Poza lumichromem (7,8-dimetyloalloksazyna) przedmiotem badań spektralnych i fotofizycznych stała się alloksazyna oraz jej wybrane alkilowe pochodne, głównie w roztworach rozpuszczalników organicznych. Dane dla wybranych związków zostały zebrane w Tabeli 2, natomiast struktury tych pochodnych przedstawiono na Rysunku 7.
W widmach absorpcji można wyróżnić charakterystyczne maksima pojawiające się w zakresie UV-Vis, podobnie jak to miało miejsce w przypadku opisanego wcześniej lumichromu. Typowe alloksazyny wykazują dwa dobrze rozdzielone pasma w długofalowej części widma absorpcji, pierwsze z nich zlokalizowane zwykle przy ok.
370 nm, natomiast drugie przy ok. 330 nm. Dokładne położenie maksimów absorpcji jest uzależnione od rodzaju badanej pochodnej oraz użytego rozpuszczalnika. Zgodnie z wynikami obliczeń teoretycznych, dwa rozdzielone maksima absorpcji w długofalowej części widma notowane dla alloksazyny i jej alkilowych pochodnych, są związane z dwoma niezależnymi przejściami elektronowymi typu π,π*. Jednakże, w większości przypadków, najniżej zlokalizowanym przejściom typu π,π* towarzyszy blisko położony stan typu n,π*. Blisko położone stany typu n,π* oraz π,π* mogą w niektórych sytuacjach ulegać inwersji. Kolejność stanów n,π* oraz π,π* jest silnie związana z usytuowaniem podstawienia metylowego w pierścieniu alloksazynowym. Zgodnie z wynikami obliczeń teoretycznych metodami DFT przejście elektronowe S0 → S1 ma zwykle charaker π,π*, tylko w przypadku alloksazyny oraz 8-metyloalloksazyny przejście elektronowe S0 → S1
ma charakter n,π* (50) oraz dla 6,8-dimetyloalloksazyny, pośród pochodnych dimetylowych alloksazyn (51).
R1 R2 R3 Związek
Rysunek 7. Struktura alloksazyny i jej wybranych mono- i di- metylowych pochodnych
Allokazyny, niezależnie od ilości grup alkilowych w pierścieniu heterocyklicznym oraz ich usytuowania wykazują w widmach fluorescencji w rozpuszczalnikach organicznych, podobnie jak lumichrom oraz lumiflawina, zwykle jedno pasmo, dla którego usytuowanie maksimum jest uzależnione od struktury pochodnej oraz rozpuszczalnika. Zwykle w rozpuszczalnikach polarnych obserwuje się batochromowe przesunięcie maksimum emisji w porównaniu do rozpuszczalników niepolarnych. Dla przykładu, 6-metyloalloksazyna wykazuje maksimum fluorescencji przy 455 nm w dichloroetanie, natomiast w etanolu przy 460 nm (Tabela 2). Podobne prawidłowości można zauważyć analizując pozostałe pochodne alloksazyny. Zmierzone zaniki fluorescencji wskazują na obecność jednej formy emitującej promieniowanie, która zanika zwykle w czasie rzędu setek ps do kilku ns, a ich konkretna wartość zależy od rodzaju użytego rozpuszczalnika oraz struktury cząsteczki. Dłuższe czasy życia alloksazyn obserwuje się w rozpuszczalnikach polarnych (Tabela 2). Wyznaczone wartości stałych radiacyjnej i nieradiacyjnej dezaktywacji stanu wzbudzonego świadczą, iż fluorescencja nie jest uprzywilejowanym kanałem dezaktywacji stanu wzbudzonego alloksazyny oraz jej metylowych pochodnych, zdecydowanie bardziej uprzywilejowane są procesy nieradiacyjnej dezaktywacji. Obecność grup metylowych w pierścieniu alloksazynowym wpływa istotnie między innymi na wartości czasów życia stanu singletowego oraz wydajności kwantowe fluorescencji. Wprowadzenie grupy metylowej w pozycję C(7) i C(8) skutkuje obniżeniem wartości wydajności kwantowych fluorescencji oraz skróceniem czasu życia stanu singletowego.
Tabela 2. Właściwości alloksazyny oraz jej mono- i di- metylowych pochodnych w stanach
λ1, λ2 pozycje dwóch najniższych energetycznie pasm w widmach absorpcji, λF maksimum fluorescencji, ФF wydajność kwantowa fluorescencji, τF czas życia stanu singletowego, kr stała radiacyjna, Σknr suma stałych nieradiacyjnych, w tabeli użyto skróty rozpuszczalników: ACN – acetonitryl, DCE – 1,2-dichloroetan, EtOH – etanol, MeOH – metanol, na podstawie: a (52) oraz b (51).
Z kolei obecność grupy metylowej w pozycjach C(6) oraz C(9) wywołuje przeciwny efekt, tj. podwyższenie wartości wydajności kwantowej fluorescencji oraz wydłużenie czasu życia stanu singletowego. Dodatkowo, obecność grupy metylowej w różnym usytuowaniu pierścienia alloksazynowego modyfikuje właściwości absorpcyjno-emisyjne. Dla przykładu, wprowadzenie grupy metylowej w pozycję C(8) łączy obydwa pasma absorpcji ze względu na batochromowe przesunięcie λ2 oraz hipsochromowe przesunięcie λ1, co powoduje trudność w ich rozróżnieniu (52). Podobna sytuacja została odnotowana dla
dimetylowych pochodnych alloksazyny, szczególnie dla 6,8-dimetyloalloksazyny. W tym przypadku w widmie absorpcji odnotowano obecność jednego, szerokiego pasma, z maksimum zlokalizowanym przy ok. 350 nm (dokładne położenie jest zależne od stosowanego rozpuszczalnika).
