R O C ZN IK I G LEB O ZN A W C ZE T. XLIV NR 1/2 W A R SZA W A 1993: 37-45
GRAŻYNA DURSKA, HENRYK KASZUBIAK
W Y K ORZYSTY W A NIE W GLEBIE A LIFATYCZNYCH NISK O CZĄ STECZK O W Y CH KW ASÓW ORGANICZNYCH
PRZEZ DROBNOUSTROJE
Katedra Mikrobiologii Rolnej Akademii Rolniczej w Poznaniu
W ST ĘP
Wiadomo [10] o występowaniu w glebie alifatycznych, niskocząsteczko- wych kwasów organicznych, przeważnie mono- i trójkarboksylowych. Kwasy te dostają się do gleby w dużych ilościach z materiałem roślinnym lub jako metabolity niektórych drobnoustrojów, ale przeważnie znajduje się je w nie wielkich ilościach. Szybko wła6czane są bowiem w obieg materii organicznej jako łatwo przyswajalne przez drobnoustroje. W badaniach prowadzonych z drobnoustrojami rosnatcymi w czystych kulturach stwierdzono, że przyswajal- ność ta może być nawet lepsza od przyswajalności glukozy [7], ale w dużym stopniu zależy od gatunku, a nawet szczepu drobnoustroju [1].
Powstaje zatem pytanie, jakie zmiany ilościowe i jakościowe wywołują omawiane kwasy w glebowym zespole drobnoustrojów. Dla wyjaśnienia tego zagadnienia przeprowadzono doświadczenia z glebą inkubowaną z dodatkiem tych kwasów, a uzyskane wyniki przedstawiono w niniejszej pracy.
M A T E R IA Ł Y I M ETO D Y
Badania przeprowadzono z gliną lekką, silnie spiaszczoną, pylastą, za w ierającą 25% frakcji pyłów, 22% frakcji ilastej oraz 1,7% С organicznego, o pH w H20-7,6 w warstwie ornej, spod uprawy żyta w Kombinacie Pań stwowych Gospodarstw Ogrodniczych - Poznań - Naramowice. Glebę prze siewano przez sito (ф 2 mm) i inkubowano wstępnie przez 3 tygodnie w temperaturze pokojowej aż do czasu inkubacji z dodatkiem kwasów orga nicznych, co miało na celu doprowadzenie w glebie zespołu drobnoustrojów do stanu biologicznego zrównoważenia. Glebę przeznaczoną do inkubacji w warunkach beztlenowych silnie ubijano.
Z gleby inkubowanej wstępnie sporządzano 50-gramowe naważki, nawil żano je do 50% pełnej pojemności wodnej i dodawano do nich poszczególne kwasy: masłowy, mlekowy, propionowy, octowy, szczawiooctowy, burszty nowy, fumarowy lub jabłkowy, w dawkach odpowiadających 500 meg С g"1
s.m. gleby. Oprócz kwasu dodawano też NH4NO3 w takich ilościach, aby stosunek wagowy С kwasu organicznego do N-NH4NO3 wynosił 30:1. Kon trolę stanowiły próby bez dodatku kwasów organiczirych. Tak przygotowane próby umieszczano w naczyniach o pojemności 50 cm . Dla każdej kombinacji doświadczalnej przeznaczano w każdym terminie analiz po 2 próby. Próby przeznaczone do inkubacji bez dostępu tlenu ponownie silnie ubijano. Warunki beztlenowe uzyskiwano za pomocą pyrogalolu i kontrolowano przy zastoso waniu mieszaniny roztworów glukozy, błękitu metylenowego i NaOH jako wskaźnika beztlenowości.
Wszystkie próby (kontrolne i z dodatkiem kwasów) inkubowano w temp. 24 °C, przy zachowaniu wilgotności gleby odpowiadającej 50% pełnej poje mności wodnej. Po 3, 7, 14 i 28 dniach inkubacji określano w nich liczebności bakterii i grzybów, liczebności prototroficznych bakterii i grzybów wykorzy stujących kwasy organiczne jako jedyne źródło węgla, biomasę bakterii i aktywność oddechową gleby.
