Przygotowanie materiału biologicznego do analizy zmian poziomu ekspresji genów

Pierwszym etapem analizy zmian poziomu ekspresji genów pod wpływem warunków stresowych była izolacja całkowitego RNA ze wszystkich badanych roślin. Z opisanych roślin kontrolnych i traktowanych herbicydami zbierałam materiał roślinny w dniu 0 i 7., homogenizowałam i zamrażałam w ciekłym azocie. Z tak przygotowanych, homogennych próbek materiału biologicznego izolowałam całkowity RNA na potrzeby eksperymentu mikromacierzowego. Następnie oczyszczałam całkowity RNA za pomocą DNazy I w celu usunięcia DNA z próbek. Średnia wydajność izolacji całkowitego RNA wynosiła 250µg z grama liści. Zauważyłam, że materiał izolowany z liści roślin poddawanych warunkom stresowym wykazywał nieco gorszą jakość, poziom degradacji RNA był zauważalnie wyższy. Zjawisko to mogło wynikać z faktu, że całkowity RNA był izolowany również z liści ze zmianami, w których następowała śmierć komórek i co za tym idzie intensywna degradacja RNA. Ze względu na obniżoną jakość izolowanego całkowitego RNA z materiału roślinnego kukurydzy poddawanej warunkom stresowym postanowiłam nie analizować zmian w poziomie ekspresji genów metodą mikromacierzową, w dniu 14. po zastosowanym zabiegu traktowania herbicydem. Podjęłam próby uzyskania całkowitego RNA z liści linii wrażliwej w dniu 14., w wyniku których otrzymałam próbki o wysokim poziomie degradacji. Uzyskiwany materiał RNA nie kwalifikował się do wykorzystania w eksperymencie mikromacierzowym (Solinska i in. 2004).

W pierwszej kolejności, oczyszczony całkowity RNA poddawałam pomiarowi spektrofotometrycznemu w celu oznaczenia stężenia próbki. Następnie rozdzielałam je z wykorzystaniem techniki elektroforezy kapilarnej. Poniżej przedstawiłam wygenerowane przez aparat Agilent2000 elektroforogramy rozdziału dla poszczególnych próbek całkowitego RNA (Rysunki 26-29). Do dalszej analizy zakwalifikowałam próbki, które osiągały współczynnik RIN powyżej 7 w skali 1 do 10, gdzie 10 oznacza najwyższą jakość

RNA (próbka niezdegradowana). Zalecana do stosowania w eksperymentach mikromacierzowych jakość RNA powinna mieć wartość RIN powyżej 8. Wartość współczynnika RIN>8 stosowana jest dla próbek eukariotycznych np. przy analizie transkryptomu człowieka, czy myszy. Komórki roślinne posiadają dużą ilość półautonomicznych organelli komórkowych, jak mitochondria i plastydy, które posiadają rRNA o niższej masie cząsteczkowej niż rRNA cytoplazmatyczny. Obecność rRNA pochodzenia plastydowego wpływa na obliczoną przez aparat wartość współczynnika RIN. rRNA plastydowe kwalifikowane są jako obraz degradacji RNA i tym samym obniżają jego wartość (Schroeder i in. 2006).

Wyniki i dyskusja

Rysunek 26. Obraz rozdziału z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnej próbek całkowitego RNA, wykorzystanych w kolejnych etapach eksperymentu mikromacierzowego w dniu 0, pierwsze powtórzenie biologiczne. Od lewej: L – marker wielkości (od dołu prążki odpowiadają długościom cząsteczek RNA: 25 nt, 200 nt, 500 nt, 1000 nt, 2000 nt, 4000 nt), KSL – kontrolna linia wrażliwa na działanie Roundup, SL - linia wrażliwa na działanie Roundup poddana stresowi, KTL – kontrolna linia tolerancyjna na działanie Roundup, TL - linia tolerancyjna na działanie Roundup poddana stresowi, KSL – kontrolna linia wrażliwa na działanie Titus, SL - linia wrażliwa na działanie Titus poddana stresowi, KTL – kontrolna linia tolerancyjna na działanie Titus, TL - linia tolerancyjna na działanie Titus poddana stresowi, KSL – kontrolna linia wrażliwa na działanie Basta, SL - linia wrażliwa na działanie Basta poddana stresowi, KTL – kontrolna linia tolerancyjna na działanie Basta, TL - linia tolerancyjna na działanie Basta poddana stresowi.

