Ocena działania herbicydu Basta

Jako linia tolerancyjna na działanie herbicydu Basta we wcześniejszych badaniach szklarniowych przeprowadzonych w Zespole prof. Kazimierza Adamczewskiego w Instytucie Ochrony Roślin w Poznaniu została wytypowana S245 (TL). Jako linia wrażliwa na działanie herbicydu została wytypowana linia S41336 (SL). Zaobserwowałam, iż linia S245 charakteryzuje się pokrojem zbliżonym do linii S41336. Linia wykazująca wysoką tolerancję na działanie stresu herbicydowego miała liście nieco szersze i dłuższe od linii wrażliwej. Różnicę zaobserwowałam również w kolorze liści, linia tolerancyjna posiadała ciemnozielone liście, dość odporne na uszkodzenia i stosunkowo sztywne. Liście linii wrażliwej były nieco jaśniejsze, mniejsze i wykazywały większą podatność na uszkodzenia mechaniczne.

W dniu zerowym (Zdjęcie 7.) po około 5 godzinach po zastosowaniu czynnika stresowego przeprowadziłam pierwszą analizę porównawczą roślin w celu stwierdzenia czy wystąpiła reakcja fenotypowa na herbicyd. W dniu 0 nie zaobserwowałam, w porównaniu do roślin kontrolnych, zmian na powierzchni liści roślin żadnej z linii.

Wyniki i dyskusja

Zdjęcie 7. Linie kukurydzy w dniu 0 poddane działaniu herbicydu Basta. Linię tolerancyjną oznaczono jako TL, a wrażliwą jako SL.

Kolejną obserwację przeprowadziłam w dniu 2., w celu określenia czy zaszły zmiany fenotypowe wywołane warunkami stresowymi. Zaobserwowałam pojawienie się lekkiego uschnięcia końców liści w odpowiedzi na działanie herbicydu Basta u linii wrażliwej na jego działanie. Z kolei u linii tolerancyjnej nie zaobserwowałam widocznych zmian fenotypowych.

W dniu 7. (Zdjęcie 8.) po traktowaniu herbicydem przeprowadziłam kolejną analizę stanu fenotypowego roślin. U linii wrażliwej kukurydzy odnotowałam postępujące usychanie końców liści w kierunku ich podstawy. U linii tolerancyjnej dochodziło do delikatnego podsychania końców niektórych z liści.

Zdjęcie 8. Linie kukurydzy w dniu 7. poddane działaniu herbicydu Basta. Linię tolerancyjną oznaczono jako TL, a wrażliwą jako SL.

Na podstawie analizy fenotypowej stwierdziłam w dniu 14. (Zdjęcie 9.) obecność rozległej nekrozy liści u linii tolerancyjnej, jednakże w porównaniu z reakcją na herbicyd Roundup u roślin wrażliwych była ona mniejsza. Oszacowałam, że około połowa liści uschła, a zjawisko usychania było szczególnie intensywne na końcach liści. U linii tolerancyjnej utrzymywały się wcześniej opisane zmiany w postaci usychania końców liści.

Zdjęcie 9. Linie kukurydzy w dniu 14. poddane działaniu herbicydu Basta. Linię tolerancyjną oznaczono jako TL, a wrażliwą jako SL.

Wyniki i dyskusja

W ostatnim dniu analizy fenotypowej – 21., u linii wrażliwej zanotowałam uschnięcie ponad połowy liści. Przybrały kolor brunatno-pomarańczowy i uległy wysuszeniu. Rozwój i wzrost rośliny, podobnie jak w przypadku zastosowania innych herbicydów, zostały znacznie zahamowane. U linii tolerancyjnej uschły głównie końce liści, jednakże roślina utrzymała swój pierwotny pokrój i nadal rosła. Pomimo widocznych zmian na liściach nie zmieniły one swojego koloru. Wzrost rośliny w porównaniu do rośliny kontrolnej został nieco spowolniony.