Ponadto z inkubowanych prób glebowych wyodrębniano szczepy bakterii lub grzybów wykorzystujących kwasy organiczne, u których szczegółowo określano zapotrzebowanie pokarmowe lub przynależność taksonomiczną.
Liczebność bakterii tlenowych określano metodą płytkową przy zastosowa niu agaryzowanej pożywki YS [8] z ekstraktem glebowym i drożdżowym jako źródłem węgla i azotu. Liczebność bakterii beztlenowych określano na podsta wie miana, stosując płynną pożywkę YS z warstwą parafiny na powierzchni. Liczebność grzybów określano metodą płytkową według Warcupa, zmodyfi kowaną przez Mańkę [9], stosując pożywkę według Martina w modyfikacji Johnsona [2]. Bakterie tlenowe liczono wyłącznie w glebie inkubowanej z dostępem tlenu, a bakterie beztlenowe w glebie bez jego dostępu.
Liczebności prototroficznych bakterii i grzybów wykorzystujących kwasy organiczne jako jedyne źródło węgla określano stosując pożywkę według West i Lochhead [ 12], zmodyfikowaną przez zastąpienie glukozy ekwiwalentną pod względem zawartości węgla dawką kwasu organicznego. W przypadku ozna czania liczebności prototroficznych grzybów do pożywki dodawano aureomy- cyny i różu bengalskiego, tak jak do pożywki Martina.
Wyodrębniania szczepów bakterii i grzybów wykorzystujących kwasy or ganiczne w celu określenia ich zapotrzebowania pokarmowego i przynależno ści systematycznej, dokonywano z prób glebowych z dodatkiem tych kwasów, w okresie najsilniejszego wzrostu drobnoustrojów, tj. po siedmiu dniach inku bacji. Wyodrębnione szczepy hodowano w czystych kulturach. Zapotrzebowa nie pokarmowe szczepów określano wyróżniając grupy pokarmowe według West i Lochhead [12].
Wykorzystywanie kwasów organicznych przez drobnoustroje 30
Biomasę bakterii obliczano na podstawie liczebności w glebie komórek bakterii określonej pod mikroskopem fluoroscencyjnym [4] przy użyciu oranżu akrydynowego jako fluorochromu [11].
Aktywność oddechową gleby określano w specjalnie do tego celu inkubo- wanych jednokilogramowych próbach glebowych, stosując metodę sorpcyjną z 0,1 n NaOH [3].
OMÓWIENIE WYNIKÓW
Ze względu na obszerność materiału dokumentacyjnego nie przedstawiono w pracy większości danych liczbowych uzyskanych w poszczególnych termi nach analiz, lecz tylko wartości przeciętne z całego okresu badań.
Ponieważ odczyn gleby nie zmieniał się po dodaniu kwasów organicznych, można przyjąć, że kwasy te oddziaływały na drobnoustroje przede wszystkim jako źródło pokarmu.
Tabela 1 Liczebność bakterii ( 106 • g*1 s.m.) i grzybów (103 • g'1 s.m.) w glebie kontrolnej
i w glebie z dodatkiem kwasów organicznych
Numbers of bacteria ( 106 • g"1 d. m.) and fungi (103 • g'1 d. m.) in control soil and in soil with organic acids added *
Dodany kwas organiczny Bakterie - Bacteria
Grzyby Fungi Organic acid added
tlenowe aerobes beztelenowe anaerobes Kontrola - Control 26 13 25 Kwas masło wy Butyric acid 162 36 25 Kwas mlekowy Lactic acid 361 38 24 Kwas propionowy Propionic acid 36 72 46 Kwas octowy Acetic acid 38 58 38 Kwas szczawiooctowy Oxalacetic acid 35 31 26 Kwas bursztynowy Succinic acid 39 46 23 Kwas fumarowy
Fuma ric acid 42 26 27
Kwas jabłkowy
Malic acid 36 53 28
Wartości przeciętne dla 28-dniowego okresu badań Average values for 28 days experimental period
Dane przedstawione w tabelach 1-3, uzyskane w wyniku posiewów zawie siny glebowej, ilustrują zmiany w liczebności bakterii i grzybów zachodzące pod wpływem omawianych kwasów. Posiewy na pożywkę z wyciągiem gle bowym i ekstraktem drożdżowym wykazały (tab. 1), że każdy z kwasów zwiększał wyraźnie liczebność bakterii, niekiedy o kilkaset procent. Bakterie tlenowe namnażały się najsilniej pod wpływem kwasu masłowego lub mleko wego, a bakterie beztlenowe pod wpływem kwasu propionowego lub octowe go.
