publikacji opisuje sposób wytworzenia materiału węglowego składającego się z nanowłókien węglowych, po odpowiedniej funkcjonalizacji chemicznej w aspekcie potencjalnego zastosowania na podłoża w procesach regeneracyjnych tkanek, a także jako potencjalne materiały elektrodowe
