Amidofosforanowe monoestry 2′,3′-dideoksynukleozydów

Grupa Wagnera zaproponowała amidofosforany monoestrów 2′,3′-dideoksynukleozydów jako kolejną klasę pronukleotydów zawierających wiązanie P-N. Co ciekawe, stanowią one grupę proleków z jedną grupą maskującą, a więc związków posiadających ładunek ujemny (61, Schemat 12). Strategia ta została wykorzystana do otrzymania szeregu pronukleotydów AZT, d4T czy ddA zawierających estry metylowe lub N-metyloamidy alifatycznych i aromatycznych aminokwasów.74

Proleki zaproponowane przez Wagnera i współpracowników posiadają jedną resztę aminokwasową jako grupę maskującą. Cząsteczki typu 61 według autorów powinny być wystarczająco lipofilowe, by przenikać przez błony komórkowe, ale też odpowiednio hydrofilowe (rozpuszczalne w wodzie), by zapewnić im należytą biodostępność w organizmie. W komórce pod wpływem enzymów (fosforoamidaz) odpowiedzialnych za hydrolizę wiązań P-N, istnieje możliwość uwalniania ddNMP (ścieżka A, Schemat 12).75 Możliwy jest również alternatywny, pronukleozydowy mechanizm działania tych związków, związany z działaniem wewnątrzkomórkowych fosfataz, które mogą przeprowadzać amidofosforan typu 61 w odpowiedni nukleozyd poprzez rozpad wiązania P-O (ścieżka B, Schemat 12). Grupa Wagnera udowodniła pronukleotydowy mechanizm działania odpowiedniego analogu AZT w ekstraktach komórkowych CEM i PBMC poprzez znakowanie izotopowe tlenem O18 reszty fosforanowej i analizę metabolitów za pomocą HPLC-ESI--MS/MS.76

Schemat 12. Amidofosforanowe pronukleotydy zaproponowane przez Wagnera i wsp. oraz mechanizm ich rozpadu.

Warto podkreślić, że wszystkie otrzymane pochodne typu 61 charakteryzowały się niską cytotoksycznością (CC50 > 100 μM).77 W niektórych przypadkach zaproponowane związki wykazywały większą aktywność antywirusową in vitro niż wyjściowe ddN. Na przykład analog typu 61 zawierający L-tryptofan i AZT, charakteryzował się 8-krotnie większą aktywnością biologiczną w porównaniu z macierzystym nukleozydem, nie będąc przy tym szkodliwym dla organizmu (ponad 10-krotnie mniejsza toksyczność w porównaniu do AZT). Ponadto, komórki PBMC zainfekowane wirusem HIV-1 traktowane w/w pochodną zawierały 4-krotnie więcej AZTMP niż te, którym podano AZT.77c,78 Warto również wspomnieć, że w medium RPMI/FCS, 9:1, v/v) pochodne 61 były zaskakująco stabilne (t1/2 = 6 dni) i nie obserwowano degradacji do ddNMP lub wolnego nukleozydu.77a,78 Dodatkowo, zauważono wyraźny wpływ rodzaju wiązania w reszcie aminokwasowej (amidowe vs estrowe) na parametry biologiczne. Zastosowanie amidu metylowego fenyloalaniny w pochodnej amidofosforanu AZT wpływało bardzo korzystnie na aktywność antywirusową – była ona 60-166-krotnie większa niż dla estru metylowego. Natomiast ta sama pochodna zawierająca resztę tryptofanu jako grupę maskującą, charakteryzowała się 2-5-krotnie mniejszą aktywnością metylowego amidu w porównaniu z estrem.77b

Grupa Kraszewskiego poszerzyła spektrum pronukleotydowych amidofosforanów monoestrów o kolejne pochodne zawierające różne aminy aromatyczne w cząsteczce 62 (Rys. 14), spośród których związki zawierające reszty 2-, 3-, 4-aminopirydyny wyróżniały się wyjątkowo wysoką aktywnością anty-HIV i bardzo niską cytotoksycznością.79

Rys. 14. Przykładowe amidofosforanowe monoestry 2′,3′-dedeoksynukleozydów zaproponowane przez Kraszewskiego i wsp.79

W warunkach hydrolizy chemicznej (RPMI) związki typu 62 wykazywały dużą trwałość (t1/2 > 6 dni), natomiast w medium zawierającym aktywność enzymatyczną (RPMI/FBS, 9:1, v/v) ulegały one powolnemu rozpadowi (22 h do kilku dni). Podczas analizy HPLC obserwowano ddN jako główny metabolit oraz ddNMP (produkt mniejszościowy). Te wyniki zasugerowały, że związki typu 62 mogą być rozkładane poprzez hydrolizę chemiczną lub enzymatyczną wiązania amidofosforanowego, do odpowiednich fosforanów 2′,3′-dideoksynukleozydów, które w medium zawierającym aktywność fosfatazową były szybko przekształcane do odpowiedniego ddN. W związku z wysoką stabilnością proponowanych pronukleotydów w medium zawierającym aktywność enzymatyczną, postulowano, że prawdopodobnie związki te docierają do komórki w niezmienionej formie.79

