Efekty solwatochromowe dla flawin

Cząsteczki izo- i alloksazyn są interesującymi układami modelowymi również w badaniach efektów solwatochromowych oraz w określaniu zdolności do formowania wiązań wodorowych zarówno pomiędzy sobą, co ma miejsce głównie w ciele stałym jak również pomiędzy cząsteczkami rozpuszczalnika a alloksazyną. W cząsteczkach alloksazyn są obecne zarówno ugrupowania protonodonorowe jak i protonoakceptorowe.

Badania przeprowadzone dla lumichromu oraz jego metylowych pochodnych, wliczając w to 1-metylolumichrom, 3-metylolumichrom oraz 1,3-dimetylolumichrom w 1,2-dichloroetanie przy zastosowaniu miareczkowania DMSO (jako substancji będącej akceptorem wiązania wodorowego) wskazują, że jednym z ważnych ugrupowań w cząsteczce lumichromu, który odpowiada za utworzenie wiązań wodorowych jest grupa N(1)-H. Z kolei zastosowanie 1,1,1,3,3,3-heksafluoroizopropanolu (donor atomu wodoru) pozwoliło stwierdzić, iż obserwowane zmiany w widmach absorpcji lumichromu w miarę wzrastającego stężenia 1,1,1,3,3,3-heksafluoroizopropanolu pochodzą od utworzenia wiązania wodorowego w pozycji N(10) cząsteczki lumichromu. W tym przypadku możliwe jest również utworzenie wiązań wodorowych z karbonylowymi atomami tlenu obecnymi przy atomach C(2) oraz C(4), jednakże w tym przypadku nie zaobserwowano żadnych zmian w widmach absorpcji.

Dodatkowo, pozycja N(5) w cząsteczce lumichromu może działać jako akceptor wiązania wodorowego, jednak ze względu na stosunkowo niską zasadowość w tym rejonie wydaje się mało prawdopodobna możliwość utworzenia wiązania wodorowego w tym miejscu (111).

W przypadku lumichromu stwierdzono, że położenie dwóch długofalowych pasm w widmach absorpcji jest uzależnione od rodzaju zastosowanego rozpuszczalnika. Wraz ze wzrastającą polarnością rozpuszczalnika zaobserwowano długofalowe przesunięcia obydwu pasm absorpcji połączone z hipochromowym efektem dla pierwszego pasma oraz efektem hiperchromowym dla drugiego pasma (36).

Z kolei analiza różnych parametrów spektralnych, takich jak maksima emisji oraz przesunięcia Stokesa w szerokiej skali rozpuszczalników o różnej polarności jak również zdolnościach protyczno – aprotycznych została przeprowadzona przy wykorzystaniu różnych skal polarności rozpuszczalników (19) oraz przy zastosowaniu skali polarności Δf opartej na równaniu Lipperta – Matagi. Wykazano praktycznie zupełny brak regularnego solwatochromizmu, stąd postuluje się występowanie oddziaływań specyficznych na linii lumichrom – rozpuszczalnik. Bardziej szczegółowa analiza przeprowadzona przy

wykorzystaniu skali E_T(30) wskazała bardzo dobrą korelację z maksimami fluorescencji oraz wartościami przesunięcia Stokesa, co świadczy, iż solwatochromizm lumichromu w stanie wzbudzonym jest modyfikowany przez zdolności donorowe do tworzenia wiązań wodorowych przez rozpuszczalnik (kwasowość rozpuszczalnika), natomiast zasadowość rozpuszczalnika odgrywa jest mniej istotna (19). Dalsza analiza solwatochromowa przeprowadzona w oparciu o równanie Kamleta – Tafta potwierdza hipotezy postawione przy dyskusji efektów solwatochromowych opartych o skalę ET(30). Ponadto autorzy dowodzą, iż w stanie podstawowym mogą tworzyć się kompleksy oparte na wiązaniach wodorowych pomiędzy lumichromem a rozpuszczalnikami protycznymi, w których są zaangażowane zarówno strony donorowe jak i akceptorowe cząsteczki lumichromu, jednak w stanie wzbudzonym następuje faworyzowanie fluorescencji wyłącznie z tych układów, w których dominuje kwasowość rozpuszczalnika w tworzeniu wiązań wodorowych (19). Występowanie wiązań wodorowych pomiędzy cząsteczką lumichromu a rozpuszczalnikami tak w stanie podstawowym, jak i wzbudzonym jest częstym problemem poruszanym w literaturze przedmiotu (19,21,36,44,122). W ten sposób udowodniono, iż w przypadku roztworów lumichromu w rozpuszczalnikach protycznych obserwuje się czerowo-przesunięcia zarówno maksimów absorpcji jak i emisji, fluorescencja staje się bardziej uprzywilejowanym kanałem dezaktywacji wzbudzonego stanu singletowego w porównaniu do lumichromu rozpuszczonego w rozpuszczalnikach aprotycznych. Na Rysunku 26 przedstawiono możliwe struktury kompleksów, które mogą utworzyć się pomiędzy lumichromem a metanolem lub kwasem octowym, angażując różne rejony cząsteczki lumichromu, tak protonowo-donorowe jak i protonowo-akcpetorowe. Wykorzystując obliczenia teoretyczne stwierdzono, iż najsilniejsze wiązanie wodorowe tworzy się w przypadkach: IIIa (12.7 kcal/mol) oraz IIIb (17.3 kcal/mol), natomiast najsłabsze w przypadku kompleksów: Ia (7.8 kcal/mol) i IVb (10.9 kcal/mol), oznaczenia są zgodne z danymi przedstawionymi na Rysunku 26 (122).

