Analiza zmian w poziomie ekspresji genów z wykorzystaniem techniki

Analiza ekspresji genów z wykorzystaniem techniki mikromacierzowej pozwala na określenie profilu zmian poszczególnych genów w określonych warunkach środowiskowych oraz wytypowanie genów zaangażowanych w reakcję na zmiany środowiskowe rośliny (Uzarowska i in. 2009). Technika ta z powodzeniem stosowana jest do określania zmian w globalnej ekspresji genów w poszczególnych fazach rozwojowych rośliny, w różnorodnych warunkach stresowych i jako technika pozwalająca na poznanie charakterystyki transkryptomicznej odmiany (Schnable i in. 2004). Uzyskany materiał cDNA znakowany barwnikami fluorescencyjnymi Cy3 (kontrola) i Cy5 (próbka z rośliny w warunkach stresowych) w równych ilościach każdej z prób mieszano i hybrydyzowano z płytką mikromacierzową z sondami specyficznymi dla Zea mays.

Rysunek 30. Przykładowy obraz płytki macierzowej analizowanej z wykorzystaniem oprogramowania GenePix, linia tolerancyjna,poddana działaniu herbicydy Roundup, dzień 7.

Wybrałam płytki mikromacierzowe z sondami oligonukleotydowymi dedykowanymi sekwencjom kukurydzy. Na płytkach mikromacierzowych znajdowało się 46 128 000 70-nukleotydowych sond DNA odpowiadających sekwencjom, wybranym z opublikowanych w bazach sekwencji ESTów (www.maizearray.org 2008). Po zakończeniu hybrydyzacji płytki suszono, skanowano, a następnie poddawałam je analizie z wykorzystaniem programu GenePix w celu określenia intensywności hybrydyzacji cDNA do każdej z nadrukowanych na płytce sond. Na podstawie różnic intensywności fluorescencji wynikającej ze zhybrydyzowania cDNA próbki kontrolnej i badanej do danej sondy wnioskowałam o zmianach w poziomie ekspresji genów, które były reprezentowane przez poszczególne sondy na płytce mikromacierzowej (Solinska i in. 2004).

W wyniku analizy porównawczej krotności zmian w poziomie ekspresji w poszczególnych punktach czasowych dla stosowanych herbicydów nie udało mi się wskazać genów „uniwersalnej odpowiedzi na stres herbicydowy”. Grupy, w których poziom ekspresji ulegał największej zmienności dla poszczególnych herbicydów zawierały całkowicie odmienne geny. Wnioskuję, że nie można mówić o warunkach uniwersalnego stresu herbicydowego, tylko o stresie powodowanym przez poszczególne środki ochrony roślin. Stosowane herbicydy różnią się składnikami aktywnymi i mechanizmami działania, co tłumaczy różną odpowiedź rośliny na warunki stresu na poziomie transkryptomu. W dalszych badaniach skupiłam się na analizie zmian w poziomie ekspresji w odpowiedzi na działanie herbicydu Roundup i próbie określenia mechanizmu kształtowania tej cechy.

Zastosowanie analizy statystycznej umożliwiło mi wyłonienie grupy genów o największej zmienności w poziomie ekspresji w warunkach stresu wywołanego działaniem Roundup (Załącznik 1., Tabela 26.). Postanowiłam przeanalizować z uzyskanej grupy te geny, które wykazywały co najmniej 2-krotną zmianę ekspresji. W czasie przystępowania do prac badawczych nie była znana sekwencja genomu kukurydzy. Dopiero w roku 2009 został opublikowany genom linii kukurydzy B73, który prawdopodobnie znacznie różni się od genomów badanych linii (Ma i in. 2008; Schnable i in. 2009). W takiej sytuacji należało spodziewać się, że uzyskane wyniki zmian w poziomie ekspresji będą miały charakter przesiewowy i wskażą jedynie, których genów poziom ekspresji należy dokładnie zbadać z wykorzystaniem techniki rtPCR. Grupę genów wykazującą co najmniej 2-krotną zmianę w poziomie ekspresji zawężyłam do 10 genów

Wyniki i dyskusja

charakteryzujących się największą dynamiką zmian ekspresji, które postanowiłam przebadać z zastosowaniem techniki PCR w czasie rzeczywistym.

