Analiza obecności modyfikacji epigenetycznych białek histonowych w obrębie

Modyfikacje białek histonowych to zlokalizowane w chromatynie znaczniki pełniące kluczową rolę w procesie regulacji ekspresji genów w komórce. Epigenetyczna regulacja poziomu transkrypcji jest niezbędna dla normalnego wzrostu i rozwoju roślin (Turner 2002; Tariq i in. 2004). Duża zmienność czynników środowiskowych, na które narażona jest roślina wymusiła wykształcenie mechanizmów komórkowych pozwalających na sterowanie bioprocesami tak, aby możliwe było szybkie dostosowanie się do zaistniałych warunków. Stosunkowo dobrze opisanym mechanizmem zaangażowanym w odpowiedź na warunki stresowe u roślin jest zmiana modyfikacji białek histonowych. Chemicza modyfikacja w obrębie reszt aminokwasów umożliwia regulację dostępności i aktywności transkrypcyjnej poszczególnych obszarów genomu (Verhage i in. 2010). Wykonałam analizę w celu określenia czy w obrębie sekwencji genu kodującego białka podobne do arabionoglikanu obecne są zmiany znaczników euchromatycznych białek histonu 3, warunkujące odmienną jego aktywność transkrypcyjną. Postanowiłam wykorzystać technikę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu przeciwciał specyficznie wiążących się do acetylacji lizyny 9. białka histonowego 3. (AcK9H3), trójmetylacji lizyny 4. białka histonowego 3. (3MeK4H3) oraz białka histonowego 3. (H3) (Haring i in. 2007). Modyfikacje AcK9H3 oraz 3MeK4H3 zostały scharakteryzowane jako typowe znaczniki euchromatyczne zarówno u A. thaliana jak i u kukurydzy. Stwierdzono, że obniżenie poziomu acetylacji w pozycji K9H3 w obrębie genu prowadzi do ograniczenia intensywności jego transkrypcji. Zaburzenia we wzorze AcK9H3 prowadziły do zmian we wzroście rośliny, a ich obecność była szczególnie widoczna w warunkach narażenia na stres wywołany zasoleniem, suszą i wysokim poziomem ABA. Zaobserwowano również, że obniżenie ilości tej modyfikacji może skutkować niewykształceniem nasion, represją transkrypcji w komórce, a także obniżeniem ilości rRNA (Chen i in. 2007). Modyfikację 3MeK4H3 stwierdzono u roślin narażonych na działanie patogenów, w których aktywowała transkrypcyjnie geny związane z odpowiedzią na ten rodzaj stresu. Obecność tej modyfikacji wykazano również w obrębie sekwencji niektórych nieaktywnych transkrypcyjnie genów i stwierdzono, że jej pojawienie się może wpływać na inicjację transkrypcji (Alvarez i in. 2010). W genomie ryżu i A. thaliana modyfikacja ta powiązana została z aktywacją genów w warunkach stresowych takich jak światło, susza czy zanurzenie roślin (Chen i in. 2013). Obecność trójmetylacji lizyny 4. H3

łączy się z istotną rolą pełnioną w regulacji procesów kwitnienia, morfogenezy liści i korzeni oraz kształtowaniu odporności na patogeny i stres suszy (Berr i in. 2011).

Dostępne w literaturze dane eksperymentalne dotyczące obrazowania wyników uzyskanych techniką immunoprecypitacji dają szeroki zakres możliwości ich przedstawienia i interpretacji. W wykonanych przeze mnie analizach posłużyłam się metodą zobrazowania wyników najczęściej stosowaną w literaturze (Haring i in. 2007). Na podstawie porównania ekspresji genów AGLP, RLK i NA4 w próbkach DNA uzyskanego z poszczególnych eksperymentów Chip (dla każdego z przeciwciał) do wartości ekspresji dla próbki wsadowej. Uzyskane wyniki zobrazowałam na wykresach 19-21. Zastosowanie przeze mnie tej metody było konieczne, aby porównać uzyskane wyniki ze zmianami w poziomie znaczników epigenetycznych opisywanymi przez innych badaczy (Livak i in. 2001; Haring i in. 2007).

