Samodzielna Pracownia Diagnostyki i Immunologii Nowotworów
I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
Kierownik Pracowni: Prof. dr hab. n. med. Iwona Wertel ul. Chodźki 4a, 20-093 Lublin
Lublin, 04.05.2021 r.
Ocena rozprawy doktorskiej mgr Marty Smycz-Kubańskiej pt. „Udział wybranych chemokin w patogenezie endometriozy”
wykonanej pod kierunkiem
promotora Prof. dr hab. n. med. Zdzisławy Kondera-Anasz oraz promotora pomocniczego dr hab. n. med. Justyny Sikory
w Katedrze i Zakładzie Immunologii i Serologii Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
Przedmiotem badań Doktorantki była ocena stężenia wybranych chemokin (MCP 1-4, MIP-1α i MIP-1β, eotaksyny-2 i eotaksyny-3, fraktalkiny oraz ENA-78) w płynie otrzewnowym (PF) kobiet z endometriozą (EMS) w porównaniu do pacjentek, u których w trakcie zabiegu laparoskopowego nie stwierdzono EMS czy innych zmian patologicznych w obrębie miednicy mniejszej.
Endometrioza jest jedną z najczęściej występujących chorób narządu rodnego oraz narządów jamy otrzewnej u kobiet w wieku rozrodczym. Pomimo intensywnych badań i postępu wiedzy, patogeneza tego schorzenia jest nadal słabo poznana.
Wspólnym elementem licznych hipotez próbujących wyjaśnić przyczynę EMS jest obserwacja powszechnego występowania miesiączkowania wstecznego, które indukuje subkliniczny nieinfekcyjny proces zapalny w obrębie jamy otrzewnowej. Konsekwencją stanu zapalnego w obrębie miednicy mniejszej są nie tylko dolegliwości bólowe ale też powstawanie zrostów, a w efekcie niedrożność i upośledzona funkcja jajowodów, co prowadzi do niepłodności. Czynniki, które ułatwiają przemieszczanie i wszczepianie się
komórek endometrium poza jamą macicy pozostają niepoznane i są przedmiotem badań naukowców na całym świecie. Najnowsze badania wskazują na zaburzenia w ilości i aktywności komórek układu immunologicznego oraz wydzielanych przez nie czynników wzrostu, czynników pro-angiogennych, immunosupresyjnych w rozwoju i progresji EMS. Istotne znaczenie w indukcji stanu zapalnego odgrywają rozpuszczalne mediatory (cytokiny, chemokiny). Szczególnie ważne są chemokiny, które regulują migrację komórek układu immunologicznego do miejsc objętych procesem zapalnym.
Należy podkreślić, iż rola chemokin w opisanym zjawisku i patogenezie EMS nie została dotychczas jednoznacznie zdefiniowana. Ciągle też poszukuje się markerów odpowiedzialnych za rozwój endometriozy i związane z nią problemy niepłodności.
W opisane trendy badawcze wkomponowuje się przedstawiona mi do oceny rozprawa pt. „Udział wybranych chemokin w patogenezie endometriozy”.
Wybór tematu badawczego oraz sposób weryfikacji hipotezy badawczej uważam za interesujący i celowy.
Przedstawiona do recenzji praca ma układ typowy dla prac eksperymentalnych i zawiera: wykaz skrótów, wstęp, założenia i cel pracy, materiał i metody, wyniki, dyskusję, wnioski, piśmiennictwo, oraz streszczenie w języku polskim i angielskim.
We wstępie zawartym na 20 stronach maszynopisu Autorka dokonała przeglądu aktualnego stanu wiedzy dotyczącego problematyki badań. Opisała aktualne klasyfikacje endometriozy oraz najważniejsze teorie próbujące wyjaśnić jej przyczynę.
Ponadto scharakteryzowała rolę chemokin i mechanizmy przez które mogą one przyczyniać się do patogenezy EMS. Podkreślić należy adekwatny wybór cytowanych prac. Piśmiennictwo dotyczące patogenezy endometriozy jest obszerne i wyselekcjonowanie prac wartościowych świadczy o bardzo dobrej znajomości tematyki oraz krytycznym podejściu do cytowanych wyników. Wstęp ilustrowany jest 8-oma rycinami. Umieszczono w nim również 2 tabele, które ułatwiają zrozumienie zaprezentowanych zagadnień.
