Analiza wpływu czynników aktywnych herbicydów na wydajność wiązania aa-tRNA do

Celem przeprowadzonych działań było uzyskanie aktywnego układu translacyjnego z badanego materiału roślinnego i analiza zmian jego aktywności pod wpływem czynnika stresowego (Bakowska-Zywicka i in. 2008).

Rysunek 25. Schemat analizy zmian w poziomie wiązania aa-tRNA do rybosomu na matrycy poliU w odpowiedzi na czynniki stresowe.

5.9.1. Izolacja tRNA

Celem metody było otrzymanie fenyloalaninowego transferowego kwasu rybonukleinowego (tRNA^Phe) pozbawionego zanieczyszczeń w postaci innych kwasów rybonukleinowych (RNA) i deoksyrybonukleinowych (DNA), białek i polisacharydów. Otrzymane tRNA powinno się cechować niskim stopniem degradacji i wysoką specyficznością mierzoną w reakcji aminoacylacji tRNA.

• 250 g liści kukurydzy zamrożonych w -70°C zmieliłam i dodałam 1 l buforu ekstrakcyjnego, 500 ml fenolu i 500 ml chloroformu;

• całość wytrząsałam kilka razy i pozostawiłam do odstania;

• zebrałam górną warstwę (wodną) i dodałam do niej mieszaninę fenol/chloroform w ilości 1/2 objętości fazy wodnej, a następnie wytrząsałam;

• ponownie zebrałam górną warstwę (wodną), dodałam chloroformu w ilości 1/2 objętości zebranej fazy wodnej i energicznie wytrząsałam;

• etap ekstrakcji z chloroformem powtarzałam kilkakrotnie do zaniku interfazy; • zebraną wodną warstwę strąciłam 3 objętościami 96% etanolu i w obecności 1/10

objętości octanu potasu, pH 5,2; • przechowywałam w -20°C przez 16 h;

• osad rozpuściłam w wodzie wolnej od nukleaz i ponownie wirowałam 8 000 g, 10 min., w celu oddzielenia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń towarzyszących RNA;

• supernatant o znanym stężeniu i ilości NA, zawiesiłam w DEAE-Celulozie.

5.9.2. Oczyszczanie tRNA na DEAE-Celulozie

Przed rozpoczęciem procesu izolacji, DEAE-Celulozę, która jest wypełnieniem kolumny do oczyszczania tRNA, należy zregenerować. W tym celu umieściłam DEAE-Celulozę na lejku i przemywałam kolejno: wodą destylowaną (30 min.), 0,5 M HCl (20 min.), wodą destylowaną (doprowadzając do pH 7,0), 96% etanolem. Do przemywania ponownie zastosowałam wodę destylowaną, a następnie 0,5 M NaOH (20 min.) oraz wodą destylowaną (doprowadzając do pH 7,0). Tak przygotowaną DEAE-Celulozę zastosowałam do oczyszczania tRNA zgodnie z opisem:

• supernatant pochodzący z izolacji tRNA zawiesiłam w DEAE-Celulozie według proporcji 50-100 A₂₆₀/ml celulozy;

• po 24 h przełożyłam całość na lejek piankowy i zebrałam przesącz; • przemyłam celulozę 0,25 M roztworem NaCl do wartości A260 = 0,001; • celulozę zawiesiłam na 24 h w 1 M NaCl;

• całość ponownie przełożyłam na lejek piankowy, przesączyłam i przemyłam DEAE-Celulozę małymi porcjami (po 50 ml) 1 M NaCl;

• każdorazowo mierzyłam A260 i na tej podstawie zebrałam frakcje RNA (o najwyższej wartości A260);

• DEAE-Celulozę przemywałam dalej 1 M NaCl w celu jej regeneracji;

• zebrane frakcje strąciłam 3 objętościami 96% etanolu w obecności 1/10 objętości octanu potasu (pH 5,2) i pozostawiłam na 16h, -20^oC;

• osad, zawierający surowy niskocząsteczkowy RNA, odwirowałam, wysuszyłam na lodzie i rozpuściłam w jak najmniejszej objętości wody wolnej od nukleaz, a następnie nanosiłam na kolumnę z BD-Celulozy.

