Głównymi celami moich badań przedstawionych w niniejszej pracy doktorskiej było (i) zaprojektowanie różnych wariantów strukturalnych 5′-difosforanów 2′,3′-dideoksynukleozydów jako związków o potencjalnej aktywności anty-HIV, (ii) opracowanie uniwersalnej i wygodnej metody ich syntezy, (iii) oznaczenie parametrów aktywności anty-HIV dla otrzymanych difosforanów oraz (iv) wytypowanie związków o najlepszych parametrach terapeutycznych jako potencjalnych struktur wiodących (ang. lead compounds) do dalszych badań zmierzających do otrzymania nowych, skutecznych leków antyretrowirusowych.
Aby osiągnąć powyższe cele, przyjęłam następujące zadania cząstkowe mojej pracy:
Zaprojektowanie nowych pochodnych 5′-difosforanów
2′,3′-dideoksynukleozydów, posiadających różny rozkład podstawników i ładunków elektrycznych w części fosforanowej, jako potencjalnych terapeutyków anty-HIV;
Znalezienie optymalnej metody syntezy bazującej na chemii H-fosfonianów do otrzymania ww. związków oraz przeprowadzenie badań metodycznych w celu optymalizacji wybranej metody;
Opracowanie metody syntezy dla wprowadzenia heteroatomów (S i Se) w pozycję Pα lub Pβ wiązania bezwodnikowego w difosforanach;
Synteza różnie maskowanych 5′-difosforanów 2′,3′-dideoksynukleozydów i ich analogów, zawierających niemostkowe heteroatomy przy atomach fosforu Pα
lub Pβ (analogi siarkowe i selenowe), według wybranej, zoptymalizowanej metodyki;
Oznaczenie aktywności anty-HIV i cytotoksyczności otrzymanych pochodnych we współpracy z laboratoriami mikrobiologicznymi (Narodowy Instytut Leków, Warszawa oraz Rega Institute, Leuven);
Określenie trwałości chemicznej otrzymanych związków oraz ścieżek ich rozkładu w medium hodowlanym komórek RPMI-1640;
Określenie trwałości otrzymanych związków w medium hodowlanym komórek wzbogaconym w aktywność enzymatyczną surowicy bydlęcej (RPMI-1640/FBS, 9:1, v/v);
Próba korelacji oznaczonej aktywności anty-HIV ze strukturą i właściwościami chemicznymi (trwałością) badanych związków w świetle znanych molekularnych mechanizmów antyretrowirusowych;
Wytypowanie związków o korzystnych parametrach aktywności anty-HIV jako potencjalnych struktur wiodących do przyszłych badań.
Uzasadnienie podjętych badań
Właściwymi inhibitorami procesu odwrotnej transkrypcji podczas replikacji wirusa HIV są 5′-trifosforany odpowiednich 2′,3′-dideoksynukleozydów.27-28
Bezpośrednie podawanie takich związków osobie zakażonej jest jednak bezcelowe, gdyż jako ujemnie naładowane cząsteczki nie są one efektywnie transportowane przez błony komórkowe, co znacznie ogranicza ich biodostępność.37a-c Najprostszym rozwiązaniem mogłoby być podawanie dideoksynukleozydów, które in vivo ulegałyby fosforylacji do odpowiednich trifosforanów. Mimo, że takie podejście w wielu przypadkach faktycznie działa (np. AZT), okazało się jednak, że niektóre nukleozydy (np. ddU) będące fragmentem związków o bardzo wysokiej aktywności anty-HIV (np. 5′-trifosforan ddU), w komórkach praktycznie nie ulegają pierwszej fosforylacji do 5′-monofosforanu. Takie związki, podawane w formie wolnego nukleozydu, nie wykazują aktywności anty-HIV. 27-29 Stąd zrodziła się idea pronukleotydów – elektrycznie obojętnych fosforanów biologicznie aktywnych nukleozydów, w których ładunek elektryczny został zneutralizowany poprzez wprowadzenie grup ochronnych na reszty fosforanowe. Zgodnie z tą koncepcją, po wniknięciu cząsteczki pronukleotydu do komórki, grupy ochronne ulegają usunięciu (np. na drodze hydrolizy chemicznej i/lub enzymatycznej), co prowadzi do uwolnienia odpowiedniego 5′-monofosforanu nukleozydu. Ten z kolei, pod wpływem kinaz komórkowych, ulega stopniowej fosforylacji do 5′-trifosforanu 2′,3′-dideoksynukleozydu, właściwego związku anty-HIV.38a,39 Początkowo postulowano bezwzględną konieczność całkowitego maskowania ładunku w cząsteczce i w tym celu zaproponowano wiele strategii pronukleotydowych bazujących na estrach lub amidach jako grupach ochronnych dla funkcji 5′-fosforanowej 2′,3′-dideoksynukleozydów (np. badania grupy McGuigana,40-42 Imbacha,49 Kraszewskiego,43 Meiera45 i innych). Jednakże, na przestrzeni lat, coraz częściej obserwowano, że pewne typy pronukleotydów obdarzone ładunkiem ujemnym także efektywnie przenikają przez błony komórkowe i wykazują wysoką aktywność biologiczną (np. prace grupy Wagnera,75-77 Kraszewskiego79-80). Z jednej strony podważało to słuszność ogólnie akceptowanego postulatu o konieczności neutralizacji ładunku elektrycznego jako podstawowego kryterium efektywnego transportu pronukleotydów przez błony biologiczne, ale z drugiej otworzyło możliwości poszerzenia spektrum projektowanych pronukleotydów o nowe, zjonizowane warianty.
