PODSUMOWANIE

Głównym celem przedstawionej rozprawy doktorskiej było zaprojektowanie różnych wariantów strukturalnych 5′-difosforanów 2′,3′-dideoksynukleozydów oraz opracowanie uniwersalnej i wygodnej metody ich syntezy. Związki te, ze względu na obecność nukleozydów antywirusowych, otrzymywane były z myślą o potencjalnym wykorzystaniu w terapii anty-HIV.

Po zaprojektowaniu wariantów strukturalnych 5′-difosforanów 2′,3′-dideoksynukleozydów posiadających różne podstawniki i heteroatomy (S i Se), a także różny rozkład ładunków elektrycznych w części fosforanowej, spośród możliwych ścieżek syntetycznych układów polifosforanowych, wybrałam H-fosfoniany jako związki wyjściowe. Częściowo intuicyjnie zakładałam, że reakcja oksydatywnej kondensacji H-fosfonianomonoestrów z odpowiednimi P(V) nukleofilami może stanowić uniwersalną metodę syntetyczną pozwalającą otrzymywać różnorodne warianty strukturalne 5′-difosforanów 2′,3′-dideoksynukleozydów o potencjalnej aktywności anty-HIV. Zaletą stosowania metodologii H-fosfonianów jest korzystanie ze stabilnych substratów, które aktywowane w medium reakcyjnym tworzą reaktywne formy, pozwalające na otrzymywanie różnych pochodnych P(III), a potem P(V).

Na początku przeprowadziłam badania metodyczne w celu optymalizacji wybranej metody syntetycznej. Oksydatywna kondensacja przebiega z wytworzeniem reaktywnej fosfobetainy, która następnie zostaje poddana reakcji z badanym P(V) nukleofilem, tworząc odpowiedni polifosforan. Badania metodyczne podzieliłam na dwa etapy, odpowiadające kolejno na pytania: (i) jak poszczególne komponenty układu reakcyjnego (czynnik sililujący, utleniacz, katalizator nukleofilowy) wpływają na efektywność generowania fosfobetainy oraz (ii) czy istnieją różnicę w reaktywności fosfobetain względem różnych P(V) nukleofili, które miałam zamiar stosować w syntezie zaprojektowanych związków.

Stwierdziłam, że duży wpływ na tworzenie fosfobetainy (pirydyniofosforanu, P-Py) miał rodzaj zastosowanego czynnika sililującego (TMSCl vs BSA). Podczas badań okazało się, że zarówno jego rodzaj, jak i ilość są niezwykle istotne w tego typu reakcjach. Obserwowałam różnice w stabilności fosfobetainy P-Py w zależności od użytego czynnika sililującego, co wyjaśniłam reakcjami następczymi katalizowanymi produktami

rozkładu tych reagentów. W przypadku stosowania nadmiaru BSA następowały spontaniczne przemiany, które ostatecznie prowadziły do otrzymywania niepożądanego produktu – bissililowanego monofosforanu nukleozydu. Sprawdziłam również wpływ zastosowanego utleniacza na wydajność generowania fosfobetainy, jednakże w przypadku stosowanych czynników utleniających nie zaobserwowałam znaczących różnic. W kontekście badań metodycznych interesujące było dla mnie zweryfikowanie czy inne, obok powszechnie stosowanej pirydyny, zasady heterocykliczne oraz 3° aminy alifatyczne, mogą być wykorzystane jako katalizatory nukleofilowe dla tej reakcji. Badane przeze mnie aminy różniły się od siebie zawadą przestrzenną oraz obecnością podstawników elektronoakceptorowych lub elektronodonorowych. Czynniki te, jak się okazało, nie miały większego wpływu na generowanie samej fosfobetainy, były jednak niezwykle istotne podczas reakcji betainy ze słabymi nukleofilami, np. pochodnymi kwasu fosforowego (mono- i diestry) oraz nieorganicznym fosforanem. Po przeprowadzeniu serii eksperymentów wybrałam pirydynę jako optymalny katalizator nukleofilowy do otrzymywania 5′-difosforanów 2′,3′-dideoksynukleozydów. Użycie różnych fosfobetain (okso, seleno, tio) w połączeniu z różnymi P(V) nukleofilami (fosforany mono i diestry oraz ich siarkowe i selenowe odpowiedniki) pozwoliło, między innymi, na wprowadzenie heteroatomów (S i Se) w wybrane pozycje Pα lub Pβ wiązania bezwodnikowego.

Przeprowadzone prace metodyczne doprowadziły do opracowania skutecznej metody dla otrzymania z dobrymi wydajnościami pochodnych 5′-difosforanów 2′,3′-dideoksynukleozydów o różnych motywach strukturalnych na reszcie fosforanowej Pβ, jak również ich analogów zawierających niemostkowe heteroatomy (siarkę i selen) na resztach fosforanowych Pα lub Pβ. Strukturę otrzymanych związków potwierdziłam za pomocą spektrometrii mas oraz spektroskopii 1H, 13C, 31P NMR.

