Metody eksperymentalne stosowane w badaniach oraz używana aparatura

3.3.1. Pomiary stacjonarne absorpcyjno – emisyjne w zakresie UV/Vis oraz NIR

Wszystkie roztwory używane do badań przygotowywano w tym samym dniu, kiedy były przeprowadzane pomiary widm stacjonarnych (absorpcji, emisji, wzbudzenia emisji, synchroniczne) lub czasowo-rozdzielcze.

Widma absorpcji prezentowane w pracy zarówno w rozpuszczalnikach organicznych jak i roztworach wodnych w zakresie UV/Vis zostały zarejestrowane przy użyciu spektrofotometru JASCO V-650 oraz przy wykorzystaniu spektrofluorymetru Horiba Jobin Yvon Spex Fluorolog 3-221 z wykorzystaniem przystawki, która umożliwia pomiary widm absorpcji. Pomiary widm absorpcji przy wykorzystaniu przystawki absorpcyjnej spektrofluorymetru Horiba Jobin Yvon Spex Fluorolog 3-221 były szczególnie istotne w czasie badań procesów generowania tlenu singletowego przez pochodne 5-deazaalloksazyny, w czasie których używano roztworów o jednakowej absorbancji dla standardu (perinaftenonu) oraz badanej substancji – umożliwiało to zachowanie jednakowej optyki w torze wzbudzenia przy rejestracji widm charakterystycznej fosforescencji tlenu singletowego w zakresie NIR.

Ponadto, przy wykorzystaniu spektrofluorymetru Horiba Jobin Yvon Spex Fluorolog 3-221 zarejestrowano widma emisji oraz wzbudzenia emisji, synchronicznej spektroskopii fluorescencyjnej oraz widma całkowitej fluorescencji wykorzystywane do omawiania właściwości spektralnych i fotofizycznych badanych związków.

Fotografia używanego spektrofluorymetru Horiba Jobin Yvon Spex Fluorolog 3-221 została przedstawiona na Rysunku 35. Do najważniejszych elementów składowych spektrofluorymetru można zaliczyć:

 Źródła światła: lampa ksenonowa (wykorzystywana w pomiarach widm stacjonarnych) oraz diody typu NanoLED oraz SpectraLED (używane do pomiarów czasowo – rozdzielczych);

 monochromator toru wzbudzenia – powoduje filtrowanie wiązki światła emitowanej przez lampę ksenonową oraz wydzielenie światła o jednej, określonej długości fali;

 moduł z komorą próbek – standardowy moduł próbki to T-box, który umożliwia dwa sposoby zbierania promieniowania emitowanego przez próbkę: standardowy – pod kątem prostym oraz opcjonalny – czołowy;

 monochromator toru emisji – promieniowanie próbki poddawane jest filtrowaniu i kierowane do detektora;

 detektor promieniowania emitowanego w zakresie UV/Vis to R928P bardzo czuły w modzie zliczania fotonów (180-850 nm), liniowy zakres zliczeń 2 × 10⁶ zliczeń/s;

<1000 zliczeń ciemnych na sekundę. W zakresie NIR do detekcji był używany detektor H10330B-75 NIR-PMT, który umożliwia detekcję promieniowania w zakresie od 950 nm do 1700 nm.

Komponenty spektrofluorymetru (monochromatory, komora próbek) są podłączone do kontrolera (jednostki sterującej: „SpectrAcq”), która pośredniczy w transferze danych do i z komputera. Używane oprogramowanie do rejestracji i analizy widm stacjonarnych to FluorEssence™ połączony z programem Origin 8.

Rysunek 35. Fotografia stosowanego spektrofluorymetru Horiba Jobin Yvon Spex Fluorolog 3-221

3.3.2. Pomiary emisyjne czasowo-rozdzielcze w zakresie UV/Vis oraz NIR

Pikosekundowy spektrometr emisyjny²

Pikosekundowy spektrometr emisyjny wykorzystano do pomiarów czasu życia stanu fluorescencji dla próbek znajdujących się w różnych warunkach pH. Pozwala mierzyć widma

2 Opracowano na podstawie strony internetowej Centrum Badawczego Ultraszybkiej Spektroskopii Laserowej UAM: www.cbusl.amu.edu.pl.

emisji czasowo-rozdzielcze oraz czasy zaniku fluorescencji w przedziale od 10^-5 do 10^-12 s.

Źródłem wzbudzenia w omawianym spektrometrze jest piko/femtosekundowy laser tytanowo-szafirowy, przestrajalny w zakresie od 720-1000 nm (wiązka podstawowa), 360-500 nm (druga harmoniczna), 240-330 nm (trzecia harmoniczna). Szerokości czasowe impulsów są równe 60 fs lub 1,5 ps. Detektorem jest układ do zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC).