2.1.4. Izoalloksazyny
Jak wspomniano wcześniej, jednym z najczęściej wykorzystywanych układów modelowych w badaniach izoalloksazyn jest lumiflawina. Jednakże, inne cząsteczki oparte na strukturze izoalloksazyny, również są poddawane badaniom spektralnym i fotofizycznym. Wykazano, iż obecność grupy metylowej przy atomach węgla C(6) oraz C(9) powoduje wygaszanie fluorescencji oraz skrócenie czasu życia fluorescencji, podczas gdy przyłączenie grupy metylowej w pozycję C(7) powoduje przeciwny efekt (Tabela 3).
Jedną z możliwości wyjaśnienia obserwowanego zjawiska stały się różnice w tworzeniu wiązań pomiędzy grupami metylowymi a pierścieniem izoalloksazynowym, które skutkują pojawieniem się odkształceń struktury izoalloksazynowej, które mogą sprzyjać wygaszaniu fluorescencji. Zaobserwowano również, iż absorpcja kationowej formy izoalloksazyny przesuwa się w kierunku wyższych energii w porównaniu do neutralnej postaci izoalloksazyny. Fluorescencja formy kationowej izoalloksazyny jest silnie wygaszana w roztworach wodnych oraz obserwuje się znaczne skrócenie czasów życia fluorescencji w tych warunkach. Prawdopodobnie, efekt ten wynika z silnego oddziaływania naładowanej formy izoalloksazyny z dipolami cząsteczek wody, które skutkują dezaktywacją nieradiacyjną (53). Porównanie odpowiednich maksimów absorpcji i fluorescencji izoalloksazyn z analogicznymi allokazynami wskazuje, iż dla izoalloksazyn obserwuje się batochromowe przesunięcia w każdym przypadku, niezależnie od zastosowanego rozpuszczalnika.
Struktury elektronowe w stanach singletowych oraz trypletowych wraz z przewidywanymi energiami przejść singlet → singlet, singlet → tryplet oraz tryplet → tryplet dla tetrametylo- podstawionych izoalloksazyny zostały ustalone na podstawie obliczeń teoretycznych metodami DFT oraz porównane z dostępnymi danymi eksperymentalnymi (54). Dodatkowo zostały ustalone orientacje i długości wektorów momentów dipolowych dla stanów: S0, S1 oraz T1 dla wybranych izoalloksazyn, przedstawiono na Rysunku 8.
Wybrane parametry spektralne i fotofizyczne zarejestrowane w acetonitrylu dla kilku tetrametylo- podstawionych izoalloksazyn zostały zebrane w Tabeli 3. Wyznaczone
wielkości i kierunki momentów dipolowych dla różnych tetrametylo- podstawionych izoalloksazyn nie wykazują znaczących różnic, jeśli uwzględni się zarówno różnice strukturalne w cząsteczkach oraz różne stany elektronowe. Praktycznie zawsze wektory momentów dipolowych są zorientowane na linii N(3) – C(8). Z kolei podwyższenie wartości momentów dipolowych obserwuje się w stanie S1 natomiast obniżenie w stanie T1
(54). Na podstawie obliczeń teoretycznych stwierdzono, iż najniższe energetycznie przejście singlet → singlet pojawia się przy około 413 nm i ma charakter π,π*, któremu dla wielu tetrametylo- podstawionych izoalloksazyn towarzyszy wyższe energetycznie przejście o charakterze n,π*. Należy dodać, iż dla dwóch pochodnych: 3,6,8,10-tetrametyloizoalloksazyny oraz 3,8,9,10-tetrametyloalloksazyny najniższe energetycznie przejście singlet → singlet ma charakter n,π*, chociaż wyliczona różnica pomiędzy tym stanem, a kolejnym wyższym energetycznie (o charakterze π,π*) wynosi około 800 cm-1 (54).
Rysunek 8. Struktury wybranych izoalloksazyn wraz z wyznaczonymi kierunkami i wartościami momentów dipolowych w różnych stanach elektronowych (S0, S1 oraz T1), na podstawie [54].
T1 (7.05 D)
S1 (8.46 D)
Tabela 3. Właściwości spektralne i fotofizyczne wybranych tetrametylo- podstawionych izoalloksazyn w acetonitrylu w stanach singletowych
Związek λ2/nm λ1/nm λF/nm ФF
τF
/ns kr /108s-1
Σknr
/108s-1 3,6,7,10-Izoa 349 448 543 0.17 3.9 0.44 2.1 3,6,8,10-Izoa 370 446 540 0.18 3.9 0.46 2.1 3,7,8,10-Izoa 342 444 531 0.47 6.9 0.68 0.77 3,7,9,10-Izoa 346 448 552 0.18 4.2 0.43 2.0
λ1, λ2 pozycje dwóch najniższych energetycznie pasm w widmach absorpcji, λF maksimum fluorescencji, ФF wydajność kwantowa fluorescencji, τF czas życia stanu singletowego, kr stała radiacyjna, Σknr suma stałych nieradiacyjnych, na podstawie: a (53,54)