Amidofosforanowe diestry 2′,3′-dideoksynukleozydów

Pionierem w dziedzinie amidofosforanowych pronukleotydów był Christopher McGuigan. Na początku lat 90. XX w. zaproponował wprowadzenie reszt aminokwasowych jako grup maskujących ładunek ujemny w fosforanodiestrach

z założeniem, że związki te, zawierające naturalne aminokwasy będą mniej cytotoksyczne.

Rys. 11. Struktury amidofosforanowych pronukleotydów zaproponowanych przez McGuigana i wsp.65

Początkowo zsyntetyzowano pochodne typu 53 (Rys. 11) zawierające oprócz 2′,3′-dideoksynukleozydu i reszty aminokwasowej, prostą lub modyfikowaną halogenami (F lub Cl) grupę alkilową. Związki te wykazywały średnie parametry terapeutyczne (EC50 = 3-50 μM), ale pozwoliły zaobserwować kilka prawidłowości, a mianowicie: (i) związki z bardziej zatłoczonymi sterycznie resztami aminokwasowymi wykazywały mniejszą aktywność antywirusową, (ii) długość łańcucha alifatycznego podstawnika miała wpływ na aktywność biologiczną związków.65-66 McGuigan i współpracownicy podczas opracowywania strategii pronukleotydów fosforanotriestrowych, w celu zwiększenia podatności wiązań estrowych na hydrolizę, zastosowali grupy trichloroetylowe oraz trifluoroetylowe, co w rezultacie wpłynęło korzystnie na właściwości biologiczne badanych związków (Rozdział IV.4.2.1.1.). Podobne podejście zastosowano w przypadku diestrów amidofosforanów, jednakże w tym przypadku nie obserwowano poprawy parametrów biologicznych. Spośród tej klasy pochodnych, w kontekście aktywności antywirusowej, wyróżnić można jedynie L-alaninowy amidofosforan AZT z estrową grupą -CH2CCl3, którego aktywność antywirusowa była tylko o rząd mniejsza niż samego nukleozydu i wynosiła 0,08 μM. Związek ten był 50-krotnie bardziej aktywny od jego etylowego i trifluoroetylowego odpowiednika. Przyczyna tych niespodziewanych różnic nie została jednak wyjaśniona.67

Kontynuując te badania zsyntetyzowano analogi posiadające w swojej strukturze fosforoestrowe grupy fenylowe (typ 54, Rys. 11), co korzystnie wpłynęło na profil aktywności takich pochodnych i przyczyniło się do rozwinięcia pronukleotydowej strategii znanej dziś pod nazwą ProTide. Koncepcja ta została zastosowana do wielu

fosforanów 2′,3′-dideoksynukleozydów stosowanych w terapii anty-HIV (AZT, d4T, 3TC, ABC), a także dla C-fosfonianów acyklicznych nukleozydów (PMEA i PMPA).

Jednymi z pierwszych analogów typu ProTide były pochodne AZT, których aktywność antywirusowa dla szczepów HIV-1 i HIV-2 była wyznaczona na zakażonych liniach komórkowych MT-4 i CEM. In vitro wszystkie zsyntetyzowane związki były efektywnymi inhibitorami wirusa. W tej grupie wyróżniał się analog zawierający niepodstawioną resztę fenylową oraz L-alaninę (Rys. 11), który w komórkach MT-4 wykazywał aktywność porównywalną (EC50 = 0,006 μM) z wolnym nukleozydem (EC50 = 0,002 μM). Wprowadzenie podstawników (-Me, -OMe, -F) w pozycję para pierścienia aromatycznego zmniejszyło 20-50-krotnie aktywność antywirusową wszystkich zsyntetyzowanych związków w porównaniu z AZT w komórkach MT-4. Zmiana w obrębie reszty aminokwasowej miała również duży wpływ na parametry biologiczne – wprowadzenie fenyloalaniny lub leucyny zamiast alaniny obniżało 40-70-krotnie parametry terapeutyczne tych pochodnych.68

Grupa McGuigana udowodniła pronukleotydowy mechanizm działania zaproponowanych pochodnych fosforanów AZT typu 54 badając inhibicję replikacji wirusa HIV w komórkach z deficytem kinazy tymidynowej CEM/TK-. Analogi zawierające alaninę i fenyloalaninę wykazywały aktywność antywirusową w tym medium (EC50 odpowiednio 3-12 μM oraz 10-13 μM), co wskazywało na uwalnianie monofosforanu nukleozydu w komórce.68a Otrzymane związki charakteryzowała nie tylko dobra aktywność antywirusowa, ale również, niska cytotoksyczność. Mając na uwadze powyższe podjęto badania nad modyfikowanymi fosforanami innych 2′,3′-dideoksynukleozydów oraz C-fosfonianami acyklicznych nukleozydów o analogicznej aranżacji grup maskujących resztę fosforanową.