Tabela 2 Liczebność prototroficznych bakterii ( 106 • g'1 s.m.) oraz grzybów ( 1 0 3 • g '1 s.m.) wykorzystujących w ho
dowlach kwasy organiczne jako jedyne źródło węgla, określona w glebie bezpośrednio przed dodatkiem do mej tych kwasów
Numbers of prototrophic bacteria ( 106 • g" d. m.) and fungi ( 1 0 3 • g 1 d. m.) utilizing in cultures organic acids as a sole source of С determined in soil, immediately before its treatment with these acids
Wykorzystywane kwasy organiczne Bakterie - Bacteria
(irzyby Fungi Utilized organie acids
tlenowce aerobes beztelenowce anaerobes Kwas masłowy 3,8 1,0 8,4 Butyric acid Kwas propionowy Propionic acid 5,5 0,2 3,3 Kwas octowy Acetic acid 9,1 0.2 5.3 Kwas szczawiooctowy Oxalacetic acid 24,2 12.3 11.4 Kwas bursztynowy Succinic acid 9,3 3,6 5.6 Kwas fumarowy Fumaric acid 15,5 3.1 5.6 Kwas jabłkowy Malic acid 6,1 9.4 6,0
Notowane zwiększanie się liczebności było w znacznym stopniu spowodo wane rozwojem prototroficznych bakterii wykorzystujących kwasy organiczne
jako jedyne źródło węgla. Bakterie te były liczne nawet w glebie bez dodatku kwasu (tab.2), w której ich liczebność była zwykle rzędu 106, a nawet 10 komórek w lg s.m., a tylko w glebie inkubowanej beztlenowo liczebności bakterii wykorzystujących kwas masłowy, propionowy lub octowy były rzędu 10^ komórek w lg s.m. Przy dodatku do gleby kwasów organicznych liczeb ność omawianych bakterii protroficznych zwiększała się w podobnym stopniu jak liczebność bakterii określana przy zastosowaniu pożywki z wyciągiem glebowym i ekstraktem drożdżowym (tab.3). Liczebność tlenowych bakterii prototroficznych zwiększała się najsilniej również przy dodaniu do gleby
Wykorzystywanie kwasów organicznych przez drobnoustroje 41
kwasu masłowego i mlekowego, a liczebność beztlenowych bakterii prototro ficznych przy dodatku kwasu propionowego lub octowego.
Tabela 3 Liczebność prototroficznych bakterii ( 106 • g’1 s.m.) oraz grzybów (103 • g'1 s.m.)