Rysunek 36. Fotografia pikosekundowego spektrometru emisyjnego. Na podstawie:

www.cbusl.amu.edu.pl

Czasowo rozdzielczy spektrofluorymetr z detekcją opartą o metodę skorelowanego czasowo zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC – IBH System 5000)

Wykorzystywany do pomiarów zaników fluorescencji w zakresie UV/Vis głównie dla próbek pochodnych 5-deazaalloksazyny znajdujących się w różnych rozpuszczalnikach organicznych metodą TCSPC. Źródłem wzbudzenia była dioda typu NanoLED (λexc = 374 nm). Układ skonfigurowany na pomiary czasów życia fluorescencji krótszych niż 400 ps. Analiza zmierzonych zaników fluorescencji została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania IBH Consultants (wersja 4).

Spektrofluorymetr Pico-Quant (Berlin, Germany) FluoTime 300

Wykorzystywany do pomiarów zaników fluorescencji w zakresie UV/Vis głównie dla próbek pochodnych alloksazyny (1MeFR oraz 3MeFR) znajdujących się w różnych rozpuszczalnikach organicznych metodą TCSPC. Źródłem wzbudzenia była pulsowa pikosekundowa dioda laserowa LED (λexc = 377 nm). Układ skonfigurowany na pomiary czasów życia fluorescencji krótszych niż 400 ps. Analiza zmierzonych zaników fluorescencji została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania FluoFit Fluorescence Decay Data Analysis (wersja 4.55).

Spektrofluorymetr Horiba Jobin Yvon Spex Fluorolog 3-221

Wykorzystywany do pomiarów zaników fluorescencji w zakresie UV/Vis głównie w czasie badania procesów podwójnego przeniesienia protonu w stanie wzbudzonym dla pochodnych 5DAll oraz pochodnych alloksazyny (1MeFR i 3MeFR) metodą TCSPC. Ponadto używany do pomiarów zaników fosforescencji w zakresie NIR przy λ = 1270 nm, które posłużyły do wyznaczenia czasów życia tlenu singletowego w rozpuszczalnikach organicznych i wodzie deuterowanej generowanego przez pochodne 5DAll. Źródłem wzbudzenia była dioda typu NanoLED (λ_exc = 368 nm) – do pomiarów w zakresie UV/Vis oraz dioda typu SpectraLED (λexc = 371 nm oraz 394 nm). Zaniki były mierzone przy wykorzystaniu TCSPC Triple Illuminator, który jest dodatkiem do Fluorolog 3-22. Opracowanie zaników fluorescencji w zakresie UV/Vis oraz zaników fosforescencji w zakresie NIR zostało przeprowadzone przy wykorzystaniu oprogramowania IBH Consultants (wersja 4).

3.3.3. Nanosekundowy układ do badania absorpcji przejściowej

Nanosekundowy spektrometr absorpcji przejściowej, pozwala na pomiar absorpcji indywiduów żyjących od kilkunastu nanosekund do kilkuset mikrosekund. Źródłem wzbudzenia jest laser Nd:YAG z drugą (532 nm), trzecią (355 nm) i czwartą (266 nm) harmoniczną. Źródłem światła białego (sondującego) jest impulsowa lampa ksenonowa (czas impulsu ok. 450 μs). Zaniki absorpcji przejściowej były mierzone z krokiem pomiarowym co 10 nm. Próbki przed przeprowadzeniem eksperymentów laserowej flash-fotolizy były odtleniane przez około 20 minut przy wykorzystaniu argonu o wysokiej czystości.

Eksperymenty przeprowadzono w kuwetach kwarcowych 1 cm × 1 cm. Szczegółowy opis stosowanej aparatury został zawarty w pracach (151,152).

3.3.4. pH-metr Hanna Instruments

pH-metr został wykorzystany do miareczkowania pochodnych: 5DAll oraz 13Me-5DAll w czasie badań równowag protonacji / deprotonacji tych związków. W pierwszym etapie badań pH-metr był kalibrowany przy użyciu roztworów buforowych (pH = 7, pH = 4). Używany pH-metr działa na zasadzie pomiaru różnicy napięcia pomiędzy dwiema elektrodami – szklaną, zanurzoną w badanym roztworze oraz wzorcową, zanurzoną w roztworze o znanej wartości pH. Zmierzona różnica wartości napięcia pomiędzy elektrodami jest proporcjonalna do różnicy pH pomiędzy obydwoma roztworami.