Wpływ regionu międzypromotorowego P0-P1 na translację inicjowaną z kodonu

Inhibujący wpływ na translację białka w stosowanym systemie reporterowym, miała również obecność regionu międzypromotorowego P0-P1 (Rys. 22, 23 i 31). Efekt ten obserwowałam zarówno w RRL jak i liniach komórkowych HeLa i MCF7 i dotyczył on wszystkich wariantów regionu terminalnego 5′ mRNA p53. Jednakże, region P0-P1 hamował głównie translację inicjowaną z kodonu AUG1. Obniżona ekspresja białka p53 z transkryptów rozpoczynających się w miejscu promotorowym P0, była obserwowana już wcześniej przez inne grupy badawcze [137; 141]. Natomiast efektywność translacji inicjowanej z kodonu AUG2, zmniejszyła się jedynie 1-3-krotnie. Sugerowano wcześniej, że za obniżoną ekspresję białka p53 odpowiada stabilna struktura pomiędzy promotorami P0 i P1 [137; 141]. Region P0-P1 wykazywał negatywny wpływ na translację białka reporterowego zarówno w RRL jak i w kilku liniach komórkowych [14].

Największy stopień inhibicji translacji zaobserwowałam w przypadku wydłużenia o region P0-P1 mRNA P1-p53-Luc, który zawiera jedynie kodon AUG1 (Rys. 22, warianty A i B). Ilość białka syntetyzowanego z mRNA P0-p53-Luc w reakcji translacji in vitro była aż 7-9 krotnie niższa, w porównaniu z mRNA P1-p53-Luc. Natomiast w linii komórkowej MCF-7 zaobserwowałam już tylko 3-krotny spadek ilości białka, podczas gdy dodanie regionu P0-P1 nie wpływało na translację w komórkach HeLa (Rys. 31).

Dane literaturowe sugerują, że efekt inhibicji translacji przez elementy struktury drugorzędowej RNA jest mniejszy w warunkach in vivo niż in vitro, co może być związane z modyfikacjami maszynerii translacyjnej lub obecnością helikaz [54; 188].Otrzymane przez nas wcześniej wyniki mapowania struktury drugorzędowej regionu P1-p53 i P0-p53 pokazują, że obecność regionu międzypromotorowego P0-P1 prowadzi do drastycznych zmian w strukturze regionu terminalnego 5′ mRNA p53, kończącego się kodonem AUG1 [151; 185].

122 Rys. 44 Struktura drugorzędowa RNA regionu P0-p53. W nawiasach podano wartość parametru G dla poszczególnych motywów strukturalnych [185].

Na skutek oddziaływania fragmentu regionu P0-P1, utworzonego przez nukleotydy U3u-G41u, z nukleotydami C31-G139 powstaje długi dwuniciowy odcinek, który zawiera wybrzuszenia, pętle wewnętrzne oraz dwie spinki G65-C98 i C99-G126 (Rys. 44). Obie struktury typu spinki są jedynymi wspólnymi elementami strukturalnymi dla regionu P1-p53 oraz P0-p53. W pozostałej części regionu P0-p53 tworzą się dodatkowo dwie struktury typu spinki U49u-A72u oraz U75u-A25. Bardziej stabilna struktura regionu P0-p53, w porównaniu z regionem P1-p53 może stanowić większą przeszkodę do rozplecenia dla kompleksu rybosomalnego i być przyczyną zmniejszonej wydajności translacji z kodonu AUG1. Wydaje się, że największy wpływ na translację inicjowaną z AUG1 może mieć część dwuniciowego odcinka charakteryzująca się wysoką stabilnością termodynamiczną, której G wynosi - 31,1 kcal/mol oraz spinka U75u-A25, której G = -21,6 kcal/mol. Jest to zgodne z wcześniejszym doniesieniem, że struktury drugorzędowe typu spinki, których G wynosi około - 30 kcal/mol i które znajdują się blisko końca 5′ mRNA, są w stanie hamować proces inicjacji translacji [42].

123 W przeciwieństwie do modelowego mRNA P0-p53-Luc z jednym kodonem inicjacyjnym AUG1, obecność regionu P0-P1 w mRNA z dwoma kodonami inicjacyjnymi w mniejszym stopniu wpływała na translację z kodonu AUG1 (Rys. 22, warianty C i D). Aczkolwiek spadek ten dotyczył jedynie mRNA, posiadającego kap na końcu 5′. Różnice w wydajności translacji inicjowanej z kodonu AUG1 wynikają najprawdopodobniej z odmiennej struktury jaką przyjmuje region P0-P1, w zależności od wariantu regionu terminalnego 5′ mRNA p53. W przeciwieństwie do wcześniejszych danych literaturowych odnośnie istnienia stabilnej struktury drugorzędowej w regionie P0-P1, z przeprowadzonych w naszym laboratorium badań wynika, że struktura taka nie powstaje [185] (Rys. 45).

Rys. 45 Model struktury drugorzędowej RNA regionu P0-Np53. Stabilność termodynamiczna poszczególnych motywów strukturalnych podana jest w nawiasach jako parametr G [185].

W regionie P0-Np53, powyżej miejsca promotorowego P1 obecne są trzy motywy typu spinki, z których jedna U49u-A72u występuje również w regionie P0-p53. Wszystkie trzy motywy odznaczają się niską trwałością termodynamiczną, a dodatkowo oddzielone są fragmentami jednoniciowymi. W przeciwieństwie do regionu P0-p53, pierwsze siedem nukleotydów regionu P0-P1 występuje w RNA P0-Np53 jako fragment

124 jednoniciowy. Wydaje się, że taka aranżacja strukturalna regionu P0-P1 nie powinna w znaczący sposób zakłócać skanowania regionu terminalnego 5′ przez kompleks rybosomalny, tak jak miało to miejsce w przypadku regionu P0-p53. Dowodem na to może być całkowity brak wpływu regionu P0-P1 na translację in vitro niekapowanych mRNA

P1-Np53-Luc i P0-Np53-Luc (Rys. 22, panel dolny, warianty C i D).

Również w przypadku kapowanych mRNA, wydajność translacji spadła jedynie 2,7-krotnie (Rys. 22, panel górny, warianty C i D). Podobny spadek efektywności translacji obserwowałam w warunkach in vivo. Obecność regionu P0-P1 spowodowała zmniejszenie efektywności translacji 2,8-krotnie w komórkach HeLa i 3,3-krotnie w komórkach MCF-7 (Rys. 31, warianty C i D). Należy zauważyć, że struktura regionu P0-P1 nie wpływa na formowanie spinek G56-C169 oraz U180-A218. Zatem, translacja z kodonu AUG1, który umiejscowiony jest w obrębie spinki G56-C169 może być inicjowana z podobną wydajnością co z mRNA P1-Np53-Luc. Chociaż wydaje się, że struktura regionu P0-P1 nie zakłóca procesu skanowania mRNA, to obniżony poziom białka powstającego z kapowanego mRNA P0-Np53-Luc, może mieć związek z obecnością spinki G8u-C41u, dla której G = -9 kcal/mol. Jej bliskie położenie względem końca 5′ mRNA może utrudniać oddziaływanie kompleksu preinicjacyjnego z kapem. Jednak dane literaturowe pokazują, że dopiero wprowadzenie spinki, której parametr G = -30kcal/mol w odległości 12 nukleotydów od kapu silnie hamowało proces translacji [7].

Region P0-P1 hamował również translację, rozpoczynającą się z kodonu AUG1 z mRNA z zachowanym intronem 2. Efekt ten mogłam obserwować jedynie w przypadku mRNA P0-Np53(int2-mut)-Luc, który posiadał zmutowany kodon STOP w intronie 2 (Rys. 23). Co ciekawe, stopień inhibicji był bardzo zbliżony do obserwowanego z mRNA P0-Np53-Luc, który nie zawierał intronu 2 i dotyczył on tylko kapowanego mRNA. Pomimo braku danych na temat struktury drugorzędowej regionu P0-P1 w mRNA p53 z intronem 2, można przypuszczać, że struktura tego regionu nie wpływa ani na proces skanowania mRNA, ani na wiązanie kompleksu preinicjacyjnego do kapu na jego końcu 5′. Wskazuje na to niezmieniony poziom białka powstającego z kodonu AUG1 z niekapowanych mRNA P1-Np53(int2-mut)-Luc i P0-Np53(int2-mut)-Luc (Rys. 23).

Brak znaczącego wpływu regionu P0-P1 na translację inicjowaną z kodonu AUG2 może wynikać z faktu, iż translacja z tego kodonu zachodzi prawdopodobnie z wykorzystaniem elementu IRES. Region P0-P1 nie zaburza formowania ważnych dla tego

125 elementu motywów strukturalnych, którymi są spinki G56-C169 i U180-A218 (Rys. 22 i 45). Z kolei, niewielki stopień inhibicji translacji z kodonu AUG2, spowodowany obecnością regionu P0-P1, może mieć związek z odległością regionu P0-P1 od kodonu AUG2. W przypadku mRNA zawierającego intron 2, synteza z kodonu AUG2 inicjowana jest prawdopodobnie na skutek wznowienia translacji, czyli według mechanizmu skaningowego. Ponieważ kompleks inicjacyjny rozpoczyna skanowanie mRNA od końca 5′, musi on pokonać region P0-P1 aby dotrzeć do kodonu AUG1, a następnie do kodonu AUG2, który znajduje się aż 367 nukleotydów od regionu P0-P1. W związku z powyższym można przypuszczać, że z powodu znacznej odległość pomiędzy regionem P0-P1 a kodonem AUG2, jego struktura drugorzędowa nie ma większego znaczenia dla rozpoczęcia ponownej syntezy z kodonu AUG2.

3.4. Regulacja translacji p53 oraz izoformy Np53 za pomocą