Grupy maskujące hydrolizowane na drodze chemicznej

Idea fosforanotriestrowych pronukleotydów zakłada wprowadzenie do komórki fosforanotriestrów 2′,3′-dideoksynukleozydów, które po stopniowej hydrolizie uwalniać mają odpowiedni fosforanomonoester. Warto nadmienić, że w naturze właściwie nie występują fosforanotriestry, stąd też brak w komórce czy w surowicy krwi enzymów, które mogłyby katalizować hydrolizę wiązania estrowego w tego typu strukturach. Po wniknięciu do komórki pronukleotydowe fosforanotriestry muszą ulegać więc hydrolizie chemicznej do fosforanodiestrów, które z kolei wykazują dużą trwałość chemiczną i ich dalsze przekształcenie do monoestrów wymaga udziału fosfodiesteraz. Strategie, które bazują na uwalnianu niemaskowanego nukleotydu tylko na drodze chemicznej są raczej rzadkie.38a

Na początku lat 90. XX w. pojawiły się pierwsze publikacje dotyczące fosforanotriestrowych analogów nukleozydów zaprojektowanych jako potencjalne pronukleotydy anty-HIV. Grupa McGuigana zaproponowała początkowo proste alkilowe grupy maskujące resztę fosforanową, ale związki typu 14-16 (Rys. 4) w testach in vitro nie wykazywały jednak żadnej aktywności anty-HIV. Wyniki tych eksperymentów tłumaczono wysoką stabilnością chemiczną trialkilowych pochodnych fosforanów.40

Chcąc zwiększyć labilność grup maskujących resztę fosforanową, zsyntetyzowano również pochodne zawierające halogen (chlor lub fluor) w łańcuchu alkilowym. Analogi te (17 i 18, Rys. 4) wykazywały widoczną aktywność antywirusową, choć nadal stukrotnie niższą niż samo AZT (EC50 = 0,4 μM dla 18; EC50 = 0,004 μM dla AZT).41

Rys. 4. Alkilowe fosforanotriestry zaproponowane przez McGuigana i wsp.40-41

Szukając dalszych sposobów labilizacji wiązań estrowych, McGuigan i współpracownicy zaproponowali serię pochodnych arylowych fosforanotriestrów AZT (19-21, Rys. 5).42

Rys. 5. Arylowe fosforanotriestry zaproponowane przez McGuigana i wsp.42

W przypadku tych analogów nukleotydowych zaobserwowano korelację pomiędzy rodzajem podstawnika w pierścieniu aromatycznym a aktywnością anty-HIV. Związki zawierające silnie wyciągające grupy w pierścieniu arylowym (20 i 21, Rys. 5) charakteryzowały się aktywnością antywirusową zbliżoną do AZT (EC50 ≈ 0,0032 μM dla

20; EC50 = 0,008 μM dla AZT). Chcąc dowieść ich pronukleotydowego mechanizmu działania, zbadano potencjał terapeutyczny tych związków w komórkach z deficytem kinazy tymidynowej (CEM/TK-). Wyniki testów wykazały, że są one słabymi inhibitorami namnażania wirusa w środowisku pozbawionym kinazy tymidynowej, co wskazywało raczej na pozakomórkową chemiczno-enzymatyczną przemianę tych związków do odpowiedniego antywirusowego nukleozydu. Ponadto, analog 20 wykazywał wysoką toksyczność, co tłumaczono uwalnianiem szkodliwego p-nitrofenolu.42

Koncepcję arylowych fosforanotriestrów rozszerzyła grupa Kraszewskiego.43

Zastosowali oni dwa rodzaje ugrupowań arylowych maskujących reszty fosforanowe, mianowicie grupy pirydynylowe, których obecność wpłynęła korzystnie na rozpuszczalność takich związków w wodzie oraz ugrupowania arylowe wnoszące

element lipofilowości. Te ostatnie zawierały różne podstawniki w pierścieniu aromatycznym (m.in. -Br, -Cl, -CN), co pozwalało modulować trwałość wiązania estrowego tych związków (typ 22, Rys. 6).43

