Analiza modyfikacji epigenetycznych chromatyny w obrębie wybranych genów z

W celu określenia zmian w poziomie modyfikacji epigenetycznych białek histonowych w obrębie poszczególnych genów, w odpowiedzi na stres herbicydowy posłużyłam się techniką ChIP (ChIP, ang. Chromatin ImmunoPrecypitation) (Haring i in. 2007).

Materiały i metody

Rysunek 23. Schemat analizy zmian w poziomie modyfikacji białek histonowych w obrębie genu w odpowiedzi na warunki stresowe.

5.7.1. Blokowanie białek Protein A Agarozy

• Pobrałam 1 ml komercyjnie dostępnej zawiesiny kulek agarozy zszytych z rekombinowanym białkiem A/G w formie 50% v/v zawiesiny;

• po tym jak kulki opadły usunęłam supernatant i przemyłam 1 ml buforem TE; • ponownie poczekałam aż kulki opadną i zebrałam supernatant;

• czynność przemywania kulek agarozowych powtórzyłam jeszcze dwukrotnie; • zawiesiłam kulki agarozowe w 1 ml buforu TE z BSA i DNA ze spermy śledzia

o stężeniu 10 µg/ml każde;

• dodałam azydku sodu do końcowego stężenia 0,05% v/v i inkubowałam przez 16 h, 4°C, delikatnie mieszając (12 rpm);

• przechowywałam w 4°C.

5.7.2. Chemiczne zszywanie komponentów chromatyny w materiale roślinnym • 2 g materiału roślinnego (liście) umyłam z wykorzystaniem wody destylowanej; • przeniosłam liście do probówek na 50 ml i dodałam 30 ml buforu do izolacji A

i przykryłam gąbką tak, aby wszystkie liście były zanurzone; • podłączyłam próżnię na 10 min., temperatura pokojowa; • powoli zwalniałam próżnię, ciągle wytrząsając;

• usunęłam gąbkę i dodałam 2,5 ml 2 M glicyny dokładnie i delikatnie wymieszałam w celu zastopowania reakcji;

• podłączyłam próżnię na 5 min., temperatura pokojowa; • powoli zwalniałam próżnię, ciągle wytrząsając;

• liście dokładnie, trzykrotnie przepłukałam na sitku z użyciem 0,5 l wody za każdym razem;

• liście dokładnie osuszyłam w ręczniku papierowym, a następnie umieściłam w probówce na 50 ml i szybko zamroziłam w ciekłym azocie;

• przechowywałam w -80°C.

5.7.3. Izolacja jąder komórkowych

• Liście zamrożone w -80°C zhomogenizowałam z użyciem piasku w moździerzu z ciekłym azotem;

• do zmrożonej probówki na 50 ml dodałam 30 ml (0°C) buforu do izolacji B i zhomogenizowany materiał roślinny;

• inkubowałam 15 min., 4°C, delikatnie mieszając;

• przefiltrowałam zawiesinę przez 4 warstwy Miracloth do nowej, zmrożonej probówki na 50 ml i wirowałam 20 min., 2 880 g, 4°C;

• ostrożnie zdekantowałam, a osad ponownie zawiesiłam w 1 ml (0°C) buforu do izolacji C;

• przeniosłam zawiesinę do probówki na 1,5 ml i wirowałam 10 min., 12 000 g, 4°C; • zdekantowałam, a osad ponownie zawiesiłam w 300 µl (0°C) buforu do izolacji D; • do nowej probówki na 2 ml dodałam 1500 µl (0°C) buforu do izolacji D

i nałożyłam ostrożnie na jego powierzchnię powyżej opisaną zawiesinę; • wirowałam 1 h, 16 000 g, 4°C.

5.7.4. Sonikacja chromatyny

• Zdekantowałam, po wirowaniu opisanym w poprzednim punkcie;

• osad zawiesiłam ponownie w 320 µl (0°C) buforu do lizy jąder komórkowych; • pobierano 10 µl tej zawiesiny i przechowałam na lodzie, stanowi ona „nieokrojoną”

Materiały i metody

• pozostałą próbkę sonikowałam z wykorzystaniem sonikatora Sonics VibraCell VCX 130 na lodzie w pulsach po 15 s z amplitudą 40%, z przerwami na chłodzenie w lodzie po 30 s, 6 cykli, aby otrzymać fragmenty długości 500 - 1000 pz

• wirowałam 5 min., 16 000 g, 4°C w celu osadzenia nierozpuszczalnych fragmentów;

• przeniosłam supernatant do nowej probówki i pobrałam 10 µl w celu sprawdzenia wydajności sonikacji;

• do próbek „nieokrojonej” i „sonikowanej” chromatyny (10 µl każda) dodałam: o 140 µl TE

o 5 µl 5 M NaCl o 5 µl 20% SDS

• następnie prowadziłam rozszywanie tych dwóch próbek 65°C, przez 16 h.

5.7.5. Oczyszczanie chromatyny

• Dodawałam kolejno do probówki na 2 ml na lodzie:

o 300 µl chromatyny (uzyskanej w poprzednim etapie), o 1660 µl (0°C) buforu do inkubacji Ab ChIP,

o 40 µl przepłukanych i blokowanych kulek Protein A Agarozy;

• z tak przygotowanego roztworu pobrałam 55 µl i przechowywałam na lodzie jako „próbkę wsadową” (ang. input sample);

• pozostałą chromatynę inkubowałam 1 h, 4°C, delikatnie mieszając (12 rpm).