Strategia pronukleotydowa polegająca na dostarczaniu do komórki monofosforylowanych nukleozydów o znanej aktywności antywirusowej, nie rozwiązywała jednak całkowicie problemu efektywnego generowania aktywnego metabolitu (odpowiedniego 5′-trifosforanu), ponieważ tworzące się w komórce monofosforany 2′,3′-dideoksynukleozydów muszą ulegać enzymatycznej fosforylacji kolejno do di- i w końcu do trifosforanów. Fosforylacja difosforanów do odpowiednich trifosforanów zachodzi zwykle szybko i efektywnie, natomiast przekształcenie monofosforylowanego nukleozydu w odpowiedni difosforan, nie zawsze zachodzi łatwo (vide casus konwersji AZTMP do AZTDP). Wydawało się więc racjonalne spróbować dostarczać do komórek odpowiednie difosforany nukleozydów antywirusowych. Niestety, w literaturze znaleźć można tylko nieliczne doniesienia o polifosforanowych (di- i trifosforanowych) pronukleotydach ukierunkowanych na zwalczanie wirusa HIV. Początkowo niewielkie zainteresowanie taką strategią związane było prawdopodobnie z trudnościami syntetycznymi i wysoką labilnością wiązania bezwodnikowego w polifosforanach zawierających grupy blokujące na każdej reszcie fosforanowej. Wspomniane powyżej wyniki badań grupy Wagnera75-76,77b pozwoliły przypuszczać jednak, że polifosforanowe związki projektowane jako pronukleotydy zawierające ładunek elektryczny będą zarówno stabilne, jak i zdolne do przenikania przez błony komórkowe. Stąd też, wszystkie przedstawione w poprzednim rozdziale strategie polifosforanowych pronukleotydów dotyczyły związków posiadających co najmniej jeden ładunek ujemny w cząsteczce. Warto podkreślić, że pierwsze propozycje stosowania 5’-difosforanów nukleozydów jako potencjalnych proleków (np. badania grupy Hostetlera82 czy Huynh Dinha85) zakładały, że związki te będą generować w komórce odpowiednie 5′-monofosforany 2′,3′-dideoksynukleozydów, a nie 5′-difosforany. Dopiero grupa Meiera zaproponowała systemy ochronne pozwalające na uwalnianie w komórce ddNDP i ddNTP z odpowiednich polifosforanów (pronukleotydy typu DiPPro i TriPPPro)88b,88c,88e,89b. Kluczowe w tych podejściach okazało się wprowadzenie grup maskujących ładunek na resztach fosforanowych Pβ lub Pγ, które można było usuwać bez naruszania wiązania bezwodnikowego P-O-P.
Rozpoczynając realizację mojej pracy doktorskiej w Zakładzie Chemii Kwasów Nukleinowych IChB PAN, włączyłam się w badania nad projektowaniem nowych typów difosforanowych pronukleotydów jako potencjalnych terapeutyków anty-HIV.
Ponieważ, jak wspomniałam, enzymatyczna fosforylacja 5′-difosforanów nukleozydów do odpowiednich trifosforanów zachodzi łatwo, założyłam, że difosforany 2′,3′-dideoksynukleozydów będą dobrymi związkami modelowymi dla moich badań. Ze względu na wieloletnie doświadczenie naszego laboratorium w chemii H-fosfonianów, do otrzymywania różnych 5′-difosforanów 2′,3′-dideoksynukleozydów i ich analogów poszukiwałam nowych dróg syntetycznych opartych właśnie na tej metodologii.