Reakcja podwójnego przeniesienia protonu w stanie wzbudzonym dla pochodnych flawin

Generalna idea reakcji podwójnego przeniesienia protonu w stanie wzbudzonym opiera się na utworzeniu kompleksu w stanie podstawowym pomiędzy cząsteczką alloksazyny oraz molekułą zdolną do tworzenia wiązań wodorowych (na przykład kwasy karboksylowe, pirydyna), który jest oparty na wiązaniach wodorowych. Następnie, pod wpływem wzbudzenia, wewnątrz uformowanego kompleksu następuje migracja atomu wodoru z pozycji N(1) na pozycję N(10). Powoduje to zmianę konfiguracji elektronowej przy atomie N(10) w cząsteczce alloksazyny i uformowanie struktury izoalloksazynowej. Jedną z najczęściej badanych cząsteczek należących do alloksazyn w reakcji podwójnego przeniesienia protonu jest lumichrom (7,8-dimetyloalloksazyna). Jednakże, zajście reakcji jest możliwe również dla innych alloksazyn, które są niepodstawione grupami alkilowymi przy atomie N(1). Pierwotny mechanizm zaproponowany przez Kozioła, Koziołową, Songa zakładał utworzenie cyklicznego kompleksu pomiędzy pomiędzy atomami N(1) i N(10) cząsteczki lumichromu (37,108,109). Określono wówczas, iż siłą napędzającą proces tautomeryzacji alloksazynowo - izoalloksazynowej jest jednocześnie wzrastająca zasadowość atomu azotu N(10) oraz wzrastająca kwasowość ugrupowania N(1)-H, która następuje po procesie wzbudzenia promieniowaniem elektromagnetycznym. Również w tym przypadku stwierdzono, iż pomiędzy lumichromem a kwasem octowym forumuje się ośmioczłonowy, cykliczny kompleks o stechiometrii 1:1, skupiony wokół atomów azotu N(1) i N(10) cząsteczki lumichromu. Inne podejście do wyjaśnienia mechanizmu reakcji podwójnego przeniesienia protonu w cząsteczce lumichromu pod wpływem obecności pirydyny zaproponował Kasha (31). Cząsteczka pirydyny jest tutaj określana mianem „aktywnego transportera” protonu z pozycji N(1) lumichromu na atom azotu N(10). Proponowany przebieg reakcji przeniesienia protonu w stanie wzbudzonym dla lumichromu w obecności pirydyny został przedstawiony na Rysunku 20. W poszczególnych etapach proponowanego mechanizmu można wyróżnić pewne charakterystyczne formy strukturalne, mianowicie, w początkowym etapie (XI, Rysunek 20) następuje utworzenie wiązania wodorowego w stanie podstawowym pomiędzy pirydyną a ugrupowaniem N(1)-H lumichromu. Dalej, pod wpływem wzbudzenia tworzy się produkt pośredni w postaci pary jonowej (XII, Rysunek 20) we wzbudzonym stanie singletowym S₁ lumichromu. W kolejnym etapie, pirydyna przyczynia się do relaksacyjnej reorientacji, która skutkuje powstaniem stanu S’1, w którym tworzy się wiązanie wodorowe pomiędzy atomem N(10) lumichromu i kształtuje się

izoalloksazynowy układ wiązań. Autorzy potwierdzają słuszność proponowanego mechanizmu przez odwołanie się do badań niskotemperaturowych, w których procesy przeniesienia protonu są blokowane (31). Ponadto wyznaczony czas narastania w temperaturze 293 K jest dłuższy niż 50 ps, co wskazuje na mechanizm relaksacji rozpuszczalnikowej (31).

Rysunek 20. Proponowany mechanizm reakcji przeniesienia protonu dla lumichromu w obecności pirydyny zaproponowany przez Kash’a, XI oznacza kompleks pirydyny z atomem azotu N(1) lumichromu w stanie podstawowym, XII: produkt pośredni w postaci pary jonowej we wzbudzonym stanie singletowym S1 oraz XIII: utworzenie flawinowego tautomeru z wiązaniem wodór-azot przy N(10) w zrelaksowanym stanie S’1; na podstawie (31).