Zsyntetyzowane pochodne 5′-difosforanów zostały następnie przebadane pod kątem ich aktywności anty-HIV oraz cytotoksyczności we współpracy z laboratoriami mikrobiologicznymi (Narodowy Instytut Leków w Warszawie, Rega Institute w Leuven, Belgia). Duża grupa analogów zawierająca AZT okazała się być bardzo dobrymi inhibitorami replikacji wirusa HIV, efektywnymi już w stężeniach nanomolowych (EC50 < 10 nM). Co bardzo istotne, zdecydowana większość z nich nie wykazywała mierzalnej cytotoksyczności w badanych zakresach stężeń. Przypadki toksyczności

w badanych liniach komórkowych wykazywały głównie związki zawierające selen, co można przypisać możliwej deselenizacji z utworzeniem szkodliwego selenowodoru. Dodatkowo, obiecujące wyniki aktywności antywirusowej dla analogu nukleotydu ddU, wskazywała na pronukleotydowy mechanizmu działania tego typu pochodnych.

Kolejnym etapem badań było określenie trwałości chemicznej otrzymanych związków w medium hodowlanym komórek (RPMI) oraz w warunkach hydrolizy enzymatycznej w medium hodowlanym komórek wzbogaconym w aktywność enzymatyczną surowicy bydlęcej (RPMI/FBS, 9:1, v/v). Do badań wybrałam najbardziej aktywne biologicznie pochodne oraz takie, które zawierały interesujący mnie fragment strukturalny, mogący wpływać na kinetykę i sposób rozkładu danego związku. Eksperymenty te pozwoliły określić możliwe ścieżki rozpadu 5′-difosforanów w warunkach symulujących środowisko komórkowe, a otrzymane wyniki wskazują możliwe mechanizmy ich działania. Wszystkie z przebadanych analogów okazały się odporne na hydrolizę chemiczną (RPMI). Znaczące różnice w stabilności tych związków zaobserwowałam dopiero w układzie RPMI/FBS (9:1, v/v). Wszystkie pochodne tlenowe 5′-difosforanów wykazywały podobne czasy połowicznego rozkładu (w zakresie od 2 h do 9 h), natomiast duże różnice zanotowałam dla związków zawierających heteroatom w pozycji Pα i Pβ. Zaobserwowałam generalną tendencję wzmożonej trwałości wiązania pirofosforanowego dla związków, w których siarka lub selen znajdowały się w pozycji α (stabilne nawet po 7 dniach inkubacji), w przeciwieństwie do analogów zawierających heteroatom w pozycji β, których trwałość była zbliżona do analogów tlenowych difosforanów.

Otrzymane wyniki aktywności w połączeniu z przeprowadzonymi badaniami trwałości pozwoliły na próbę korelacji ich struktury z możliwymi mechanizmami molekularnymi działania tych związków. Badane związki mogą działać w zasadzie według trzech mechanizmów: pronukleozydowego (generowanie AZT), pronukleotydowego (generowanie AZTMP lub AZTDP) lub bezpośredniej inhibicji odwrotnej transkryptazy przez niezmieniony związek. Patrząc na ścieżki rozpadu wybranych 5′-difosforanów nie możemy zakładać jednego mechanizmu ich działania w komórce. Można przypuszczać, że dla związków z krótkim czasem połowicznego rozkładu w RPMI/FBS (kilka godzin), najbardziej prawdopodobny mechanizm działania to mechanizm pronukleozydowy lub pronukleotydowy. Wyniki eksperymentów z użyciem difosforanów ddU wskazują, że

udział tego ostatniego, może być znaczny. Dla hydrolitycznie trwałych związków (t1/2

kilka dni w RPMI/FBS), nie można wykluczyć inhibicji odwrotnej transkryptazy albo innego ważnego dla wirusa enzymu, jako mechanizmu działania.

Moje badania pokazały, że z punktu widzenia struktury, decydujący wpływ na wysoką aktywność anty-HIV 5′-difosforanów 2′,3′-dideoksynukleozydów ma obecność heteroatomu (siarki lub selenu) w części pirofosforanowej oraz obecność ładunku ujemnego na reszcie fosforanowej Pα. W tym kontekście wpływ grup maskujących funkcję fosforanową Pβ jest z reguły mały, chyba, że grupa taka wprowadza znaczną zawadę przestrzenną. Obecność heteroatomu w pozycji niemostkowej funkcji fosforanowej Pα zwiększa odporność difosforanów nukleozydów na hydrolizę enzymatczną, natomiast związki posiadające heterotom w pozycji Pβ, mają zwykle czasy połowicznego rozkładu w RPMI/FBS porównywalne do okso-difosforanów. Powyższe obserwacje mogą być użyteczne przy projektowaniu nowych leków anty-HIV w oparciu o 5′-difosforany 2′,3′-dideoksynukleozydów.

Na koniec pragnę podkreślić, że reakcja oksydatywnej kondensacji H-fosfonianomonoestrów z P(V) nukleofilami stanowi szczególnie użyteczne narzędzie w syntezie 5′-difosforanów 2′,3′-dideoksynukleozydów. Opracowana metoda zapewniła wydajne otrzymywanie różnorodnych strukturalnie pochodnych, co po wykonaniu badań biologicznych i trwałości pozwoliło na wyselekcjonowanie związków o największym potencjale terapeutycznym. Związki te stanowią obiecującą grupę kandydatów na nowe leki anty-HIV w terapii AIDS.

VII. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA