Inicjacja translacji z kodonu AUG1 dla białka p53 zachodzi z udziałem kapu

Z doświadczeń translacji in vitro, przeprowadzonych w lizacie z króliczych retikulocytów wynika, że translacja z kodonu AUG1 dla pełnej długości białka p53 inicjowana jest według mechanizmu skaningowego, czyli z udziałem kapu na końcu 5′ mRNA. Wskazują na to wyniki reakcji translacji in vitro z mRNA P1-Np53-Luc, ponieważ obecność kapu na końcu 5′ powodowała dwukrotny wzrost ilości białka fuzyjnego

103 powstającego z kodonu AUG1 (Rys. 22, panel A i B, wariant C). Stymulujący wpływ kapu na końcu 5′ na translację inicjowaną z kodonu AUG1, jest prawdopodobnie związany ze zwiększonym powinowactwem czynnika inicjacyjnego eIF4E, a przez to wydajniejszym tworzeniem się kompleksu inicjacyjnego 43S. Podobny wpływ kapu na końcu 5′ mRNA na syntezę białka obserwowano już wcześniej. Ilość białka reporterowego lucyferazy Renilla powstającego w RRL z mRNA zawierającego region 5′UTR -globiny, wzrosła aż 6-krotnie po dodaniu kapu do końca 5′ mRNA [164]. Natomiast obecność kapu na końcu 5′ mRNA lucyferazy Firefly prowadziła do prawie 5-krotnego wzrostu poziomu tego białka w warunkach in vitro [165]. Do wzrostu wydajności translacji inicjowanej z kodonu AUG1 dochodziło również w przypadku mRNA P1-p53-Luc oraz P0-p53-Luc (Rys. 22, panel A i B, warianty A i B). Jednak w przypadku obu mRNA wzrost ten był większy, w porównaniu z mRNA P1-Np53-Luc. Przyczyną tego może być zarówno mniejsza długość wariantów P1-p53 i P0-p53 oraz odmienna struktura drugorzędowa RNA, dzięki czemu translacja może być inicjowana szybciej i z większą efektywnością. Co ciekawe, ilość białka syntetyzowanego z kodonu AUG1 nie zmieniła się w przypadku mRNA P0-Np53-Luc. Być może stymulujący wpływ kapu na końcu 5′ mRNA jest maskowany przez obecność regionu P0-P1, w obrębie którego postulowano obecność stabilnej struktury drugorzędowej inhibującej proces translacji.

Za mechanizmem inicjacji translacji białka p53 zależnym od kapu przemawiają również wyniki translacji kapowanego mRNA P1-Np53-Luc w obecności wzrastającego stężenia wolnego analogu kapu (Rys. 26). Dodanie wolnego analogu kapu do mieszaniny reakcyjnej ma na celu związanie czynnika inicjacyjnego eIF4E, wskutek czego nie może on wiązać się do kapu na końcu 5′ mRNA. Już w obecności niewielkich ilości wolnego analogu kapu dochodziło do obniżenia poziomu translacji z kodonu AUG1. Do znaczącej inhibicji reakcji dochodziło przy stężeniu 100 M, przy którym wydajność translacji spadła do około 20%. Podobny spadek ilości białka, powstającego w tych warunkach zaobserwowano dla -globiny, która syntetyzowana jest według mechanizmu inicjacji zależnego od kapu. W tym przypadku, wydajność syntezy spadła do około 30% przy 100 M stężeniu analogu kapu [166; 167]. W związku z tym można przypuszczać, że translacja rozpoczynająca się z kodonu AUG1 zależy od obecności czynnika eIF4E, który uczestniczy w formowaniu kompleksu inicjacyjnego z udziałem kapu na końcu 5′ mRNA. Obserwowany efekt inhibicji nie był związany z degradacją powstającego białka w środowisku lizatu, o czym świadczy jego nieznacznie zmieniony poziom w warunkach wydłużonej inkubacji kapowanego mRNA