Fototautomeryzację lumichromu do 7,8-dimetyloizoalloksazyny stwierdzono w różnych układach, w których znajdowały się cząsteczki zdolne do tworzenia wiązań wodorowych z lumichromem, a wewnątrz tych kompleksów było możliwe przeniesienie atomu wodoru z N(1) na N(10) pod wpływem wzbudzenia promieniowaniem. Podobne zjawisko następowało w obecności innych substancji (lub ich mieszaniny), oprócz wspomnianego kwasu octowego, to między innymi: metanol (38), etanol (26,37), pirydyna (32), kwas trifluorooctowy oraz mieszanina dichlorometanu z heksafluoropropanolem (110), mieszanina wody i pirydyny oraz wody i acetonu (32), a także mieszanina dioksanu z pirydyną (109). Należy podkreślić, iż nie

XI

Kompleks lumichromu i pirydyny

XII

produkt pośredni: para jonowa w stanie S₁

przeniesienie protonu relaksacja

XIII

tautomer flawinowy w stanie S'₁

zaobserwowano możliwej tautomeryzacji lumichromu oraz jego niepodstawionych przy N(1) grupą alkilową pochodnych w czystej wodzie (79).

Szczegółowe badania zostały przeprowadzone dla reakcji podwójnego przeniesienia protonu w stanie wzbudzonym dla cząsteczki lumichromu w obecności kwasu octowego, w sytuacji gdy układ znajdował się w różnych rozpuszczalnikach, wliczając w to: 1,2-dichloroetan, acetonitryl oraz czysty kwas octowy (111). Przy wykorzystaniu technik absorpcyjno-emisyjnych stwierdzono, iż w stanie podstawowym formuje się kompleks lumichrom:kwas octowy oparty na wiązaniach wodorowych, którego stechiometria wynosi 1 : 1. Dodatkowo, został określony wpływ oddziaływań kształtujących się pomiędzy lumichromem a zastosowanym rozpuszczalnikiem na stałą równowagi tworzenia kompleksu. Okazało się, iż w przypadku 1,2-dichloroetanu stała równowagi była o rząd wielkości wyższa w porównaniu gdy do badań zastosowano acetonitryl (111). Zmiana rozpuszczalnika wpływa również znacząco na mechanizm reakcji. W przypadku zastosowania niepolarnego 1,2-dichloroetanu bardziej preferowane jest utworzenie cyklicznych kompleksów w stanie podstawowym, natomiast w przypadku rozpuszczalników polarnych takich jak acetonitryl, w stanie podstawowym początkowo tworzy się układ lumichrom:kwas octowy z pojedynczym wiązaniem wodorowym przy atomie N(10), natomiast utworzenie pełnego kompleksu następuje w stanie wzbudzonym. Zwiększanie stężenia kwasu octowego w roztworze lumichromu w acetonitrylu oraz 1,2-dichloroetanie powodował niewielki wzrost absorbancji, który wynika z formowania się wiązań wodorowych w stanie podstawowym pomiędzy lumichromem oraz kwasem octowym. Prawidłowość tą stwierdzono również dla innych alloksazyn. Ze względu na fakt, iż w cząsteczce lumichromu obecne są zarówno ugrupowania protonodonorowe jak i protonoakceptorowe, dodatek kwasu octowego może skutkować utworzeniem kompleksów lumichrom:kwas octowy opartych na wiązaniach wodorowych, jednak wykazano, iż obserwowane zmiany w widmach absorpcji pod wpływem dodatku kwasu octowego pochodzą od uformowanych kompleksów lumichrom:kwas octowy, w których zaangażowany jest atom azotu N(10). Bardziej wymowne zmiany, które świadczą o zachodzącym procesie tautomeryzacji pomiędzy formą alloksazynową a izoalloksazynową dla lumichromu i innych alloksazyn niepodstawionych w pozycji N(1) obserwuje się w widmach emisji. Generalnie, w widmach emisji lumichromu i wielu innych alloksazyn obserwuje się obecność jednego pasma, którego maksimum usytuowane jest pomiędzy 420 nm a 440 nm w zależności od badanej pochodnej oraz zastosowanego rozpuszczalnika.