Obiecujące wyniki otrzymano dla diestrów amidofosforanów d4T, pośród których wyróżniającą aktywność wykazywała pochodna L-alaniny, inhibująca 10-krotnie efektywniej replikację wirusa HIV w komórkach MT-4 niż wolny nukleozyd. Co więcej, ponad 5-krotnie zredukowana została toksyczność tej pochodnej d4T (CC50 >100 μM), co prowadziło do 50-krotnej poprawy indeksu selektywności (SI) amidofosforanu nukleozydu w porównaniu z samym nukleozydem. Dodatkowo, pochodna d4T typu 54 zachowała pełny potencjał antywirusowy w komórkach CEM/TK-, wykazując 400-krotnie wyższą aktywność niż d4T.69

Strategia ProTide była również rozwijana w kierunku syntezy oraz badania potencjału biologicznego pochodnej fenylowej L-alaniny 3TC typu 54. Aktywność antywirusowa tego związku była jednak znacznie niższa (EC50 = 2,5 μM vs EC50 = 0,01 μM dla 3TC), a wyniki badań biologicznych w komórkach z deficytem kinazy 2′-deoksycytydynowej CEM/dCK- (EC50 = 65 μM) dla wspomnianego analogu sugerowały, że prawdopodobnie nie działał on według pronukleotydowego mechanizmu.70

W 2001 roku grupa McGuigana opublikowała wyniki badań dotyczące syntezy oraz potencjału biologicznego pochodnych amidofosfonianowych acyklicznych nukleozydów PMEA i PMPA. Spośród tych analogów, 55a i 55b (Rys. 12) charakteryzowały się najbardziej korzystnymi parametrami terapeutycznymi.71 Obydwie pochodne typu 55 wykazywały zwiększoną aktywność antywirusową względem wyjściowych ANP. Amidofosfonian 55b 50-100-krotnie lepiej inhibował replikację wirusa HIV-1 w komórkach MT-4 w porównaniu z PMPA, podczas gdy związek 55a był 30-50-krotnie bardziej aktywny niż odpowiadający mu wyjściowy fosfonian. Jednocześnie, indeks selektywności wspomnianej pochodnej PMPA wzrósł 25-krotnie. Zaobserwowano również znacznie wyższą aktywność biologiczną analogów typu 55 zawierających naturalny enancjomer L-alaniny w porównaniu z izomerem D (5-30-krotny wzrost w przypadku PMPA i 30-60-krotny dla PMEA).68b,71

Rys.12. Amidofosfonianowe diestry PMEA i PMPA typu ProTide.71

Ukoronowaniem strategii ProTide było zarejestrowanie przez FDA w 2015 roku fumaranu alafenamidu tenofowiru (TAF, 56, Rys. 13), który jest drugim pronukloetydowym lekiem stosowanym w terapii anty-HIV. Razem z elwitegrawirem (inhibitor integrazy), kobicystatem (związek podawany w celu opóźnienia metabolizmu leków anty-HIV) oraz emtrycytabiną (nukleozydowy inhibitor RT) wchodzi w skład leku Genvoya®. TAF jest niejako ulepszoną wersją TDF, gdyż wykazuje mniejszą toksyczność, lepszą przenikalność przez błony komórkowe tkanek limfoidalnych oraz dostateczną

terapeutycznie efektywność inhibicji wirusa HIV przy stosowaniu mniejszych dawek leku.8,72

Rys. 13. TAF – fumaran alafenamidu tenofowiru, amidofosfonian zatwierdzony do stosowania klinicznego przez FDA.

Postulowany mechanizm działania pronukleotydów typu ProTide (związki o wzorze ogólnym 57) badany był przez różne grupy badawcze i przedstawiony jest na

Schemacie 11.

Schemat 11. Postulowany mechanizm uwalniania NMP w strategii pronukleotydowej ProTide. Zakłada się, że pronukleotyd 57 przenika w nienaruszonej formie do wnętrza komórki, gdzie następuje inicjowana przez karboksyesterazę hydroliza wiązania estrowego i wygenerowany zostaje nukleofilowy anion karboksylowy (pochodna 58). Następnie w wyniku wewnątrzcząsteczkowego ataku na atom fosforu powstaje pochodna 59 zawierająca niestabilny pięcioczłonowy pierścień oksazafosfolidyny, który ulega hydrolitycznemu otwarciu z utworzeniem dianionowego amidofosforanowego metabolitu 60. Prawdopodobnie pod wpływem działania enzymu fosforoamidazy

(np. HINT-1), następuje hydroliza wiązania amidofosforanowego P-N w tym związku, co prowadzi do uwolnienia ddNMP lub ANP.49a,50,68b,73 Udowodniono, że labilność wiązania P-N w amidofosfonianach jest większa niż w odpowiednich amidofosforanach. Może to powodować, że w pochodnych PMEA i PMPA typu ProTide wiązanie amidofosforanowe ulega spontanicznej hydrolizie, co w połączeniu z reakcją enzymatyczną efektywniej generuje ANP w komórce, przekładając się wprost na lepsze parametry aktywności antywirusowej tego typu pronukleotydów.71