5.9.3. Oczyszczanie tRNA na BD-Celulozie

Oczyszczanie na BD-Celulozie ma na celu rozdział otrzymanej mieszaniny tRNA na poszczególne frakcje odpowiadające specyficznym transferowym RNA.

Materiały i metody

• Kolumnę o wymiarach 2,6 x 90 cm wypełnioną BD-Celulozą; przemywałam buforem Bufor do oczyszczania tRNA na kolumnie z BD-celulozy I i naniosłam ok. 6000 A260 (10 µmoli) preparatu oczyszczonego wcześniej na DEAE-celulozie; • w celu rozdziału tRNA wykorzystałam liniowy gradient stężenia NaCl

w następującej kolejności stosowanych buforów:

o bufor do oczyszczania tRNA na kolumnie z BD-celulozy I i bufor do oczyszczania tRNA na kolumnie z BD-celulozy II w ilości 10 razy większej niż objętość robocza kolumny,

o bufor do oczyszczania tRNA na kolumnie z BD-celulozy II i bufor do oczyszczania tRNA na kolumnie z BD-celulozy III w ilości 5 razy większej niż objętość robocza kolumny;

• objętość zbieranych frakcji wynosiła 1 ml przy prędkości przepływu przez kolumnę 1 ml/10 min;

• zawartość tRNA śledziłam w co dziesiątej frakcji przez pomiar absorbancji przy długości fali λ = 260 nm;

• specyficzność oczyszczonego tRNA sprawdziłam przeprowadzając reakcję aminoacylacji co dziesiątej frakcji;

• frakcje o najwyższej zawartości tRNA^Phe strąciłam 3 objętościami 96% etanolu, odwirowałam 8000 g, 10 min. i rozpuściłam w jak najmniejszej ilości wody wolnej od nukleaz.

5.9.4. Izolacja rybosomów 80S z Zea mays

• 150 g liści kukurydzy zamrożonych w -80^oC, zhomogenizowałam w 250 ml buforu do izolacji rybosomów;

• mieszaninę doprowadziłam do pH 7,5 nieadjustowanym 1 M tris-em HCl (pH 10,5);

• preparat i otrzymany z niego supernatant wirowałam 30 000 g, 15 min., 4°C; • roztwór zdekantowałam;

• poddałam roztwór wirowaniu 140 000 g, 3 h, 4°C;

• otrzymany supernatant poddawałam dalszej obróbce do otrzymania aktywnych biologicznie czynników eEF1 i eEF2, w dalszej części pracy określanych jako S100;

• osad homogenizowałam w buforze do izolacji rybosomów do otrzymania jednorodnego, klarownego, mlecznego roztworu rybosomów;

• rybosomy wirowałam przez tzw. poduszkę sacharozową (po 5 ml), nakładając je bardzo ostrożnie na jej powierzchnię;

• wirowanie prowadziłam w probówkach typu Quick-Seal (kubki wirówkowe 13,5 ml), 330 000 g, 2 h, 4°C;

• osad rybosomów powtórnie homogenizowałam w buforze do izolacji rybosomów i powtórzyłam proces wirowania przez poduszkę sacharozową;

• otrzymany osad rybosomów homogenizowałam w buforze do przechowywania rybosomów i wirowałam 2000 g, 5 min., 4°C;

• otrzymany supernatant przechowywałam w temp. -80°C.

5.9.5. Izolacja frakcji enzymatycznej S100

Celem procedury było uzyskanie aktywnej frakcji enzymatycznej układu biosyntezy białka:

• Zawiesinę S100, otrzymaną w czasie izolacji rybosomów, o znanej objętości, poddałam frakcjonowanemu wysalaniu siarczanem amonu w dwóch etapach, w temperaturze 0°C;

• w pierwszym etapie dodawałam siarczanu amonu do uzyskania 35% stężenia (194 g soli na 1000 ml roztworu), proces prowadziłam powoli dodając sól małymi porcjami w czasie 30 min. przy stałym mieszaniu i pH (powinno być 7,5);

• preparat wirowałam 30 000 g, 30 min., 4°C;