104 P1-Np53-Luc (Rys. 27). Jednak, translacja inicjowana z kodonu AUG1 nie została zahamowana całkowicie, nawet przy najwyższym zastosowanym stężeniu wolnego analogu kapu, a jej wydajność wynosiła około 10% wartości początkowej. Podobna sytuacja miała miejsce w przypadku innego konstruktu mRNA RNA-554, który zawierał 1/3 sekwencji kodującej białko p53 [151]. Można przypuszczać, że jeśli kap-zależna translacja zostaje zahamowana poprzez inaktywację czynnika eIF4E to pozostała aktywność translacyjna kodonu AUG1 jest wynikiem występowania elementu IRES w regionie terminalnym 5′ mRNA p53. Istnieje również możliwość, że IRES-zależna translacja jest maskowana poprzez mechanizm zależny od kapu, który w tym przypadku zachodzi wydajniej. Za tą hipotezą przemawiają wyniki translacji mRNA P1-Np53-Luc, który na końcu 5′ posiadał niefunkcjonalny kap ApppG (Rys. 28). Jego obecność skutkowała około 80% inhibicją translacji, rozpoczynającą się z kodonu AUG1 w porównaniu do mRNA, który posiadał na końcu 5′ funkcjonalny kap. Również w przypadku mRNA P1-p53-Luc, który zawiera tylko kodon AUG1 zaobserwowałam silny, bo aż 70% stopień inhibicji po zastąpieniu kapu niefunkcjonalnym analogiem ApppG. ApppG nie jest zdolny do oddziaływania z eIF4E, przez co nie może uczestniczyć w inicjacji translacji zależnej od kapu. Otrzymany przeze mnie wynik sugeruje, że translacja modelowego mRNA p53 inicjowana z kodonu AUG1 jest w dużym stopniu zależna od kapu. Potwierdzają to również dane literaturowe dotyczące translacji mRNA kodującego histon H4, w przypadku którego obecność analogu kapu ApppG na końcu 5′ całkowicie hamowała powstawanie histonu H4, zarówno w lizacie z retikulocytów królika jak i lizacie z kiełków pszenicy [168]. Jednak, w przeciwieństwie do syntezy histonu H4, translacja z kodonu AUG1 w mRNA P1-Np53-Luc oraz P1-p53-Luc zachodziła jednak nadal na niskim poziomie, pomimo braku wiązania czynnika inicjacyjnego eIF4E. Możliwe zatem, że rybosom inicjuje translację z kodonu AUG1 bez konieczności skanowania mRNA. Należy jednak wziąć pod uwagę fakt, że skład lizatu z króliczych retikulocytów jest optymalizowany w celu wydajnej syntezy białek, w związku z czym translacji ulegają nawet mRNA nie posiadające kapu ani regionu 5′UTR jak na przykład mRNA Luc, który stosowałam w swoich badaniach jako mRNA kontrolny (Rys. 21 i 22). Co więcej, translacja białka reporterowego z kontrolnego mRNA Luc zachodziła nadal pomimo obecności niefunkcjonalnego kapu ApppG na jego końcu 5′ (Rys. 29). Nie jest to jednak przypadek odosobniony, ponieważ jak wykazały badania grupy Shatsky’ego, niefunkcjonalny kap ApppG nie jest w stanie całkowicie zahamować syntezy -globiny i -aktyny w lizacie z komórek Krebs-2 [169]. Niemniej jednak, nie można

105 wykluczyć, że za niski poziom translacji z kodonu AUG1 w warunkach gdy kap-zależny proces jest ograniczony przez niefunkcjonalny kap na końcu 5′ mRNA, odpowiada element IRES. Być może obecny w regionie terminalnym 5′ mRNA p53 element IRES cechuje się relatywnie niską aktywnością. Jest Doniesiono, że elementów IRES komórkowych mRNA LINE-1, Apaf-1, c-Myc i Hsp70 wykazywały niską aktywność translacyjną w porównaniu do wirusowych elementów IRES [169].

O kap-zależnym charakterze translacji inicjowanej z kodonu AUG1 można również wnioskować na podstawie analizy wyników reakcji inhibicji odwrotnej transkrypcji w RRL, tzw. „odcisku palca”, w obecności wysokiego stężenia wolnego analogu kapu (Rys. 40). Dodanie wolnego analogu kapu do lizatu miało na celu związanie czynnika eIF4E, tak aby nie mógł on oddziaływać z kapem na końcu 5′ mRNA P1-Np53-Luc. W takich warunkach najprawdopodobniej nie dochodziło do tworzenia kompleksów inicjacyjnych w obrębie kodonu AUG1, o czym świadczy zanik charakterystycznego układu prążków na żelu, który obserwowałam w obecności GMP-PNP czy cykloheksimidu. Można zatem stwierdzić, że synteza białka rozpoczynająca się z kodonu AUG1 wymaga obecności kanonicznego czynnika inicjacyjnego eIF4E, a więc jest zależna od kapu. Gdyby translacja z kodonu AUG1 zachodziła według mechanizmu wewnętrznej inicjacji, wówczas nie dochodziłoby do zaniku „odcisku palca” pomimo związania czynnika eIF4E przez wolny analog kapu. Wskazują na to również badania prowadzone przez grupę Shatsky’ego, którzy przeprowadzili reakcję inhibicji odwrotnej transkrypcji w RRL z mRNA -globiny [170]. W obecności wolnego analogu kapu w RRL również nie powstawały kompleksy inicjacyjne w obrębie kodonu inicjacyjnego AUG. Dowodem tego był brak „odcisku palca” w obecności różnych antybiotyków oraz GMP-PNP. Autorzy efekt ten tłumaczą mechanizmem inicjacji translacji zależnej od kapu, według którego syntetyzowana jest -globina. Natomiast w przypadku mRNA histonu H4 „odcisk palca” obserwowano pomimo związania czynnika eIF4E przez dodanie wolnego analogu kapu, ponieważ translacja mRNA H4 nie rozpoczyna się od bezpośredniego wiązania eIF4E z kapem na końcu 5′ tego mRNA [168].