5.7.6. Immunostrącanie

• Inkubowaną w poprzednim punkcie chromatynę wirowałam 1 min., 2 300 g, 4°C, w celu osadzenia kulek agarozowych;

• do 4 nowych probówek na 1,5 ml przeniosłam po 460 µl roztworu;

• jedna z nich stanowiła kontrolę „bez przeciwciała’ (NoAb), pozostałe trzy służyły do strącania z przeciwciałem (IP);

• do każdej probówki dodałam:

o 430 µl (0°C) buforu do inkubacji Ab ChIP, o 20 µl kulek Protein A Agarozy;

• proporcjonalnie dodałam objętość preimmunizowanego lub blokującego serum do probówki NoAb;

• dodałam do wszystkich probówek 20 µl kulek Protein A Agarozy; • inkubowałam przez 16 h, 4°C, delikatnie mieszając;

• wirowałam 2 min., 400 g, 4°C, w celu osadzenia kulek;

• przemyłam 1 raz buforem o niskim stężeniu soli i inkubowałam 10 min., 4°C, delikatnie mieszając;

• wirowałam 1 min., 400 g, 4°C, w celu osadzenia kulek i dekantowałam;

• przemyłam 1 raz buforem o wysokim stężeniu soli i inkubowałam 10 min., 4°C, delikatnie mieszając;

• wirowałam 1 min., 400 g, 4°C, w celu osadzenia kulek i dekantowałam;

• przemyłam 1 raz buforem LiCl i inkubowałam 10 min., 4°C, delikatnie mieszając; • wirowałam 1 min., 400 g, 4°C, w celu osadzenia kulek i dekantowałam;

• przemyłam 1 raz buforem TE i inkubowałam 10 min., 4°C, delikatnie mieszając; • wirowałam 1 min., 400 g, 4°C, w celu osadzenia kulek i dekantowałam;

• przemyłam ponownie 1 raz buforem TE i inkubowałam 10 min., 4°C, delikatnie mieszając;

• wirowałam 1 min., 400 g, 4°C, w celu osadzenia kulek i dekantowałam; • dodałam 250 µl buforu elucyjnego ChIP;

• szybko zmieszałam i inkubowałam 15 min., 65°C, delikatnie mieszając;

• wirowałam 2 min., 3 500 g, temperatura pokojowa, w celu osadzenia kulek agarozowych;

• przeniosłam supernatant do nowej probówki i dodałam 250 µl buforu elucyjnego ChIP;

• szybko zmieszałam i inkubowałam 15 min., 65°C, delikatnie mieszając;

• wirowałam 2 min., 3 500 g, temperatura pokojowa, w celu osadzenia kulek agarozowych i zebrałam supernatant;

• połączyłam zebrane supernatanty.

5.7.7. Rozszywanie chromatyny

• Do każdej z probówek nazwanej w poprzednich etapach IP i NoAb dodałam 20 µl 5 M NaCl;

Materiały i metody

• do probówki „wsadowej” (ang. input z punktu oczyszczanie chromatyny) dodałam: o 100 µl buforu TE,

o 6,5 µl 5 M NaCl, o 8 µl 20% SDS;

• inkubowałam w celu przeprowadzenia rozszycia chromatyny przez 16 h, 65°C.

5.7.8. Izolacja DNA

• Do uzyskanego w poprzednim etapie roztworu dodawałam 1 objętość fenolu i wytrząsałam 1 500 rpm, 2 min., temperatura pokojowa;

• wirowałam 2 min., 13 000 g, temperatura pokojowa;

• górną fazę, wodną przeniosłam do nowej probówki i ponownie dodałam 1 objętość fenolu i wytrząsałam 1 500 rpm, 2 min., temperatura pokojowa;

• wirowałam 2 min., 13 000 g, temperatura pokojowa;

• górną fazę, wodną przeniosłam do nowej probówki i dodałam 1 objętość chloroformu i alkoholu izoamylowego (w stosunku 24:1), wytrząsałam 1 500 rpm, 2 min., temperatura pokojowa;

• wirowałam 2 min., 13 000 g, temperatura pokojowa;

• zebrałam górną fazę wodną i przeniosłam do nowej probówki, a następnie dodałam o 1/10 objętości octanu sodu i 3 objętości 96% etanolu;

• DNA wytrącałam przez 16 h, -20ºC • wirowałam 30 min., 18 000 g, 4°C;

• osad przemywałam 75% etanolem i wirowałam 5 min., 18 000 g, temperatura pokojowa;

• osad dokładnie osuszyłam i rozpuściłam w 40 µl wody wolnej od nukleaz;

• spektrofotometrycznie oznaczyłam stężenie roztworu DNA przy długości fali λ=260 nm;

• roztwór DNA rozporcjowałam i wykonałam rozcieńczenia (1, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50), a następnie zamroziłam w -20°C.

5.7.9. Analiza poziomu obecności znaczników epigenetycznych

W celu określenia ilości danego znacznika epigenetycznego w białkach histonowych w obrębie sekwencji badanego genu wykonałam analizę poziomu ekspresji tego genu

z wykorzystaniem techniki rtPCR zgodnie z opisem w punkcie 5.4.4. Analizy obliczeniowej i statystycznej uzyskanych poziomów ekspresji dokonałam zgodnie z opisem w punkcie 5.4.5 i z zaleceniami literaturowymi (Livak i in. 2001).