Jedyna moja uwaga odnośnie wstępu dotyczy użycia skrótu „ENZIAN” (str. 15), który nie jest wyjaśniony. Czytelnik, o ile nie jest dobrze wprowadzony w tematykę, może nie wiedzieć z czym ma do czynienia.
W rozdziale Cel Pracy Doktorantka jasno sformułowała trzy cele badań.
Pierwszy obejmował ocenę stężenia wybranych chemokin (MCP 1-4, MIP-1α i MIP- 1β, eotaksyny-2 i eotaksyny-3, fraktalkiny oraz ENA-78) w płynie otrzewnowym (PF) kobiet z endometriozą. Następnie ustalenie, jak kształtuje się stężenie wybranych chemokin w zależności od stopnia zaawansowania EMS. Trzecim celem była próba odpowiedzi na pytanie, czy badane chemokiny mogą być pomocne w diagnostyce EMS?
Badaniami objęto grupę 58 pacjentek, u których w trakcie laparoskopii potwierdzono lub rozpoznano endometriozę. Grupę referencyjną stanowiło 20 kobiet, u których w trakcie zabiegu laparoskopowego nie stwierdzono EMS czy innych zmian patologicznych w obrębie miednicy mniejszej. Materiałem badanym był PF pobrany w trakcie operacji, który następnie odwirowano, a otrzymany supernatant przechowywano w temperaturze -80°C do czasu oceny stężenia zaplanowanych chemokin.
W tej części pracy, w opisie grupy badanej zabrakło mi definicji niepłodności pierwotnej, którą uwzględniono jako kryterium włączenia pacjentek do grupy badanej.
W przeprowadzonych badaniach do oceny stężenia chemokin Doktorantka wykorzystała Luminex Magpix Multiplex System firmy Merck KGaA Darmstadt, Germany. W badaniach wykorzystano komercyjne zestawy dedykowane do oceny 10-ciu zaplanowanych chemokin. Metodyka badań wykonana zgodnie z procedurą producenta i przedstawiona drobiazgowo nie budzi wątpliwości. Zawarte w opisie metody informacje umożliwiają powtórzenie badań.
Wyniki badań zostały poddane analizie statystycznej przy użyciu programu Statistica 12.0 oraz Microsoft Excel, z wykorzystaniem testów W Shapiro–Wilka do określenia rozkładu zmiennych oraz testu jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA z zastosowaniem testu porównań wielokrotnych post-hoc Fishera i Scheffera oraz testu korelacji Rang Spearmana. Wyniki przedstawiono w postaci opisowej, oraz 26 tabel i aż 37 rycin.
W rozdziale IV (WYNIKI, str. 39) Autorka niepotrzebnie powtarza jaki był cel pracy oraz jakie parametry obliczono w programie Statistica. Informacje te są powtórzeniem informacji podanych w rozdziale 2.2. (Analiza statystyczna, str.38).
Uwagę recenzenta zwrócił fakt, że wyniki przedstawione w tabelach są powtórzeniem danych zawartych w ich opisie i na rycinach. Ponadto, dane przedstawione na wykresach powinny być ujednolicone. Na niektórych wykresach/rycinach Autorka podaje wartość „p” po przecinku (np. p<0,0001, na większości rycin), a na innych rycinach jest kropka (p<0.05). Czasami wartość „p”
pisana jest małą literą, a innym razem „P” pisane dużą literą (Rycina 14, str.46, Rycina 15, str.48).
Wyniki badań przedstawiają porównanie stężenia 10-ciu ocenionych chemokin w PF w grupie pacjentek z EMS w odniesieniu do ich stężenia w grupie referencyjnej.
Ponadto zaprezentowano jak kształtuje się stężenie każdej chemokiny w poszczególnych stopniach zaawansowania EMS wg klasyfikacji ASRM, z uwzględnieniem stopni I-IV, oraz podziału na EMS wczesną (stopień I-II) oraz późną (stopień III-IV).
Do tej części dysertacji mam uwagi, które dotyczą niezgodności wyników podanych w niektórych tabelach i odpowiadających im wykresach, przedstawiających stężenia ocenionych chemokin w poszczególnych stopniach zaawansowania endometriozy. Niezgodności te dotyczą Rycin: 9,11,15,16, 24, 26, 31, 32, 33,34, 38, 39, 40 oraz 42.
-str. 40, Rycina 9, stopień III endometriozy-wartość min przedstawiona w tabeli V wynosi 25,98 pg/ml a na rycinie powyżej 30 pg/ml
-str. 43, Rycina 11, przedstawione na tej rycinie wyniki są zupełnie odmienne niż podane w tabeli VII, a dotyczą oceny stężenia MCP-2 w PF u tych samych pacjentek -str. 48, Rycina 15, I-y stopień endometriozy- wartość max przedstawiona w tabeli XI wynosi 37,10 pg/ml a na rycinie poniżej 32 pg/ml
-str. 49, Rycina 16, wczesny stopień endometriozy- wartość min. przedstawiona w tabeli XI wynosi 11,37 pg/ml, max. 37,10 pg/ml a na rycinie 16 min. powyżej 12 pg/ml a max. 26 pg/ml
-str. 58, Rycina 24, endometrioza późna, wartość max przedstawiona w tabeli XV wynosi 97,42 pg/ml a na rycinie 24 powyżej 70 pg/ml
-str. 60, Rycina 26, endometrioza późna, wartość max przedstawiona w tabeli XVII wynosi 48,55 pg/ml a na rycinie 26 powyżej 20 pg/ml
-str. 64, Rycina 31, I-y stopień endometriozy- wartość max przedstawiona w tabeli XXI
-str. 65, Rycina 32, endometrioza późna, wartość max przedstawiona w tabeli XXI wynosi 1432,98 pg/ml a na rycinie 26- poniżej 1200 pg/ml
-str. 67, Rycina 33, II-gi stopień endometriozy- wartość max przedstawiona w tabeli XXIII wynosi 43,94 pg/ml a na rycinie 33 poniżej 30 pg/ml
-str. 67, Rycina 33, III-i stopień endometriozy- wartość min przedstawiona w tabeli XXIII wynosi 20,81 pg/ml a na rycinie 33 powyżej 28 pg/ml
-str. 68, Rycina 34, endometrioza wczesna- wartość max przedstawiona w tabeli XXIII wynosi 43,94 pg/ml a na rycinie 34 wynosi 36 pg/ml
-str. 68, Rycina 34, endometrioza późna- wartość min przedstawiona w tabeli XXIII wynosi 20,81 pg/ml a na rycinie 34 wynosi powyżej 28 pg/ml
-str. 72, Rycina 38, II-i stopień endometriozy- wartość max przedstawiona w tabeli XXVII wynosi 86,42 pg/ml a na rycinie 38 powyżej 55 pg/ml
- str. 72, Rycina 38, w III stopniu EMS przedstawione wartości min i max są inne niż w tabeli XXVII
-str. 73, Rycina 39, endometrioza wczesna- wartość max przedstawiona w tabeli XXVII wynosi 86,42 pg/ml a na rycinie 39- powyżej 50 pg/ml
-str. 73, Rycina 39, endometrioza późna- wartość max przedstawiona w tabeli XXVII wynosi 95,16 pg/ml a na rycinie 39 powyżej 60 pg/ml
-str. 75, Rycina 40, stężenie fraktalkiny w PF, III stopień endometriozy, wartość max przedstawiona w tabeli XXIX wynosi 8658,74 pg/ml a na rycinie 40 poniżej 8000 pg/ml
Na str. 77, Rycina 42 Autorka umieściła wykres zbiorczy przedstawiający stężenia ocenionych chemokin w grupie badanej i referencyjnej. W przypadku MCP-2 mediana w grupie pacjentek z endometriozą wynosi 456,38 pg/ml (tabela VI, str. 42) zaś na wykresie jest wartość 550 pg/ml. W przypadku eotaksyny-2, mediana w grupie pacjentek z endometriozą wynosi 902,60 pg/ml (tabela XX, str. 64) zaś na wykresie jest wartość około 600 pg/ml
Proszę o wyjaśnienie skąd wynikają te różnice?
Na st. 51 Autorka wprowadza określenie grupy kontrolnej w opisie wyników.
Zazwyczaj grupę kontrolną stanowią osoby zdrowe, bez objawów klinicznych choroby, a takiej grupy w badaniach nie było.