Przeprowadzone obserwacje zmian fenotypowych pozwoliły mi na stwierdzenie, że w dniu stosowania herbicydu nie obserwowałam zmian fenotypowych w żadnym przypadku. Zdecydowałam, że zgodnie z danymi literaturowymi w czasie 5 godzin po zabiegu oprysku, herbicyd powinien przeniknąć do liści i zacząć działać na roślinę (Ge i in. 2011). Jeśli wystąpiła wczesna reakcja obronna w komórkach roślinnych to powinna być ona widoczna w zebranym w tym czasie materiale. Po 7 dniach od zastosowania stresu herbicydowego widoczne były zmiany nekrotyczne na liściach kukurydzy. Stwierdziłam, że mechanizmy odpowiedzialne za kształtowanie odporności na działanie stresu powinny być w pełni aktywne, ponieważ obserwowałam wyraźne różnice w poziomie plam nekrotycznych u linii wrażliwej i tolerancyjnej. W późniejszych dniach nieliczne zmiany nekrotyczne pojawiały się również u linii tolerancyjnej. Jednocześnie zmiany widoczne u linii wrażliwej były już bardzo intensywne. Nasilone zmiany nekrotyczne na liściach świadczą o silnej reakcji rośliny na stres i śmierci komórek, co bezpośrednio przekłada się na jakość materiału biologicznego, szczególnie RNA uzyskiwanego z takiej rośliny. Zaplanowane przeze mnie analizy wymagały materiału biologicznego wysokiej czystości i jakości, przez co należy rozumieć niezdegradowane RNA, DNA i chromatynę. Zastosowanie materiału roślinnego w skrajnym stadium nekrozy mogło wpłynąć na wykazanie zmian obecnych podczas procesów śmierci komórek, a nie mechanizmów obronnych zaangażowanych w reakcję na stres herbicydowy.

W przypadku herbicydu Roundup odnotowano różne mechanizmy kształtowania cechy odporności i tolerancji na jego działanie u roślin. Należą do nich mutacja w obrębie sekwencji enzymu EPSPS lub większa ilość jego kopii obecna w komórce (Dill i in. 2000; Baerson i in. 2002). Wykazano również, że u niektórych roślin możliwe jest zajście metabolizmu glifosatu, a tym samym jego unieszkodliwienie. Odnotowano również, że cecha odporności może być skorelowana z mechanizmami komórkowymi związanymi z transportem i magazynowaniem glifosatu w tkankach rośliny (Franz i in. 1997). Rośliny

L. rigidum wykazujące cechę odporności na glifosat transportowały herbicyd do końców liści, co powodowało ich usychanie. Taki mechanizm umożliwiał wzrost i dalszy rozwój pozostałej części rośliny. Rośliny wrażliwe magazynowały czynnik aktywny herbicydu u podstawy liści, co skutkowało powolnym ich usychaniem i śmiercią rośliny (Lorraine-Colwill i in. 2003). W przypadku obserwowanych przeze mnie zmian fenotypowych u linii kukurydzy wykazującej tolerancję na Roundup można wykazać ich podobieństwo do opisywanych w literaturze u roślin odpornych. Zanotowałam usychanie końców liści rośliny tolerancyjnej, a pozostała część dalej się rozwijała i rosła. Linia wrażliwa wykazywała zmiany nekrotyczne na całej powierzchni liści i powoli zamierała. Zaobserwowane przeze mnie zmiany fenotypowe mogą wskazywać na związek cechy tolerancji na działanie glifosatu z jego ukierunkowanym transportem do końców liści podobnie jak obserwowano to u L. rigidum (Lorraine-Colwill i in. 2003). W trakcie prowadzonych badań odnotowałam, że linia tolerancyjna posiada liście bardziej odporne na uszkodzenia mechaniczne. Później przeprowadzony proces mycia liści (na potrzeby eksperymentu ChIP) pozwolił mi na stwierdzenie, że są one również silniej pokryte kutikulą. Obserwacje te korelują z wynikami innych badaczy, którzy również wykazali związek pomiędzy poziomem kutikuli i wrażliwością liści na uszkodzenia z możliwością wnikania herbicydu przez liście (Luo i in. 2012). Postuluję, że linia tolerancyjna posiadała liście mniej wrażliwe na uszkodzenia i pokryte woskami co mogło wpływać na obniżenie ilości wchłanianego glifosatu poprzez ich powierzchnię.