Analizując wytypowane geny zuważyłam największe zmiany w poziomie ekspresji porównując linię tolerancyjną i wrażliwą traktowane herbicydem w dniu 7. od zabiegu. Porównanie poziomu ekspresji dla linii kontrolnych pozwala stwierdzić, że nie następowały w ich obrębie istotne zmiany zarówno w dniu 0 jak i 7. Zmiany w poziomie ekspresji w czasie tygodnia od zastosowania warunków stresowych w liniach kontrolnych wywołane mogą być wzrostem rośliny i związanymi z tym różnicami w intensywności transkrypcji poszczególnych genów. W celu dokonania selekcji genów, których analiza będzie potwierdzana techniką rtPCR konieczne było porównanie warunków, w których wskazać można najsilniejsze zmiany ekspresji. Postanowiłam przeanalizować, jak zmienia się krotność ekspresji genów w czasie u linii tolerancyjnej i wrażliwej. Dla wytypowanych genów zauważyłam, że zmiany następujące w liniach wykazujących odmienną tolerancję na herbicyd są skrajnie różne. W przypadku większości genów ze wzrostem krotności zmian ekspresji u linii tolerancyjnej koreluje spadek ekspresji u roślin wrażliwych. Taka obserwacja pozwoliła mi na wnioskowanie, że właśnie te geny mogą być zaangażowane w odpowiedź na warunki stresu herbicydowego i kształtowanie cechy tolerancji. Dla porównania na wykresach 3. i 4. przedstawiłam jak kształtowały się zmiany poziomu ekspresji wybranych genów w odpowiedzi na zastosowanie herbicydów Titus i Basta. Analiza tych samych porównań warunków w czasie pozwala na stwierdzenie, że wcześniej zaobserwowana relacja zmian u linii tolerancyjnej i wrażliwej dla glifosatu nie zachodzi w przypadku działania rimsulfuronu i glufosynatu. W celu dokładnego określenia zmian w poziomie ekspresji wytypowanych genów przeprowadziłam analizę techniką real time PCR (rtPCR).

Wykres 2. Krotność zmian poziomu ekspresji genów dla różnych porównań linii kukurydzy w przypadku zastosowania warunków stresowych wywołanych działaniem herbicydu Roundup, zmierzona techniką hybrydyzacji mikromacierzowej; p≤0,1. Na wykresie oznaczono: linię tolerancyjną oznaczono jako TL, wrażliwą jako SL, tolerancyjną w dniu 7. od zabiegu TL”7”, a wrażliwą w dniu 7. od zabiegu SL”7”. Skrótami oznaczono: SCP - gen kodujący karboksypeptydazę seryny, PRP - gen kodujący białka związane z patogenezą, IMP - gen kodujący integralne białka membrany, AGLP - gen kodujący białka podobne do arabinoglikanu, RLK - gen kodujący białka kinaz podobnych do receptorowych, HPS - gen kodujący hipotetyczne białko, WIPI - gen kodujący inhibitory proteinaz indukowane zranieniem, UP2 - gen kodujący nieznane białko, NA2 - gen kodujący transkrypt 2. o nieznanej funkcji, NA4 - gen kodujący transkrypt 4. o nieznanej funkcji.

Wyniki i dyskusja

Wykres 3. Krotność zmian poziomu ekspresji genów dla różnych porównań linii kukurydzy w przypadku zastosowania warunków stresowych wywołanych działaniem herbicydu Titus, zmierzona techniką hybrydyzacji mikromacierzowej; p≤0,1. Na wykresie oznaczono: linię tolerancyjną oznaczono jako TL, wrażliwą jako SL, tolerancyjną w dniu 7. od zabiegu TL”7”, a wrażliwą w dniu 7. od zabiegu SL”7”. Skrótami oznaczono: SCP - gen kodujący karboksypeptydazę seryny, PRP - gen kodujący białka związane z patogenezą, IMP - gen kodujący integralne białka membrany, AGLP - gen kodujący białka podobne do arabinoglikanu, RLK - gen kodujący białka kinaz podobnych do receptorowych, HPS - gen kodujący hipotetyczne białko, WIPI - gen kodujący inhibitory proteinaz indukowane zranieniem, UP2 - gen kodujący nieznane białko, NA2 - gen kodujący transkrypt 2. o nieznanej funkcji, NA4 - gen kodujący transkrypt 4. o nieznanej funkcji.

Wykres 4. Krotność zmian poziomu ekspresji genów dla różnych porównań linii kukurydzy w przypadku zastosowania warunków stresowych wywołanych działaniem herbicydu Basta, zmierzona techniką hybrydyzacji mikromacierzowej; p≤0,1. Na wykresie oznaczono: linię tolerancyjną oznaczono jako TL, wrażliwą jako SL, tolerancyjną w dniu 7. od zabiegu TL”7”, a wrażliwą w dniu 7. od zabiegu SL”7”. Skrótami oznaczono: SCP - gen kodujący karboksypeptydazę seryny, PRP - gen kodujący białka związane z patogenezą, IMP - gen kodujący integralne białka membrany, AGLP - gen kodujący białka podobne do arabinoglikanu, RLK - gen kodujący białka kinaz podobnych do receptorowych, HPS - gen kodujący hipotetyczne białko, WIPI - gen kodujący inhibitory proteinaz indukowane zranieniem, UP2 - gen kodujący nieznane białko, NA2 - gen kodujący transkrypt 2. o nieznanej funkcji, NA4 - gen kodujący transkrypt 4. o nieznanej funkcji.

6.2.3. Przygotowanie materiału biologicznego do analizy zmian w poziomie ekspresji