• supernatant o znanej objętości, poddałam drugiemu etapowi wysalania do uzyskania 60 % stężenia siarczanu amonu w roztworze (184 g na 1000 ml roztworu), również powoli dodając porcje soli przy ciągłym mieszaniu;

• otrzymany osad rozpuściłam w minimalnej ilości buforu do izolacji frakcji enzymatycznej S100 i poddałam dializie w czasie 3,5 h, trzykrotnie zmieniając bufor do izolacji frakcji enzymatycznej S100;

• preparat wirowałam 6000 g, 5 min., 4°C, zebrałam supernatant, zmierzyłam spektrofotometrycznie przy długości fali λ = 280 nm i obliczyłam stężenie białek; • przechowywałam w temperaturze -80°C.

Materiały i metody

5.9.6. Reakcja aminoacylacji tRNA

• Mieszaninę reakcyjną (50 µl) zawierającą: bufor do reakcji aminoacylacji, 300 pmoli [³H]-fenyloalaniny oraz zoptymalizowaną ilość tRNA i frakcji enzymatycznej (S100) o znanym stężeniu, inkubowałam 15 min., 37°C;

• mieszaninę przemywałam: jednokrotnie 10% roztworem kwasu trichlorooctowego (TCA), trzykrotnie 5% roztworem TCA i jednokrotnie 96% etanolem, jednocześnie przefiltrowując przez sączek z włókna szklanego Whatman GF/C;

• zatrzymaną na sączkach radioaktywność zmierzyłam na liczniku scyntylacyjnym w scyntylatorze toluenowym na liczniku Beckmann LS 7000.

5.9.7. Preparatywna reakcja aminoacylacji

• Mieszaninę reakcyjną (5 ml) zawierającą: bufor do reakcji aminoacylacji, 300 nmoli [³H]-fenyloalaniny i 9,8 nmoli tRNA^Phe inkubowałam 5 min., 37°C;

• następnie dodałam 150 µl frakcji enzymatycznej S100 o stężeniu 244,5 A₂₈₀/ml i prowadziłam właściwą reakcję aminoacylacji przez 15 min., 37°C;

• po inkubacji próbę wytrząsałam z fenolem o temperaturze 4°C przez 15 min. w celu usunięcia syntetaz aminoacylo-tRNA, wirowałam 12 000 g, 20 min., temperatura pokojowa;

• do warstwy wodnej dodałam 3 objętości 96% etanolu w obecności 1/10 objętości octanu potasu (pH 5,2) i całość pozostawiłam w temperaturze -20°C na 1 h, w celu wytrącenia ze środowiska zsyntetyzowanego [³H]-Phe-tRNA^Phe oraz usunięcia fenolu;

• wytrącony osad odwirowałam 12 000 g, 20 min., temperatura pokojowa i rozpuściłam w wodzie wolnej od nukleaz;

• procedurę wytrącania z użyciem etanolu opisaną powyżej powtarzałam kilkukrotnie w tych samych warunkach;

• ostatecznie osad [³H]-Phe-tRNAPhe rozpuściłam w wodzie wolnej od nukleaz (300 µl) i przechowywałam w temperaturze -80°C.

5.9.8. Reakcja enzymatycznego wiązania Phe-tRNA^Phe do poli(U) rybosomów (RW) • Mieszanina inkubacyjna (50 µl) zawierała : 5 µl buforu A do reakcji wiązania

aa-tRNA do rybosomu, 10 µl buforu B do reakcji wiązania aa-aa-tRNA do rybosomu, 12 pmoli rybosomów i zoptymalizowaną ilość frakcji enzymatycznej S100;

• próbę kontrolną stanowiła mieszanina reakcyjna o takim samym składzie, niezawierająca S100;

• inkubację prowadziłam przez 5 min., 37ºC;

• następnie do mieszaniny inkubacyjnej dodałam 1 ml schłodzonego buforu płuczącego i sączyłam przez sączki nitrocelulozowe o średnicy porów 0,45 µm; • filtr nitrocelulozowy płukałam trzykrotnie tym samym buforem, suszyłam

i zliczałam poziom radioaktywności w scyntylatorze toluenowym na liczniku Beckmann LS 7000.

Wyniki i dyskusja