Autorzy podkreślają, iż w rzeczywistych roztworach sytuacja powstawania wiązań wodorowych może nie być tak prosta jak przedstawiona na Rysunku 26 ze względu na możliwość tworzenia kompleksów o innej stechiometrii niż 1:1 lub powstania agregatów, które znacznie komplikują obraz tworzenia wiązań wodorowych. Zgodnie z informacjami podanymi przez Koziołową i Szafrana zmiany w widmach absorpcji lumichromu w miarę dodawania kwasu octowego są spowodowane oddziaływaniem tej cząsteczki z atomem azotu N(10) lumichromu. Zgodnie z danymi przedstawionymi na Rysunku 26, w tej sytuacji najbardziej postulowane jest powstanie kompleksu o geometrii IIb (22,110,122). Obliczenia

teoretyczne metodami DFT potwierdzają możliwość utworzenia kompleksu o takiej strukturze.

Rysunek 26. Możliwe struktury kompleksów lumichromu z metanolem (po lewej stronie) oraz z kwasem octowym (po prawej stronie); na podstawie (122).

Układami modelowymi do badania możliwości tworzenia wiązań wodorowych dla struktur izoalloksazynowych stały się pochodne ryboflawiny. Przy wykorzystaniu metod absorpcyjno – emisyjnych początkowo badaną pochodną rozpuszczono w tetrachlorometanie. W tych warunkach zostały zarejestrowane zarówno widma absorpcji jak i emisji, aby ukazać ich przebieg w sytuacji, gdy nie są tworzone wiązania wodorowe. Następnie dwa niezależne roztwory poddano miareczkowaniu kwasami: trichlorooctowym oraz trifluorooctowym. W miarę wzrostu stężenia zarówno kwasu trichlorooctowego jak i trifluorooctowego zaobserwowano, iż pierwsze maksimum absorpcji przesuwa się ku dłuższym falom wraz z niewielkim podwyższeniem absorbancji natomiast dalszy wzrost stężenia kwasu trichlorooctowego powoduje czerwone przesunięcie i maksimum absorpcji lokuje się w miejscu gdzie nie było efektu tworzenia wiązania wodorowego. Z kolei drugie, bardziej długofalowe pasmo absorpcji pochodnej ryboflawiny, przesuwa się wyraźnie w stronę długofalową niezależnie od zastosowanego kwasu. Rejestracja widm fluorescencji pochodnej

ryboflawiny w obecności zarówno kwasu trifluorooctowego jak i trichlorooctowego ukazała zjawisko wygaszania fluorescencji w miarę wzrostu stężenia kwasów.

N

Rysunek 27. (A) Struktura izoalloksazynowa bez uformowanych wiązań wodorowych, (B) schemat formowania wiązań wodorowych na heteroatomach izoalloksazyny, na podstawie (123).

Wyznaczone zostały stałe wygaszania fluorescencji przez kwas trichlorooctowy oraz trifluorooctowy z wartościami odpowiednio: 450 M^-1 oraz 230 M^-1. Na podstawie obliczeń teoretycznych stwierdzono, iż dla układu izoalloksazynowego wiązania wodorowe z cząsteczkami wykorzystywanych kwasów tworzą się w sekwencji: brak wiązania wodorowego → N(1)-wiązanie wodorowe → N(1),O(12)-wiązanie wodorowe → N(1),O(12),O(14)-wiązanie wodorowe → N(1),O(12),N(3)H,O(14)-wiązanie wodorowe → N(1),O(12),N(3)H,O(14),N(5)-wiązanie wodorowe (123,124). Odpowiednie oznaczenia heteroatomów biorących udział w wiązaniach wodorowych izoalloksazyny zostały pokazane na Rysunku 27. Przebieg widm absorpcji oraz emisji zarejestrowanych dla badanej pochodnej ryboflawiny w tetrachlorometanie w miarę wzrastającego stężenia kwasów trifluorooctowego oraz trichlorooctowego został przedstawiony na Rysunku 28.