wykorzystujących w hodowlach kwasy organiczne jako jedyne źródło węgla, określona w glebie z dodatki en tych kwasów w stosunku procentowym do liczebności
tych drobnoustrojów określonej w glebie kontrolnej *
Numbers of prototrophic bacteria ( 106 • g l dry m.) and fungi (103 • g-1 dry m.) utilizing in cultures organic acids as a sole source of С determined in soil with these acids added in percentage relation to number determi
ned in control soil * Dadany kwas organiczny Bakteria - Bacteria
Organic acid added Grzyby
tlenowce beztelenowce Fungi
aerobes anaerobes Kwas masłowy Butyric acid 540 340 120 Kwas mlekowy Lactic acid 470 230 100 Kwas propionowy Propionic acid 130 640 200 Kwas octowy Acetic acid 140 490 1СЮ
Kwas szcza wio octowy
Oxalacetic acid 130 190 110 Kwas bursztynowy Succinic acid 130 310 120 Kwas fumarowy Fumaric acid 150 470 100 Kwas jabłkowy Malic acid 150 130 1СЮ
Wartości przeciętne dla 28-dniowego okresu badań Average values for 28 days experimental period
W porównaniu z bakteriami prototroficznymi, bakterie auksotroficzne były nieliczne. Wykazano to, badając zapotrzebowanie pokarmowe szczepów w y odrębnionych z prób glebowych inkubowanych w warunkach tlenowych z czterema różnymi kwasami przy zastosowaniu pożywki z wyciągiem glebo wym i ekstraktem drożdżowym. Żaden spośród 25 izolatów zdolnych do wykorzystywania kwasu mlekowego nie byłauksotrofem. Na taką samą liczbę izolatów wykorzystujących kwas masłowy lub bursztynowy przypadały odpo wiednio 1 lub 3 auksotrofy. Jedynie w przypadku kwasu propionowego znaj dowano 10 auksotrofów wśród 25 szczepów. Wszystkie auksotrofy wymagały do wzrostu wyciągu glebowego, niezależnie od rodzaju wykorzystywanego kwasu.
Badania taksonomiczne wykazały, że w glebie inkubowanej z kwasami organicznymi promieniowce były nieliczne wśród drobnoustrojów odżywiają cych się prototroficznie tymi kwasami. Żaden spośród stu przebadanych szcze pów wykorzystujących kwas mlekowy nie był promieniowcem. Promieniowce stanowiły tylko kilka procent szczepów wykorzystujących pozostałe 7 kwa sów.
Prototroficzne bakterie wykorzystujące kwasy organiczne należały przede wszystkim do rodzajów Pseudomonas,, Micrococcus i Arlhrobacter. Kwas propionowy mógł być przyswajany przez przedstawiciel i tych trzech rodzajów. Kwas mlekowy przyswajały jedynie bakterie z rodzaju Pseudomonas, a kwas masłowy, octowy, szczawiooctowy, fumarowy lub jabłkowy - głównie bakterie z rodzaju Arlhrobacter.
Posiewy zawiesiny glebowej na pożywkę według Martina wykazały (tab. 1), że w przeciwieństwie do bakterii, liczebność grzybów w glebie zwiększała się wyraźnie tylko wtedy, gdy wprowadzono do niej kwas propionowy lub octowy. Przyrosty te tylko w przypadku kwasu propionowego były związane z silnym namnażaniem się grzybów zdolnych do wykorzystywania wprowadzonego do gleby kwasu jako jedynego źródła węgla (tab.3). Być może, w obecności kwasu octowego namnażały się głównie grzyby auksotroficzne.
Chociaż prototroficzne grzyby wykorzystujące kwasy organiczne przeważ nie nie namnażały się po dodatku tych kwasów do gleby, to jednak w tym środowisku były dość liczne. Ich liczebność w 1 g s.m. gleby była co najmniej rzędu 1()3. Należały one do różnych gatunków. Przeważnie każdy gatunek zdolny był do wykorzystywania innego kwasu. Kwas masłowy mogły wyko rzystywać głównie szczepy Nectria inventa Pethybr. i Cylindrocarpon magna- sianum /Sacc./ Wollenw., kwas mlekowy - Pénicillium notatum Westling i Pénicillium nalgiovensis Laxa, kwas propionowy - Humiccola fuscatra Tra- aen., kwas octowy -Actinomucor elegans /Е\&лш/G.R. Beniamin i Hessesltine, kwas fumarowy - Poecilomyces marąuandii /Massee/ Hughes i Trichoderma harzianum Riffai aggr., a kwas bursztynowy - Trichoderma harzianum Riffai aggr., Acremonium persicinum /Nicot/ W,Gams comb.nov. i Coniothyricum fucketli /Sacchardo/.
Aktywność oddechowa gleby nasilała się pod wpływem każdego wprowa dzonego do niej kwasu (tab.4) i zależała istotnie od rodzaju kwasu. Najsilniej wzrastała pod wpływem dodatku kwasów propionowego lub octowego, które przyczyniały się do namnożenia nie tylko bakterii, lecz i grzybów.