Wykres 19. Zmiany procentowe zawartości euchromatycznych znaczników epigenetycznych w poszczególnych liniach w obrębie sekwencji genu AGLP; ± SD. Na wykresie oznaczono: H3 – białka histonu 3., AcK9H3 – acetylacja lizyny 9 białka histonu 3., 3MeK4H3 – trójmetylacja lizyny 4 białka histonu 3., NoAb – brak przeciwciała. Linię tolerancyjną poddaną zabiegowi oznaczono jako TL, linię wrażliwą poddaną zabiegowi jako SL, tolerancyjną linię kontrolną oznaczono jako KTL, a wrażliwą linię kontrolną jako KSL. Linię tolerancyjną po 7 dniach od zabiegu oznaczono jako TL”7”, linię wrażliwą po 7 dniach od zabiegu jako SL”7”, tolerancyjną linię kontrolną po 7 dniach od zabiegu oznaczono jako KTL, a wrażliwą linię kontrolną po 7 dniach od zabiegu jako KSL.

Wyniki i dyskusja

Na podstawie uzyskanych wyników wywnioskowałam, że modyfikacja epigenetyczna 3MeK4H3 nie była obecna w sekwencji genu AGLP. Sugerowana w literaturze rola tego znacznika jako aktywatora genów może tłumaczyć, że nie jest on obecny w sekwencji, która ulega stałej ekspresji w komórce. Obserwowane sygnały pochodzące od modyfikacji 3MeK4H3 były na poziomie próbek bez przeciwciała. W przypadku modyfikacji AcK9H3 uzyskałam dużą dynamikę zmian w jej poziomie w poszczególnych liniach i punktach czasowych. U linii wrażliwej w dniu 0 poziom AcK9H3 był zdecydowanie wyższy u roślin poddanych stresowi niż kontrolnych, u których był na poziomie nieznacznie wyższym od próby bez przeciwciała. U roślin tolerancyjnych w dniu 0 zaobserwowałam przeciwną zależność u linii kontrolnej, w przeciwieństwie do poddanej stresowi wiekszość białek H3 posiadała acetylację w pozycji K9. Po siedmiu dniach od zastosowania glifosatu zaobserwowałam odwrócenie się obserwowanych poziomów acetylacji K9H3 u wszystkich linii. U roślin wrażliwych w warunkach kontrolnych poziom acetylacji był istonie wyższy niż u kukurydzy poddanej działaniu herbicydu. W przypadku linii tolerancyjnej większość z białak H3 posiadała acetylację w pozycji K9 u roślin poddanych opryskowi Roundup, a u roślin kontrolnych nie wykrywano tej modyfikacji. Dane te korelują z wcześniej opisanymi przeze mnie zmianami w poziomie ekspresji genu AGLP w poszczególnych punktach czasowych (Wykres 10.). Wykazałam, że krotność relatywnego poziomu ekspresji była wyższa u linii tolerancyjnej aniżeli wrażliwej, a zjawisko to nasiliło się pod wpływem stresu w dniu 7. U kukurydzy wykazano, że obecnośc znacznika AcK9H3 w obrębie genu wiąże się z podniesieniem jego aktywności transkrypcyjnej, szczególnie w warunkach stresu (Hu i in. 2012). Wnioskuję, że z podobnym zjawiskiem wiąże się podwyższenie aktywności transkrypcyjnej genu AGLP w warunkach zastosowania herbicydu u linii tolerancyjnej. Postuluję, że mechanizmy epigenetyczne powodują nasilenie aktywności transkrypcyjnej tego genu co zdaje się wiązać z kształtowaniem cechy tolerancji na glifosat.

Wykres 20. Zmiany procentowe zawartości euchromatycznych znaczników epigenetycznych w poszczególnych liniach w obrębie sekwencji genu RLK; ± SD. Na wykresie oznaczono: H3 – białka histonu 3., AcK9H3 – acetylacja lizyny 9 białka histonu 3., 3MeK4H3 – trójmetylacja lizyny 4 białka histonu 3., NoAb – brak przeciwciała. Linię tolerancyjną poddaną zabiegowi oznaczono jako TL, linię wrażliwą poddaną zabiegowi jako SL, tolerancyjną linię kontrolną oznaczono jako KTL, a wrażliwą linię kontrolną jako KSL. Linię tolerancyjną po 7 dniach od zabiegu oznaczono jako TL”7”, linię wrażliwą po 7 dniach od zabiegu jako SL”7”, tolerancyjną linię kontrolną po 7 dniach od zabiegu oznaczono jako KTL, a wrażliwą linię kontrolną po 7 dniach od zabiegu jako KSL.