Rysunek 27. Obraz rozdziału z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnej próbek całkowitego RNA, wykorzystanych w kolejnych etapach eksperymentu mikromacierzowego w dniu 7., pierwsze powtórzenie biologiczne. Od lewej: L – marker wielkości (od dołu prążki odpowiadają długościom cząsteczek RNA: 25 nt, 200 nt, 500 nt, 1000 nt, 2000 nt, 4000 nt), KSL”7” – kontrolna linia wrażliwa na działanie Roundup, SL”7” - linia wrażliwa na działanie Roundup poddana stresowi, KTL”7” – kontrolna linia tolerancyjna na działanie Roundup, TL”7” - linia tolerancyjna na działanie Roundup poddana stresowi, KSL”7” – kontrolna linia wrażliwa na działanie Titus, SL”7” - linia wrażliwa na działanie Titus poddana stresowi, KTL”7” – kontrolna linia tolerancyjna na działanie Titus, TL”7” - linia tolerancyjna na działanie Titus poddana stresowi, KSL”7” – kontrolna linia wrażliwa na działanie Basta, SL”7” - linia wrażliwa na działanie Basta poddana stresowi, KTL”7” – kontrolna linia tolerancyjna na działanie Basta, TL”7” - linia tolerancyjna na działanie Basta poddana stresowi.

Wyniki i dyskusja

Rysunek 28. Obraz rozdziału z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnej próbek całkowitego RNA, wykorzystanych w kolejnych etapach eksperymentu mikromacierzowego w dniu 0, drugie powtórzenie biologiczne. Od lewej: L – marker wielkości (od dołu prążki odpowiadają długościom cząsteczek RNA: 25 nt, 200 nt, 500 nt, 1000 nt, 2000 nt, 4000 nt), KSL – kontrolna linia wrażliwa na działanie Roundup, SL - linia wrażliwa na działanie Roundup poddana stresowi, KTL – kontrolna linia tolerancyjna na działanie Roundup, TL - linia tolerancyjna na działanie Roundup poddana stresowi, KSL – kontrolna linia wrażliwa na działanie Titus, SL - linia wrażliwa na działanie Titus poddana stresowi, KTL – kontrolna linia tolerancyjna na działanie Titus, TL - linia tolerancyjna na działanie Titus poddana stresowi, KSL – kontrolna linia wrażliwa na działanie Basta, SL - linia wrażliwa na działanie Basta poddana stresowi, KTL – kontrolna linia tolerancyjna na działanie Basta, TL - linia tolerancyjna na działanie Basta poddana stresowi.

Rysunek 29. Obraz rozdziału z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnej próbek całkowitego RNA, wykorzystanych w kolejnych etapach eksperymentu mikromacierzowego w dniu 7., drugie powtórzenie biologiczne. Od lewej: L – marker wielkości (od dołu prążki odpowiadają długościom cząsteczek RNA: 25 nt, 200 nt, 500 nt, 1000 nt, 2000 nt, 4000 nt), KSL”7” – kontrolna linia wrażliwa na działanie Roundup, SL”7” - linia wrażliwa na działanie Roundup poddana stresowi, KTL”7” – kontrolna linia tolerancyjna na działanie Roundup, TL”7” - linia tolerancyjna na działanie Roundup poddana stresowi, KSL”7” – kontrolna linia wrażliwa na działanie Titus, SL”7” - linia wrażliwa na działanie Titus poddana stresowi, KTL”7” – kontrolna linia tolerancyjna na działanie Titus, TL”7” - linia tolerancyjna na działanie Titus poddana stresowi, KSL”7” – kontrolna linia wrażliwa na działanie Basta, SL”7” - linia wrażliwa na działanie Basta poddana stresowi, KTL”7” – kontrolna linia tolerancyjna na działanie Basta, TL”7” - linia tolerancyjna na działanie Basta poddana stresowi.

Zgromadzony materiał wyizolowany z dwóch powtórzeń biologicznych w celu uzyskania cDNA, przepisałam RNA z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy na cDNA, które następnie znakowałam barwnikami fluorescencyjnymi Cy3 i Cy5. Po każdym z etapów analizowałam stężenie uzyskanego materiału, w celu użycia do reakcji takich

Wyniki i dyskusja

samych ilości znakowanego cDNA. Taka powtarzalność pozwalała mi na zminimalizowanie ryzyka wystąpienia zmienności w ekspresji genów, wynikającej z błędu technicznego - dodania różnych ilości wyznakowanego cDNA na płytkę macierzową (Hegde i in. 2000).

6.2.2. Analiza zmian w poziomie ekspresji genów z wykorzystaniem techniki