Z danych liczbowych nie zamieszczonych w pracy wynika, że przyrosty biomasy bakterii w glebie inkubowanej w warunkach tlenowych występowały zwykle tylko po siedmiu dniach od dodania do niej kwasów i były najwyżej rzędu 40%. Wyniki przedstawione w tabeli 4 wskazują, że te okresowe przy rosty nie wpływały znacząco na przeciętną dla całego okresu badań wielkość biomasy. Natomiast przeciętne te dla gleby inkubowanej w warunkach beztle nowych wzrastały po dodatku kwasów. Niemniej w warunkach beztlenowych biomasa bakterii zwiększała się, podobnie jak w warunkach tlenowych, tylko okresowo, choć znacznie silniej, niekiedy o 140%.
Wykorzystywanie kwasów organicznych przez drobnoustroje 43
Tabela 4 Aktywność oddechowa gleby (mg С-СО2 • kg*1 s.m. • 24 h'1) oraz biomasa
bakterii (mg • g’1 s.m.) w glebie kontrolnej i w elebie z dodatkiem kwasów organicznych* Activity of soil respiration (mg С-СО2 • kg* dry m. • 24 h*1) and bacterial biomass
(mg • g“1 dry m.) in control soil and in soil with organic acides added * Aktywność oddechowa Biomasa bakterii
Respiration activity Bacterial biomass Dodany kwas organiczny
Organic acid added Warunki inkubacji gleby - Conditions of soil incubation
tlenowce tlenowce beztelenowce
aerobes aerobes anaerobes
Kontrola - Control 3,4 0,76 0,79
Kwas masłowy -B u tyric acid 5,6 0,81 0,87
Kwas mlekowy - Lactic acid 5,2 0,82 1,04
Kwas propionowy - Propionic acid 6,4 0,83 0,87
Kwas octowy -A ce tic acid 6,3 0,82 0,92
Kwas szczawiooctowy - Oxalacetic acid 4,0 0,85 1,15
Kwas bursztynowy -Succinic acid 3,7 0,86 0,96
Kwas fumarowy - Fumaric acid 3,5 0,82 1,10
Kwas jabłkowy - Malic acid 4,0 0,87 1,02
* Wartości przeciętne dla 28-dniowego okresu badań Average values for 28 days experimental period
DYSK USJA I PODSUM OW ANIE
Metodami hodowlanymi stwierdzono, że alifatyczne niskocząsteczkowe kwasy organiczne przyczyniają się do namnożenia w glebie przede wszystkim bakterii, gdyż liczebność grzybów wzrastała wyraźnie tylko pod wpływem niektórych kwasów. Pomiary wydzielanego z gleby CO2 wykazały, że kwasy organiczne powodują również nasilenie ogólnej aktywności biochemicznej drobnoustrojów.
Traktując w tej pracy wprowadzone do gleby kwasy jako metabolity drob noustrojów, można, uogólniając, sprowadzić wyniki do powszechnie uznawa nego poglądu głoszącego, że w glebowym zespole drobnoustrojów produkty przemiany materii jednych organizmów są dla innych źródłem energii i budul ca. Jest to przeciwstawne do hodowli drobnoustrojów w czystych kulturach. Nagromadzają się w nich bowiem metabolity, często w stężeniach toksycz nych, hamujących syntezę biomasy, mimo dostępnych substratów. Teoretycz nie wydajność syntezy biomasy drobnoustrojów' w glebie.powinna być więc większa niż w hodowlach. Jednak obserwacje mikroskopowe gleby nie wyka- zały w niej istotnych przyrostów ogólnej biomasy bakterii. Rozbieżność tę tłumaczyć można tym, że na kwasy organiczne reagowały przede wszystkim bakterie zymogenne jako silnie reagujące na dopływ świeżego pokarmu, łatwo
rosnące na pożywkach. Glebowy zespół drobnoustrojów złożony jest natomiast głównie z form autochtonicznych o oligotroficznej naturze [5, 6].