Podobnie jak w przypadku genu AGLP, w obrębie sekwencji genu RLK nie zaobserwowałam obecności znacznika epigenetycznego 3MeK4H3. U roślin kontrolnych linii wrażliwej w czasie 7 dni ich hodowli zwiększył się istotnie poziom modyfikacji AcK9H3, która obecna jest w rejonach aktywnych transkrypcyjnie (Hu i in. 2012). Przeprowadzona analiza linii wrażliwej poddanej warunkom stresowym nie wykazała obecności acetylacji lizyny 9 białka histonu 3. Rośliny kontrolne linii tolerancyjnej zarówno w dniu 0, jak i 7. charakteryzował wysoki poziom AcK9H3 w obrębie sekwencji genu RLK. U linii tolerancyjnej poddanej działaniu herbicydu Roundup nie była obecna acetylacja lizyny 9. Analiza porównawcza obecności znaczników epigenetycznych i zmian w poziomie ekspresji genu RLK (Wykres 11.) zdają się nie korelować ze sobą. Wzrost poziomu acetylacji u roślin kontrolnych linii wrażliwej wiązać się może z procesem wzrostu

Wyniki i dyskusja

i rozwoju rośliny. Jednocześnie u kukurydzy kontrolnej linii tolerancyjnej acetylacja lizyny utrzymywana była na stałym, wysokim poziomie. Wnioskuję, że w wyniku zastosowania czynnika stresowego u linii tolerancyjnej mogło nastąpić usunięcie acetylacji lizyny 9 histonu 3. Proces ten widoczny był już w 5 godzinie od zabiegu oprysku herbicydem, więc należy go wiązać z wczesną odpowiedzią rośliny na warunki stresowe.

Wykres 21. Zmiany procentowe zawartości euchromatycznych znaczników epigenetycznych w poszczególnych liniach w obrębie sekwencji genu NA4; ± SD. Na wykresie oznaczono: H3 – białka histonu 3., AcK9H3 – acetylacja lizyny 9 białka histonu 3., 3MeK4H3 – trójmetylacja lizyny 4 białka histonu 3., NoAb – brak przeciwciała. Linię tolerancyjną poddaną zabiegowi oznaczono jako TL, linię wrażliwą poddaną zabiegowi jako SL, tolerancyjną linię kontrolną oznaczono jako KTL, a wrażliwą linię kontrolną jako KSL. Linię tolerancyjną po 7 dniach od zabiegu oznaczono jako TL”7”, linię wrażliwą po 7 dniach od zabiegu jako SL”7”, tolerancyjną linię kontrolną po 7 dniach od zabiegu oznaczono jako KTL, a wrażliwą linię kontrolną po 7 dniach od zabiegu jako KSL.

We wcześniej opisanych badaniach zmian relatywnego poziomu ekspresji genu NA4 wykazałam, że może być ona stosowany jako marker pozwalający na różnicowanie linii kukurydzy pod względem tolerancji na herbicyd Roundup. Analiza znaczników epigenetycznych u linii wrażliwej poddanej działaniu warunków stresowych wykazuje na obecność 3MeK4H3 u roślin w dniu 7. od zabiegu. Modyfikacja ta wiązana jest z aktywacją transkrypcyjną rejonów,

w których się znajduje i fatycznie zaobserwowałam nieznaczny wzrost ekspresji genu NA4 u linii wrażliwej po 7 dniach (Wykres 16.) (Alvarez i in. 2010). U roślin kontrolnych linii wrażliwej w dniu 0 obecny jbył niski poziom acetylacji lizyny 9 białka histonu 3, która została usunięta i nie była obecna w dniu 7 dni. Rośliny kontrolne linii tolerancyjnej w dniu 0 charakteryzuje wysoki poziom AcK9H3, który uległ znacznemu obniżeniu w dniu 7. U roślin kontrolnych w dniu 7., w obrębie sekwencji genu NA4, obecna była również na niskim poziomie modyfikacja 3MeK4H3. W przypadku roślin linii tolerancyjnej poddanych warunkom stresowym, w 5 godzin od zabiegu obecna była na niskim poziomie trimetylacja lizyny 4 białka histonu 3, która nie była widoczna w dniu 7. Pod wpływem działania herbicydu Roundup u linii tolerancyjnej, w obrębie genu NA4 odnotowałam istotny wzrost poziomu AcK9H3 po 7 dniach od zabiegu. Wnioskuję, że obserwowany przeze mnie ponad 20-krotny wzrost poziomu ekspresji genu NA4 u roślin TL (Wykres 16.) może być skorelowany z obecnością znacznika epigenetycznego AcK9H3.

Wykazałam, że dla genów AGLP i NA4 istnieje korelacja pomiędzy obecnością znacznika epigenetycznego AcK9H3, a wzrostem ich relatywnego poziomu ekspresji.

Wyniki i dyskusja

6.6. Analiza zmian w poziomie modyfikacji RNA w obrębie frakcji małych