Jednakże, w obecności kwasu octowego wykształca się nowe, długofalowe pasmo emisji, którego maksimum zlokalizowane jest zwykle przy ok. 520 nm i które w dużym stopniu

odzwierciedla emisję formy izoalloksazynowej. Jednocześnie, w miarę wzrastającego stężenia kwasu octowego, intensywność emisji formy alloksazynowej obniża się na korzyść wzrastającej intensywności emisji formy izoalloksazynowej. W widmach emisji obserwuje się obecność jednego, dobrze zdefiniowanego punktu izoemisyjnego. W przypadku zastosowania pochodnych alloksazynowych z zablokowaną pozycją N(1) przez grupę alkilową, obserwuje się w tych samych warunkach eksperymentalnych, obecność wyłącznie emisji o charakterze alloksazynowym (111).

Badania czasowo - rozdzielcze dla lumichromu w acetonitrylu i dichlorometanie w funkcji wzrastającego stężenia kwasu octowego dowodzą, iż zmiana rozpuszczalnika istotnie wpływa na dynamikę zachodzących procesów. Zarejestrowane zaniki fluorescencji dla lumichromu w acetonitrylu i 1,2-dichloroetanie opisuje zadowalająco funkcja mono-wykładnicza.

Odpowiednie czasy zaniku fluorescencji wynoszą 0.64 ns oraz 0.61 ns. W acetonitrylu, w miarę wzrastającego stężenia kwasu octowego zanik fluorescencji obserwowany przy λem = 425 nm opisywany jest funkcją monowykładniczą z czasami życia zmieniającymi się od 0.64 ns (0 M kwasu octowego) do 0.37 ns (0.7 M kwasu octowego). Z kolei zanik fluorescencji obserwowany przy λ_em = 580 nm jest opisywany poprzez sumę monowykładniczego zaniku oraz monowykładniczego narastania. Wartości czasu zaniku formy alloksazynowej (λem = 425 nm) oraz czasu narastania obserwowanego przy λ_em

= 580nm są praktycznie jednakowe, dla przykładu przy stężeniu kwasu octowego 0.7 M τF formy alloksazynowej oraz czas narastania przy λ_em = 580 nm wynoszą odpowiednio po 0.37 ns oraz 0.35 ns. Stosunkowo długi czas narastania świadczy, iż proces przeniesienia protonu jest stosunkowo wolny a forma alloksazynowa stanowi prekursor formy izoalloksazynowej. Nieco bardziej skomplikowanie wygląda dynamika procesów obserwowanych w 1,2-dichloroetanie, mianowicie dla stężenia kwasu octowego od 0 M do 0.04 M stwierdzono monowykładniczy zanik zarówno dla formy alloksazynowej jak i izoalloksazynowej. Prawdopodobnie, w tym przypadku brak obecnego czasu narastania formy izoalloksazynowej wynika z możliwej zbyt krótkiej wartości, która nie mogła zostać zmierzona przy stosowanym układzie pomiarowym. Przy wyższych stężeniach kwasu octowego jest obserwowany również czas narastania formy izoalloksazynowej, którego wartość jest zbliżona do zaniku formy alloksazynowej, dla przykładu przy CAA = 0.7M, zarówno czas zaniku formy alloksazynowej jak i naratania formy izoalloksazynowej mają taką samą wartość równą 0.45 ns. Dodatkowo, interesujące rezultaty otrzymano przy obserwacji zaniku fluorescencji przy λem = 425 nm, mianowicie przy wyższych stężeniach kwasu octowego zaobserwowano obecność drugiego komponentu z czasem życia ok. 3-4 ns i

udziałem 1-2%. Wspomniana wartość czasu zaniku jest zbliżona do zaniku formy izoalloksazynowej. Prawdopodobnie jest to rezultat powstałej równowagi pomiędzy obydwoma wzbudzonymi formami lub nakładania się pasm formy izoalloksazynowej z alloksazynową (111).