W przeprowadzonych badaniach Doktorantka wykazała obecność wszystkich 10-ciu ocenionych chemokin w płynie otrzewnowym zarówno u kobiet z endometriozą, jak też w grupie referencyjnej. Stężenie chemokiny MIP-1 alfa było nieznacznie niższe u kobiet z EMS. Interesujące jest odnotowanie istotnych różnic w stężeniu ocenionych chemokin w porównywanych grupach. Doktorantka wykazała znamiennie niższe stężenie MCP-1, 2,3,4 oraz fraktalkiny u chorych na EMS w porównaniu do grupy referencyjnej. Ciekawą obserwacją było wykazanie istotnie wyższego stężenia eotaksyny 2,3 oraz ENA78 u kobiet z EMS w odniesieniu do grupy referencyjnej.
Ponadto wykazano nieznaczny wzrost stężenia chemokiny MIP-1 beta u chorych na EMS. Wykazane różnice w koncentracji ocenionych chemokin w płynie otrzewnowym kobiet z endometriozą świadczą o odmiennym ich udziale w nasileniu stanu zapalnego w obrębie jamy otrzewnowej w obu badanych grupach. Uzyskane wyniki mają zatem istotny aspekt poznawczy, wskazują bowiem, iż stopień nasilenia stanu zapalnego indukowany przez wybrane chemokiny może być istotnym czynnikiem związanym patogenezą endometriozy.
Omówienie wyników i dyskusja świadczą o wysokiej dojrzałości naukowej Autorki. Podkreślić należy, iż w dostępnym piśmiennictwie brak jest prac oceniających stężenia niektórych chemokin w płynie otrzewnowym kobiet z endometriozą.
Z jednej strony utrudnia to interpretację wyników i uniemożliwia ich porównanie do rezultatów innych autorów, a z drugiej strony wskazuje na oryginalny aspekt poznawczy przeprowadzonych badań. Wykazując się dużą wiedzą Doktorantka logicznie interpretuje uzyskane wyniki, sprawnie odnosi uzyskane wyniki i obserwacje własne do danych z literatury dotyczących przebiegu klinicznego choroby.
Praca zakończona jest czterema wnioskami. Wnioski w większości sformułowane są prawidłowo i są zgodne z celem badań oraz uzyskanymi wynikami.
Aczkolwiek wniosek 4 stanowi bardziej hipotezę niż rzeczywisty wniosek płynący z uzyskanych w pracy wyników. Wydaje się, że pozytywnym walorem dla ocenianej dysertacji byłoby formalne przeredagowanie tego wniosku.
Praca zawiera także poprawnie zredagowane streszczenie w języku polskim oraz
Piśmiennictwo obejmuje 147 pozycji, z czego 28 prac opublikowano w latach 2017-2020. Pozostałe prace, w większości oryginalne zostały wydane po 2000 roku.
Dobór cytowanych prac jest staranny i trafny, co przy tak bogatym piśmiennictwie w dostępnych bazach świadczy o krytycznym podejściu Autorki do cytowanych wyników.
Praca zredagowana jest starannie i napisana poprawnym językiem.
Zawiera nieliczne błędy edytorskie, które należy poprawić przed ostatecznym wydrukiem.
Pragnę podkreślić, że poczynione przeze mnie uwagi nie umniejszają wartości naukowej dysertacji, a dotyczą głównie sposobu prezentacji wyników i są sugestią, którą Autorka może wykorzystać podczas przedstawiania rezultatów badań w przyszłości.
Oceniając rozprawę doktorską mgr Marty Smycz-Kubańskiej pt. „Udział wybranych chemokin w patogenezie endometriozy” pragnę stwierdzić, że nie mam żadnych merytorycznych zastrzeżeń odnośnie założeń, celu podjętych badań, zastosowanych metod badawczych i uzyskanych wyników. Recenzowana dysertacja posiada oryginalny aspekt poznawczy. Wyniki otrzymane przez Doktorantkę otwierają dalsze perspektywy badawcze.
Rozprawa doktorska pt. „Udział wybranych chemokin w patogenezie endometriozy” spełnia warunki określone w art.13 ust.1 ustawy z dnia 14 marca 2003 r.
o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (t.j. Dz.U. z 2017 r., poz.1789)”.
Wobec powyższego wnoszę do Rady Dyscypliny Nauk Medycznych Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach o dopuszczenie mgr Marty Smycz-Kubańskiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego.