Wszystkie pochodne AZT typu 62 wykazywały wysoką aktywność antywirusową, a spośród nich na szczególną uwagę zasługuje analog 4-aminopirydynowy, którego indeks selektywności był niezwykle wysoki (SI > 182000; EC50 = 0,0011 μM; CC50 > 200 μM). Zsyntetyzowano również odpowiednie pochodne ddU, które poddano testom biologicznym, a ich obserwowana aktywność antywirusowa uprawdopodobniała pronukleotydowy mechanizm działania związków przedstawionych wzorem ogólnym 62 (Rys. 14).79

Wysoka aktywność biologiczna otrzymanych związków wskazywała na możliwość ich przenikania przez błonę komórkową, pomimo obecnego formalnego ładunku ujemnego na reszcie fosforanowej. Autorzy tłumaczyli to możliwością występowania tych analogów w środowisku wodnym nie tylko w formie zjonizowanej 62, ale również jako neutralne jony obojnacze (Rys. 15). Wydaje się, że kluczową rolę odgrywać tu może również pierścień pirydyny, który jest zarówno lipofilowy (obecność układu aromatycznego), jak i hydrofilowy (obecność atomu azotu).80

Rys. 15. Możliwe formy tautomeryczne protonowanych cząsteczek typu 62 na przykładzie pochodnej 4-aminopirydynylowej.

Zachęcona korzystnymi parametrami biologicznymi i fizykochemicznymi dla

pochodnych pirydynylowych amidofosforanów monoestrów

2′,3′-dideoksynukleozydów, grupa Kraszewskiego postanowiła poszerzyć badania o inne heterocykliczne aminy (aminochinoliny, aminocyjanopirydyny oraz aminotiazole) jako grupy maskujące reszty fosforanowe 63a-63c Rys. 16.80

Rys. 16. Różne warianty strukturalne amidofosforanów monoestrów 2′,3′-dedeoksynukleozydów wykorzystujące aminy heterocykliczne.80

Zsyntetyzowane zostały pochodne typu 63 z różnymi nukleozydami stosowanymi w terapii anty-HIV (AZT, d4T, ABC, 3TC). Różne położenie atomu azotu w izomerach chinolin oraz aminoizochinolin w analogach typu 63a wpływało znacząco na lipofilowość oraz stabilność chemiczną badanych amidofosforanów monoestrów. Warto zauważyć, że analogi te charakteryzują się dużo większą zawadą steryczną, co może mieć znaczący wpływ na ich aktywność biologiczną. Herdewijn i współpracownicy zaobserwowali, że niektóre 5′-amidofosforany nukleozydów mogą być używane jako substraty przez odwrotne transkryptazy HIV (RT) bez przekształcenia ich w odpowiednie trifosforany, a wariacje strukturalne w części amidowej mają fundamentalny wpływ na ich właściwości substratowe.81 Drugą grupę proponowanych heterocyklicznych amin stanowiły aminopirydyny z podstawnikiem nitrylowym 63b, który znacząco obniżał zasadowość całego ugrupowania. Trzecia grupa 63c (pochodne 2-aminotiazoli) została wybrana, by sprawdzić możliwości syntetyczne wybranej metody oraz wpływ tego rodzaju połączeń amidowych na parametry biologiczne.

Podobnie jak pochodne 62, zsyntetyzowane analogi 63 charakteryzowały się dużą stabilnością w RPMI (t1/2 > 5 dni) oraz powolnym rozpadem w medium wzbogaconym w aktywność enzymatyczną (RPMI/FBS, 9:1, v/v) – okres półtrwania do kilku dni. Większość pochodnych d4T, ABC i 3TC charakteryzowała się dużą trwałością w tych warunkach. Analiza HPLC, podobnie jak w przypadku pirydynylowych pronukleotydów, wykazywała powolną hydrolizę do ddNMP oraz ddN.80

Badania biologiczne wykazały również bardzo niską cytotoksyczność związków typu 63, przy jednoczesnej bardzo wysokiej aktywności anty-HIV rzędu nanomolarnego (EC50 = 1-20 nM). Najbardziej obiecującą grupę stanowiły pochodne izochinolin, cyjanopirydyn oraz 2-aminotiazolin (EC90 < 25 nM).80 Bardzo dobre parametry biologiczne badanych amidofosforanów monoestrów ddN wskazują, że są one wartościowymi kandydatami do dalszych badań nad ich wykorzystaniem w terapii anty-HIV.