Rys. 6. Pronukleotydy diarylowe zaproponowane przez Kraszewskiego i wsp.43

W podejściu tym zsyntetyzowano kilkanaście analogów fosforanotriestrów różniących się aranżacją grup arylowych wokół centrum fosforowego, które następnie zostały przebadane pod kątem trwałości wiązań estrowych oraz aktywności biologicznej. Badania w medium hodowlanym RPMI dowiodły, że związki typu 22 uwalniały na drodze hydrolizy chemicznej fosforanodiester, który następnie w wyniku hydrolizy enzymatycznej (RPMI/FBS, 9:1, v/v) mógł generować pożądany 5′-monofosforan nukleozydu. Najlepszymi parametrami biologicznymi charakteryzowały się pochodne AZTMP zawierające w swojej strukturze tylko fosforoestrowe grupy pirydynylowe. Stwierdzono, że najkorzystniejsze uwalnianie odpowiedniego fosforanodiestru następowało w cząsteczkach, w których wartość pKa uwalnianego fenolu jest niższa od pKa niepodstawionego fenolu. Ponadto, potwierdzono pronukleotydowy mechanizm działania tego typu pochodnych syntezując również odpowiednie analogi ddUMP, które wykazywały znaczną aktywność anty-HIV.44 Nukleozyd ddU jako taki nie jest substratem dla kinazy tymidynowej i nie jest przekształcany w komórce do 5′-fosforanu ddU, i dalej do aktywnego biologicznie trifosforanu.44 Jeśli pronukleotyd zawierający ddU wykazuje aktywność biologiczną oznacza to, że związek taki dostarcza do komórki odpowiedni nukleotyd, który przy udziale kinaz jest fosforylowany do ddUTP, inhibitora syntezy wirusowego DNA.

Całkiem nową i zupełnie niezależną od działania enzymów koncepcję podejścia pronukleotydowego opracowała grupa Meiera, proponując pochodne cyklosaligenylowe fosforanów nukleozydów (cycloSal-NMP, 23, Schemat 5) jako potencjalne pronukleotydy.45 W przeciwieństwie do większości fosforanotriestrowych koncepcji pronukleotydowych, podejście cycloSal zostało zaprojektowane tak, by

uwalniać nukleotyd w komórce, poprzez kontrolowaną stopniową hydrolizę chemiczną (Schemat 5).46 Nukleofilowy atak wody na centrum fosforowe w 23 (etap A) prowadzi do rozerwania pierścienia 6-członowego i powstawania odpowiedniego estru benzylowego 24. Ten z kolei, ulega szybkiej hydrolizie do nukleotydu 8 (etap B), ułatwianej obecnością grupy hydroksylowej w pozycji orto pierścienia aromatycznego. Droga C wydaje się być mniej prawdopodobna biorąc pod uwagę wartości pKa grupy opuszczającej (alkohol benzylowy vs fenol).

Warto podkreślić, że w proponowanym podejściu cycloSal nie tworzą się cytotoksyczne metabolity (CC50 > 250 μM), a w przeciwieństwie do prawie wszystkich innych koncepcji, z cząsteczki pronukleotydu uwalniana jest tylko jedna grupa maskująca. Ponadto, cycloSal-NMP charakteryzują się lepszą lipofilowością w porównaniu do odpowiednich nukleozydów, co wpływa korzystnie na dyfuzję przez błony komórkowe oraz barierę krew-mózg (BBB, ang. blood-brain barrier), a jednocześnie wykazują dostateczną rozpuszczalność w wodzie.46

Schemat 5. Uwalnianie monofosforanu ddN z pronukleotydu cycloSal.

Dodatkowym atutem pronukleotydów typu cycloSal jest możliwość wprowadzenia podstawników do pierścienia aromatycznego, co pozwala sterować podatnością całego układu na hydrolizę chemiczną (podstawniki elektronoakceptorowe vs. elektronodonorowe). Umożliwiło to otrzymanie serii fosforanowych analogów nukleozydów o korzystnych parametrach terapeutycznych, m.in. pochodne AZT, d4T, ddA.

Efektywność podejścia cycloSal została przebadana in vitro dla pochodnych d4T, dla których widać było wyraźnie korelację pomiędzy strukturą a aktywnością

biologiczną. Im większa zdolność donowania elektronów do pierścienia aromatycznego przez podstawnik, tym obserwowana była wyższa aktywność anty-HIV. Pochodne 3- i 5-metylo-, podobnie jak 3,5-dimetylo-cycloSal-d4TMP wykazywały większą aktywność antywirusową (EC50 = 0,09 μM) niż d4T (EC50 = 0,18 μM). Dodatkowo, badania na liniach komórkowych z deficytem kinazy tymidynowej (CEM/TK-) dowiodły, że związki te uwalniają w komórce d4TMP, co potwierdza ich pronukleotydowy mechanizm działania. Stosując podobne grupy maskujące, otrzymano również serię pochodnych cycloSal-AZT. Jednakże niespodziewanie, analogi te okazały się nieaktywne lub słabo aktywne w komórkach z deficytem kinazy tymidynowej.47 Dalsze badania doprowadziły do wniosku, że obserwowane różnice w aktywności wspomnianych związków mogą być spowodowane większą podatnością AZTMP na defosforylację w porównaniu do d4TMP.48