W ig s.m. gleby liczebność bakterii określana metodą bezpośrednią dla pomiarów ich biomasy była zarówno w kombinacji kontrolnej, jak z dodatkiem kwasu organicznego rzędu 10g lub 1010. Natomiast liczebność bakterii w lg s.m. gleby określana metodą hodowlaną była w glebie z dodatkiem większości kwasów organicznych tylko rzędu 107, tak jak w glebie kontrolnej, a jedynie w glebie z dodatkiem niektórych kwasów rzędu 108. Wykorzystywanie przez bakterie zymogenne kwasów organicznych nie dostarczało zatem substratów budulcowych w ilościach wystarczających do istotnego zwiększenia się bio masy całego zespołu bakterii.
LITERATURA
[ 1 ] Antoun H., 1984: Utilization of the tricarboxylic acid cycle intermediates and sym biotic effecti veness in Rhizobium meliloti. Plant and Soil 77: 29.
[2] Johnson L.F.,1957:Effect of antibiotics on the numbers of bacteria and fungi isolated from soil by the dilution method. Phytopatology 47: 630.
[3] Kaczm arek W .,Kaszubiak H.,Guzek H.,1973:Comparison of changes in the number of microorganism s in the soil by the plate and microscopic procedure. Pol. J. Soil Sei. 6:133. [4] K aszubiak H.tKaczm arek W .,1976:Ocena współcześnie stosowanych metod oznaczania li
czebności, biomasy i produktywności drobnoustrojów w glebie. Pr. Kom. Nauk. PTG, 3/18:1. [5] K aszubiak H., Kaczm arek W .,1983:Differentiation of bacterial biomass in croplands and
grasslands. Intccol. Bull. 12:29.
[61 Kaszubiak H .,Muszyńska M. 1993: Occurrence of obligatorily oligotrophic bacteria in soil. Zbl. Mikrobiol.147: 143.
[7] Kune F., 1971:Effect of glucose on decomposition of vanillin by soil microorganisms. Folia Microbiol., 16: 51.
[8] Lochhead A .G., Chase E.F., 1943:Qualitative studies of soil microorganisms. V. Nutritional requirem ents of the prédominai bacterial flora. Soil Sci.55: 185.
[9] Mańka K.,1964:Próby dalszego udoskonalenia metody Warcupa izolowania grzybów z gleby. Pr. Kom. Nauk Roi. i Kom. Nauk Leś.17/1: 1.
[10] Stevenson F.J.,1967:O rganicacids in soil. Soil Biochem istry.Mc Laren E.D .ed. Marcel Dekker Inc.,New York: 119.
[11] Strugger S., 1948:Fluorescence microscopic examination of bacteria in soil. Can. J. Res.C.25: 188.
[12] W est P.M., Lochhead A.G.,1940:Qualitative studies of soil microorganisms. IV. The rhizosp- here in relation to the nutritive requirements of soil bacteria. Can J. Res. C.18: 129.
Wykorzystywanie kwasów organicznych przez drobnoustroje 45
G. DURSKA, H. KASZUBI AK
UTILIZATION OF ALIPHATIC LOW - MOLECULAR ORGANIC ACIDS IN SOIL BY MICROORGANISMS
Department of Microbiology, Agricultural University of Poznań
Sum m ary
A light clay was incubated with an addition of the butyric, lactic, propionic, acetic, oxalacetic, succinic, fumaric or malic acids. Each of the acids intensified the soil respira tion. Also, they increased distinctly the number of bacteria, mainly due to multiplication of the prototrophic forms utilizing the acids as a sole organic carbon source. Among these prototrophs bacteria dominated from Pseudomonas, Micrococcus and Arthrobacter gene ra. However, the observed increases in bacteria number determined by means of the culture methods were to be insufficient to increase the total bacterial biomass to a significant degree. Fungi were multiplying only under the influence of propionic or acetic acids, although many of them were potentially able to utilize various organic acids.
Pracę złożono w redakcji w lipcu 1991 roku D r Grażyna Durska,
Katedra Mikrobiologii Rolnej Akademia Rolnicza w Poznaniu 60-637 Poznań, Wołyńska 35
